專利名稱：：烏藥葉總黃酮提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物制藥
技術領域：
，具體涉及一種從中藥材烏藥葉中提取總黃酮的方法及其應用。二
背景技術：
：烏藥aggreg她(Sims)Kosterm.為樟禾斗(Lauraceae)山古月椒屬(Lindera)植物，分布于江蘇、浙江、臺灣、福建、廣東等省，以浙江省天臺縣較為著名，稱天臺烏藥。其干燥塊根入藥，性溫味辛，具有順氣止痛、溫腎散寒之功效。但其葉的臨床應用及藥學研究較少，文獻記載烏藥葉可用于治療急性蜂窩組織炎、乳房炎及臀癰，與益胃止痛方配伍可治療慢性胃炎。有關烏藥葉生物活性的現代科學研究較少，其有效成分亦不清楚。尚未見關于烏藥葉總黃酮的提取工藝及其活性的報道。三
發明內容本發明需要解決的問題是1、提供一種可大量獲得烏藥葉中總黃酮的簡單易行的可用于工業化生產的總黃酮的提取方法。2、提供利用上述方法獲得的烏藥葉總黃酮提取物。3、提供該烏藥葉總黃酮提取物在制備保健食品或保健藥品中的應用以及在制備各種急慢性病毒性肝炎、化學性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎的治療藥物中應用。本發明的技術方案1、本發明所述烏藥葉總黃酮提取物為從中藥材烏葉中經粉碎、浸泡、煎煮、吸咐、洗脫、揮干得到的總黃酮浸膏，總黃酮含量大于60%。2、本發明所述烏藥葉中總黃酮的提取方法為(1)將烏藥葉藥材粉碎后，加水浸泡后，煎煮提取，濾渣取液。(2)將步驟(1)中的提取液過大孔樹脂或聚酰胺柱，用10%~95%(重量)的乙醇水溶液洗脫，洗脫液揮干溶劑得到總黃酮浸膏。在步驟(1)中，提取前將藥材粉碎成粗粉；所用的提取液水，其用量是所用藥材的10100倍(重量)，優選2540倍；藥材的浸泡時間是124小時，優選l-6小時；煎煮提取110次，優選l-5次，每次0.22小時。3在步驟(2)中，所用的吸附樹脂是聚酰胺或各種型號的大孔吸附樹脂；洗脫液濃度10%~95%(重量)的乙醇水溶液，優選50%~80%乙醇水溶液，最優選60%乙醇水溶液。3、本發明與現有技術相比，其有益效果是采用本發明的烏藥葉中總黃酮提取物的提取方法，無論在提取率、總黃酮的含量、提取工藝的簡便性、提取成本等各方面均具有明顯的優勢，適用于工業化生產。提取物可以在制備保健食品或保健藥品，以及制備各種急慢性病毒性肝炎、化學性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎的治療藥物中應用。四圖1LA-flavone在化學模擬體系中的總抗氧化能力和清除超氧陰離子自由基的能力(丁±&"=3)圖2RT-PCR分析CCU肝損傷小鼠肝組織中thioredoxin，hemeoxygenase"禾口peroxiredoxin-l的表達五具體實施例方式下面是本發明的實施例，但本發明不僅限于所述實施例。實施例1:將烏藥葉藥材粉碎成粗粉，用藥材重量40倍的水煎煮提取3次，每次0.5小時，過濾，冷卻，合并提取液。提取液過LSA-10大孔樹脂(西安藍深生產)柱，用60%乙醇洗脫，洗脫液揮去溶劑后蒸干。得烏藥葉總黃酮浸膏，含量為91%。實施例2:將烏藥葉藥材粉碎成粗粉，用藥材重量25倍的水煎煮提取2次，每次1小時，過濾，冷卻，合并提取液。提取液過聚酰胺柱，用70%乙醇洗脫，洗脫液揮去溶劑后蒸干。得烏藥葉總黃酮浸膏，含量為86%。綜上所述，本發明的烏藥葉中總黃酮的提取方法，能有效地從烏藥葉中提取得到總黃酮，提取物中總黃酮含量高于60%，而且工藝簡單可行，成本低，適用于工業化生產。如上描述了本發明所公開的烏藥葉中總黃酮的提取方法，但需理解其中包含了本領域技術人員所理解的變化和改變，這些變化和改變也包含在權利要求所限定的本發明的范圍內。實施例3:用上述實施例1的提取方法得到的烏藥葉總黃酮提取物進行藥理活性試驗，藥理結果與分析，以證明烏藥葉總黃酮提取物在制備保健食品或保健藥品，以及制備各種急慢性病毒性肝炎、化學性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎的治療藥物中應用。1、烏藥葉總黃酮提取物的藥理試驗(1)化學模擬體系中總抗氧化能力及抗超氧陰離子自由基活力單位的測定以75%乙醇為陰性對照，槲皮素(quercetin)作為陽性藥，將槲皮素及烏藥葉總黃酮分別溶于75%乙醇中，制成一定濃度梯度的樣品液，分別為槲皮素IO"0g/ml、IO-9g/ml、l(T8g/ml;烏藥葉總黃酮l(T10g/ml、5Xl(T10g/ml、l(T9g/ml、5X10-9g/ml、l(T8g/ml、5X10-8g/ml、l(T7g/ml。按照總抗氧化能力(TAOC)測定試劑盒說明書，測定反應體系A520，并計算總抗氧化能力單位(在37。C對，每分鐘每毫升樣品液使反應體系的吸光度(OD)值每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位)。按照抗超氧陰離子自由基測試盒說明書，測定反應體系中A550，并計算抗超氧陰離子自由基活力單位(在反應體系中，每升樣品液在37°C反應40分鐘所抑制的超氧陰離子自由基相當于1mg的維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個活力單位)。(2)對小鼠CCU急性肝損傷的影響取小鼠60只，隨機分成6組I組為正常對照組(空白組)，II組為肝損傷對照組，分別給予生理鹽水20ml/kg，m組為陽性對照組，給予50mg/kg槲皮素(蒸餾水溶解，超聲助溶)，IV、V和VI組分別為烏藥葉總黃酮低、中、高劑量治療組，分別給予50、100和200mg/kg烏藥葉總黃酮(蒸餾水溶解，超聲助溶)。上述各組每天灌胃l次，連續7d，每次給藥前稱重，末次給藥2h后，II-VI組按5ml/kg腹腔注射體積分數為6%的CCU橄欖油溶液1次，禁食不禁水18h，摘眼球取血后斷頸處死小鼠，離心得血清，準備檢測各指標ALT、AST、TAOC、SOD、MDA，按試劑盒說明書進行檢測。取肝右葉組織，提取總RNA，RT-PCR檢測抗氧化相關基因的表達。引物合成根據GenBank登錄的小鼠thioredoxin(抗細菌硫氧還原蛋白)，hemeoxygenase-l(血紅素加氧酶-l)，peroxiredoxin-l(過氧化物酶-l)基因以及p-actin基因的全長cDNA序列，通過PrimerPremier5.0軟件設計，并經GenBankBLAST進行同源性檢索后，由上海英駿生物技術有限公司上海合成部合成。序列如下thioredoxin,F:5，-GCACGGGAAGGTGGTCAT-3，，R:5，-GCTGGTCCTCGTCCTTGATC-3，，在409-557位點，預計擴增片段長度149bp;hemeoxygenase-1，F:5，-TCACAGATGGCGTCACTT-3，，R:5，-GAGGACCCACTGGAGGA-3，，在819-947位點，預計擴增片段長度129bp;peroxiredoxin，F:5，-ATCCTCCTTGTTTCTTGG-3'，R:5'陽TTTACCCTCTTGACTTTACT-3，，在201-362位點，預計擴增片段長度162bp;fi-actin,F:5，-CGACAGGATGCAGAAGGAGA-3，，R:5，-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3，，在1010-1164位點，預計擴增片段長度155bp。從小鼠肝右葉剪取約O.lg肝組織加入lmlTrizol試劑，提取組織總RNA，測定A260/A280比值在1.8-2.0之間，說明RNA樣品純度理想。采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，分別取cDNA模板1pi，PCR擴增thioredoxin,hemeoxygenase-1，peroxiredoxin-1，p-actin基因。Thioredoxin,hemeoxygenase-1，p-actin基因擴增設定反應程序如下94°C，5min—[94°C，30s—56°C，30s—72°C，30s](循環30次)一72。C，10min;peroxiredoxin-l基因擴增設定PCR反應程序如下94°C，5min—[94°C，30s—52°C,30s—72°C，30s](循環30次)一72°C,lOmin。PCR反應結束后取20^1反應液于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，EB染色，紫外拍攝觀察電泳條帶。2、烏藥葉總黃酮提取物的藥理結果與分析(1)化學模擬體系中烏藥葉總黃酮的總抗氧化能力和抗超氧陰離子自由基活力烏藥葉總黃酮與槲皮素進行對照研究，兩者在濃度梯度范圍內均隨濃度的升高表現出增強的抗氧化能力和抗超氧陰離子自由基能力。從圖1A中可看出，在低濃度下，隨著濃度的增加，烏藥葉總黃酮的總抗氧化能力呈微弱的增強趨勢，當烏藥葉總黃酮濃度達5X10^g/ml時，總抗氧化能力表現明顯增強。圖1B表明，烏藥葉總黃酮抗超氧陰離子自由基能力的劑量依賴性較強，隨著濃度的增加呈現出明顯的上升趨勢。(2)對CCU致化學性肝損傷小鼠血清ALT，AST的影響烏藥葉總黃酮對CCU誘導的急性肝損傷小鼠血清中ALT，AST的影響，見表l。小鼠腹腔注射CCU誘導后18h,模型對照組小鼠血清中ALT和AST水平顯著高于正常對照組。與模型對照組相比，烏藥葉總黃酮各劑量組與槲皮素陽性對照組血清中ALT和AST顯著降低，并呈現一定的劑量依賴關系。(3)對CCl4致化學性肝損傷小鼠血清TAOC，SOD，MDA的影響小鼠腹腔注射CCU誘導后18h，模型對照組小鼠血清的TAOC和SOD活性顯著低于正常對照組，MDA含量顯著高于正常對照組水平。烏藥葉總黃酮各劑量組與槲皮素陽性對照組可顯著升高血清TAOC和SOD活性，并使肝臟中MDA水平顯著降低(表2)。(4)調節抗氧化相關基因的表達由圖2可見，與正常對照組相比，CCU處理后，小鼠肝組織中的thioredoxin，hemeoxygenase-l，peroxiredoxin-l表達水平下降，烏藥葉總黃酮可增強受損肝組織中thioredoxin,hemeoxygenase-l和peroxiredoxin-l的表達，并呈現出一定的劑量相關性。(5)討論CCU是常用的化學性肝損傷誘導劑，通過細胞色素P450起作用，在肝細胞內形成活性的三氯甲基基團(CCl3+)，在有氧條件下進一步形成高度活性的三氯甲基過氧化自由基(CC1302)，誘發脂質過氧化從而損害肝細胞的細胞膜，使內源性轉氨酶釋放到細胞外，導致血清中的轉氨酶活性顯著升高，并導致細胞因子和氧自由基的釋放；同時，激活Kupffer細胞及中性粒細胞，影響肝細胞的DNA合成和分裂，引起急性肝損傷。該模型是體內檢測藥物抗氧化作用的一種常用方.法。我們的研究表明，烏藥葉總黃酮可明顯降低CCU肝損傷小鼠血清轉氨酶活性和脂質過氧化中間產物MDA的產生，并顯著增強TAOC水平和SOD活性，說明烏藥葉總黃酮能通過清除自由基，抑制脂質過氧化而在體內起到抗氧化作用。此外我們還發現，烏藥葉總黃酮在化學模擬體系內，具有較強的還原能力，能清除化學反應誘導的活性氧，說明烏藥葉總黃酮可以通過自身的還原性保護生物體內的其他還原性成分而發揮抗氧化作用。為了進一步研究烏藥葉總黃酮的抗氧化機制，我們選擇了三種抗氧化相關基因thioredoxin,hemeoxygenase-l，peroxiredoxin-1，進行mRNA表達量的考察。在細胞內的氧化還原調節系統中，thioredoxin,hemeoxygenase-l，peroxiredoxin-l7都是應對氧化壓力的抗氧化蛋白。Thioredoxin是一種普遍存在的蛋白，已被證實能在peroxiredoxin的配合下清除單線態氧，羥自由基和過氧化氫。細胞在壓力情況下將血紅素催化生成膽紅素及一氧化碳的過程中，hemeoxygenase-l是必需的。peroxiredoxin-l是巰基特異性的抗氧化劑，它與血紅素的結合后，活性被抑制。研究表明，hemeoxygenase-l和peroxiredoxin-l共存能確保對方的抗氧化活性。在我們的實驗中，烏藥葉總黃酮能顯著提高CCl4降低的thioredoxin,hemeoxygenase-l，peroxiredoxin-l的mRNA的表達，這表明增強內源性的抗氧化酶活性是烏藥葉總黃酮抗氧化作用的機制之一。綜上，烏藥葉總黃酮能通過清除自由基，抑制脂質過氧化產生抗氧化作用，從而保護CCU所致小鼠急性肝損傷，其機制與調節抗氧化相關基因的表達有關。這些結果提示，該總黃酮提取物可在制備保健食品或保健藥品，以及制備各種急慢性病毒性肝炎、化學性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎的治療藥物中應用。表1LA-flavone對CC14誘導的急性肝損傷小鼠血清中ALT和AST的影響(丁±■y,w=10)DDoseALTASTGroup(mg/kg)(U/L)(U/L)Control3.3±1.29.7±4.2CC14148.3±9.693.5±17.5CCU+Quercetin50126.3±4.4"75.2±7.0*CCU+LA-flavone50129.5±10.6**75.2±10.0:100128.0±4.0**73.6±5.8**200121.9±6.4**72.0±7.3**V<0.05CC14;*，<0.01CC14表2LA-flavone對CC14誘導的急性肝損傷小鼠血清中總抗氧化能力(TAOC)，SOD，MDA的影響±s，w=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權利要求1、一種烏藥葉總黃酮提取物，其特征是從中藥材烏葉中經粉碎、浸泡、煎煮、吸咐、洗脫、揮干得到的總黃酮浸膏，總黃酮含量大于60％。2、根據權利要求1所述的總黃酮提取物的制備方法，其特征在于該方法包含以下步驟(1)將烏藥葉藥材粉碎成粗粉，加水浸泡，所用的提取液水的用量是所用藥材的重量的10-100倍，浸泡時間是1-24小時，煎煮提取1-10次，每次0.2-2小時，過濾、冷卻、合并提取液；(2)將步驟(1)中的提取液過大孔樹脂或聚酰胺柱，用10%~95%(重量)的乙醇水溶液洗脫，洗脫液揮干去溶劑后蒸干得到烏藥葉總黃酮浸膏。3、權利要求1所述烏藥葉總黃酮提取物在制備保健食品或保健藥品中的應用。4、權利要求1所述烏藥葉總黃酮提取物在制備治療各種急慢性病毒性肝炎、化學性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎的藥物中的應用。全文摘要烏藥葉總黃酮提取物及其制備方法和應用屬于生物制藥
技術領域：
。烏藥葉總黃酮提取方法的步驟是將藥材粉碎，加水煎煮提取，濾渣取液，提取液過大孔樹脂或聚酰胺柱，乙醇水溶液洗脫，洗脫液濃縮后，得到含總黃酮的浸膏。本方法具有簡便，成本低，提取得到的總黃酮含量高，適用于工業化生產等特點。烏藥葉總黃酮提取物在體內、體外試驗中具有顯著的抗氧化和保肝活性，可以在制備保健食品或保健藥品，以及制備各種急慢性病毒性肝炎、化學性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎的治療藥物中應用。文檔編號A61K36/54GK101450107SQ20081002212公開日2009年6月10日申請日期2008年10月6日優先權日2008年10月6日發明者何國慶,曉張,強徐,利王,梅肖,婷陳,陳方標,顧莉蘊申請人:浙江天臺山烏藥生物工程有限公司