專利名稱：：一種葛根芩連藥物的有效成分的檢測方法
技術領域：
：本發明涉及中藥的質量控制方法，具體涉及葛根芩連藥物的質量控制方法。技術背景葛根芩連湯原載于東漢張仲景《傷寒論》中，由葛根、黃芩、黃連、甘草4味藥用水煎煮制成，為"解表清里之劑"，具有解表清里之功，主治身熱下利，胸脘煩熱口中作渴，喘而汗出的病證。近年來國內外醫學家通過實驗研究證明葛根芩連湯具有解熱、抗菌、抗病毒、解痙、抑制胃腸運動、抗缺氧、抗心律失常、增強機體免疫功能等藥理作用，是臨床上用于治療菌痢、腸傷寒、急慢性胃腸炎、嬰幼兒腹瀉等疾病的常用方劑。近年來國內已開發出了葛根芩連片、葛根芩連微丸、顆粒劑、散劑、微粉、葛根芩連膠囊以及葛根吝連合劑、口服液等劑型。葛根、黃芩、黃連、甘草品種較多、產地、采收季節等均會影響中藥材的質量，制備的工藝種類較多，制成的制劑難于確保其療效的一致性。因此，有必要對葛根芩連制劑有效成分的組成和含量進行嚴格的質量控制。在現階段已知葛根芩連相關藥味含有葛根素、大豆苷、大豆苷元、芒柄花苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、藥根堿、甘草苷、甘草酸、甘草次酸等多種成分，但是目前常用的葛根芩連藥物的質量控制方法大多數是分別檢測藥物中的各種成分，如《中國藥典》記載的葛根芩連片、葛根芩連微丸的質量控制方法是采用高效液相方法(HPLC)以葛根素和黃芩苷為指標分別進行含量測定，對其質量進行控制。采用高效液相色譜分別檢測葛根芩連藥物中的有效成分的組成和含量，可以準確地檢測出葛根苳連藥物中單成分的含量，但是如果每個有效成分都分別用高效液相色譜來檢測，工作量將十分大。因此，已有不少學者開始研究葛根芩連藥物多成分同時測定的方法，陳麗紅等人采用反相高效液相色譜法-二極管陣列檢測器，以甲醇-水(內含1%三乙胺、1%乙酸，用磷酸調pH至3)為流動相，對中藥復方制劑葛根芩連配方顆粒中3種主要標志性成分的含量同時分析測定，并采用相同的流動相對其指紋圖譜進行研究。實驗結果顯示，3種主要標志性成分葛根素、黃芩苷和小檗堿在含量分析測定條件下，各成分分離良好，相關系數均為0.9999，線性范圍分別為0.0421.05嗎、0.133.25嗎和0.0601.50嗎，加樣回收率在95%106%之間；在指紋圖譜研究中，以黃芩苷為參照物峰，標定了32個共有峰，分析的ll批葛根苳連配方顆粒與共有模式之間具有良好的相似性，相似度均在0.9以上(陳麗紅等.葛根芩連配方顆粒標志性成分含量分析及指紋圖譜研究。分析化學2006年第8期1109-1112)。龔湛文等人采用HPLC以乙腈一水(含0.5。/。KH2PO4)作為流動相系統可同時鑒別14種成分，并測定其中黃芩苷、葛根素2個成分的含量(龔湛文，葛根吝連抗病毒有效物質基礎研究，北京中醫藥大學碩士學位論文，2003年5月)。目前尚未有能同時檢測葛根吝連藥物中6種成分含量的檢測方法。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種能同時對葛根芩制劑6種成分定量檢測的高效液相色譜方法。本發明解決上述技術問題的技術方案是一種葛根芩連藥物的有效成分的檢測方法，該方法是利用多波長高效液相色譜法檢測葛根芩連中的各種有效成分，具體的步驟是(1)配制待檢進樣液取葛根芩連藥物用溶劑配制成含藥物0.2mg2mg/ml的待檢進樣液；配制混合對照品溶液取葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃芩苷、巴馬汀和小檗堿混合后用溶劑配制成各成分濃度均為1200jxg/ml的對照品溶液；然后將待檢進樣液和混合對照品溶液分別按以下方法進行高效液相色譜檢測按進樣量為120^1對以十八烷基硅垸鍵合硅膠為填料的色譜柱進樣，控制柱溫1040°C,接著用由A相和B相組成的流動相以0.31.5ml/ii]in的流速并按表1的程序進行梯度洗脫，同時采用檢測波長為248256nm、274285nm和344350nm的紫外光檢測洗脫液，獲得被檢藥物以及對照品的高效液相色譜圖譜；表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)所得混合對照品溶液的高效液相圖譜中左起第2鋒至第7峰依次為葛根素、大豆苷、黃苳苷、漢黃薈苷、巴馬汀和小檗堿；將被檢藥物的高效液相圖譜與對照品溶液所得的圖譜比較，與混合對照品溶液圖譜中相應成分的保留時間相同的峰即是與該成分相同物質的特征峰，并根據峰面積按外標法計算含量；上述步驟中，配制待檢進樣液和混合對照品溶液所用的溶劑是1095%乙醇或10100%甲醇，或者是與流動相相同的溶劑；溶解方式為超聲、回流提取等中藥常用提取、純化方式。所述流動相的A相是由三乙胺和0.01mol/L0.lmol/L醋酸胺溶液按以下方法制成在0.01mol/L0.lmol/L醋酸胺溶液加入溶液體積0.1%1%的三乙胺，用冰醋酸調pH2.56。所述流動相的B相是乙腈。本發明所述的葛根芩連藥物可以是葛根芩連提取物或者各種復方制劑，其原料藥為傳統葛根芩連湯的藥方葛根1524重量份、黃芩9重量份、黃連9重量份、甘草6重量份，其中所述的提取物可以是各種方法制備獲得的葛根芩連提取物。本發明所述的待檢進樣液的可以采用下述方法配制當葛根芩連藥物為固態時，精密稱取適量固體藥物，研細，然后用溶劑溶解并采用常用的中藥提取純化方法與處理，最后用溶劑定容至濃度為含固體藥物0.2mg/ml5mg/ml，過濾，即可；當葛根芩連藥物為液態時，精密量取適量液體藥物，然后用溶劑溶解并采用常用的中藥提取純化方法處理，最后用溶劑定容至濃度為含蒸干藥物0.2mg/ml5mg/ml，過濾，即可。本發明方法中，所述流動相的A相的組成最好是由0.4%的三乙胺和99.6%的0.02mol/L醋酸胺組成，其制備方法是在0.02mol/L醋酸胺溶液中加入溶液體積0.4M的三乙胺，用冰醋酸調pH44.8。本發明方法中，所述的流速最好是0.7mlTnirT'。本發明方法中，梯度洗脫時的較佳程序如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發明方法中，梯度洗脫時最佳程序如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發明方法中，紫外檢測波長最好是250nm、280nm和346nm。本發明所述的對照品圖譜中的各峰的歸屬是通過以下方法確定的分別配制葛根素、大豆苷、黃苳苷、漢黃苳苷、巴馬汀和小檗堿的標準品溶液，然后在同一色譜條件下分別制備各單獨標準品和所述混合對照品的高效液相圖譜，根據各單獨標準品圖譜中相應成分的峰的保留時間確定混合對照品圖譜中各峰的歸屬。本發明人經過多次重復試驗，發現在本發明所述流動相中混合對照品中各成分有固定的出峰順序，即左起第2峰至第7峰依次為葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃芩苷、巴馬汀和小檗堿，因此在使用本發明方法時，可根據此規律確定混合對照品圖譜中各峰的歸屬，不需要再制備各標準品的圖譜，有利于節省時間和試劑。本發明方法采用高效液相圖譜方法對葛根芩連復方藥物進行定性定量檢測，根據葛根芩連藥物的有效成分的特性，流動相選擇醋酸胺溶液、三乙胺、冰醋酸和乙腈，并按一定程序連續改變它們之間的比例進行梯度洗脫，達到精確分離復方藥物中多成分的目的，同時對洗脫成分選擇檢測波長，可進一步提高檢測的精確度。采用本發明方法，可以同時對葛根芩連方的有效成分中的葛根素、大豆苷、黃芩苷、巴馬汀、小檗堿、漢黃芩苷6種成分進行定量檢測，較全面考察葛根芩連藥物中物質群的主要有效成分組成和比例變化情況，同時還減少了分析步驟以及樣品前處理環節可能引起的成分變化和測定誤差，具有方法簡便、穩定、精密度高、重現性好、易于掌握的優點。圖1是實施例1所述的檢測方法中混合對照品的高效液相圖譜。圖2是實施例1所述的檢測方法檢測葛根芩連提取物的高效液相圖譜。具體實施方式例ll.儀器與試藥儀器:AgilentllOO高效液相色譜儀(在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)；AgilentChemStation色譜數據工作站；AB250D十萬分之一天平(美國DENVER公司)、Milli-pore-Q超純水制備儀。對照品葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃芩苷、巴馬汀和小檗堿。待檢樣品待檢樣品為葛根芩連片劑，按《中國藥典》一部2005年版葛根吝連片劑項下自制。其他試劑乙腈(色譜純)，醋酸胺、冰乙酸(分析純)。2、方法(1)混合對照品溶液的制備精密稱取葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃芩苷、巴馬汀、小檗堿對照品適量，以甲醇溶解，定容，搖勻，濾膜過濾，制得含量為20(^g/ml對照品溶液。(2)制備樣品溶液精密稱取葛根芩連片劑適量，以10%乙醇5(TC加熱超聲使其完全溶解，制得濃度為5mg/ml的樣品溶液，搖勻，微孔濾膜過濾。(3)色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，取對照樣品溶液20^1進樣，流速1.5ml/min,按表4的程序進行梯度洗脫，并采用檢測波長為248nm、274服和344nm紫外光多波長檢測，得對照品的高效液相圖譜；流動相A的制備方法是在0.04mol/L醋酸胺溶液中加入體積百分比為0.W的三乙胺，用冰醋酸調pH2.5;流動相B是乙腈。按同上方法制備待檢樣品的高效液相圖譜。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、結果(1)對照品的HPLC圖譜如圖l所示，其中l號峰為葛根素，2號峰為大豆苷，3號峰為黃零苷，4號峰為漢黃芩苷，5號峰為巴馬汀，6號峰為小檗堿。(2)待測樣品的HPLC圖譜如圖2所示，與對照品圖譜比較的保留時間和峰面積可知1號峰為葛根素的特征峰，2號峰為大豆苷的特征峰，3號峰為黃芩苷的特征峰，4號峰為漢黃吝苷的特征峰，5號峰為巴馬汀的特征峰，6號峰為小檗堿的特征峰；該藥物中葛根素的含量為2,lmg/g，大豆苷的含量為0.2mg/g，黃芩苷的含量為2.4mg/g，漢黃芩苷的含量為0.1mg/g,巴馬汀的含量為1.7mg/g，鹽酸小檗堿的含量為1.9mg/g。例21、檢測用儀器、試劑與實施例l相同；待檢樣品為葛根芩連微丸，按《中國藥典》一部2005年版葛根芩連微丸項下自制。2、方法(1)對照品溶液的制備精密稱取葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃零苷、巴馬汀、小檗堿對照品適量，以甲醇溶解，定容，搖勻，濾膜過濾，制得含量為lng/ml對照品溶液。(2)制備樣品溶液精密稱取葛根芩連微丸適量，以100%甲醇IO(TC加熱超聲使其完全溶解，制得濃度為0.2mg/ml的樣品溶液，搖勻，微孔濾膜過濾。(3)色譜柱以十八垸基硅垸鍵合硅膠為填料，進樣量為1^1，流速0.3ml/min，按表6的程序進行梯度洗脫，并采用檢測波長為256nm、285nm和350nm紫外光多波長檢測，得對照品的高效液相圖譜；流動相A的制備方法是在0.01mol/L醋酸胺溶液中加入體積百分比為1%的三乙胺，用冰醋酸調pH6;流動相B是乙腈；按同上方法制備待檢樣品的高效液相圖譜。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3、結果將待測樣品的HPLC圖譜與對照品圖譜比較，測得葛根素含量為2.3mg/g;大豆苷含量為0.3mg/g;黃吝苷含量為2.4mg/g;漢黃芩苷含量為(Umg/g;巴馬汀含量為1.5mg/g;鹽酸小檗堿含量為2.Omg/g。例31、檢測用儀器、試劑與實施例1相同；待檢樣品葛根芩連提取物按《中國藥典》一部2005年版葛根苳連微丸項下制備取葛根芩連處方中黃芩、黃連用流浸膏與浸膏劑項下的滲漉法(附錄IO)，分別用50%乙醇作溶劑，浸漬24小時后進行滲漉，收集漉液，回收乙醇，適當濃縮；葛根先煎30分鐘，再加入黃芩、黃連藥渣及炙甘草，繼續煎煮兩次，每次1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量，加入上述濃縮液，繼續濃縮至稠膏，低溫減壓干燥，粉碎成最細粉。2、方法(1)對照品溶液的制備精密稱取葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃芩苷、巴馬汀、小檗堿對照品適量，以甲醇溶解，定容，搖勻，濾膜過濾，制得葛根素8(^g/ml、大豆苷30ng/ml、黃芩苷60ng/ml、漢黃芩苷20pg/ml、小檗堿60嗎/ml、巴馬汀30嗎/ml的對照品溶液。(2)制備樣品溶液精密稱取葛根芩連提取物適量，以30%乙醇5(TC加熱超聲使其完全溶解，定容，制得濃度為lmg/ml的樣品溶液，搖勻，微孔濾膜過濾。(3)色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，進樣量為10W，流速0.7ml/min，按表6的程序進行梯度洗脫，同時用250nm、280nm和346nm的紫外多波長檢測，得對照品的高效液相圖譜；流動相A的制備方法是在0.02mol/L醋酸胺溶液中加入體積百分比為0.4%的三乙胺，用冰醋酸調pH4;流動相B是乙腈；按同上方法制備待檢樣品的高效液相圖譜。表6時間(min)流動相中A相與B相的配比A(%)Ba)080201080202070303560404555455545556035653、結果將待測樣品的HPLC圖與對照品圖譜比較，測得待測樣品中葛根素含量為2.5mg/g;大豆苷含量為0.2mg/g;黃芩苷含量為2.7mg/g;漢黃芩苷含量為0.2mg/g;巴馬汀含量為1.7mg/g;鹽酸小檗堿含量為2.3mg/g。例4(1)對照品溶液的制備精密稱取葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃芩苷、巴馬汀、小檗堿對照品適量，以流動相溶液(其中流動相A的含量為80呢，流動相B的含量為2(^，流動相A和B的組成制備參見步驟3)溶解，定容，搖勻，濾膜過濾，制得葛根素8(^g/ml、大豆苷30嗎/ml、黃芩苷60昭/ml、漢黃芩苷20嗎/ml、小檗堿60ng/ml、巴馬汀30ng/ml的對照品溶液。(2)制備待檢樣品的進樣液精密稱取葛根芩連微丸適量，溶于流動相溶液(其中流動相A的含量為80%，流動相B的含量為20%，流動相A和B的組成和制備參見步驟3)，在80°C加熱超聲使其完全溶解，制得濃度為0.2mg/ml的樣品溶液，搖勻，微孔濾膜過濾。(3)色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，進樣量為5^1，流速0.7ml/min，按表7的程序進行梯度洗脫，并采用檢測波長為250nm、280nm和346nm紫外光多波長檢測，得對照品的高效液相圖譜；流動相A的制備方法是在0.02mol/L醋酸胺溶液中加入體積百分比為0.4%的三乙胺，用冰醋酸調pH4;流動相B是乙腈；按同上方法制備待檢樣品的高效液相圖譜。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3、結果將待測樣品的HPLC圖譜與對照品圖譜比較，測得葛根素含量為2.2mg/g;大豆苷含量為0.4mg/g;黃芩苷含量為2.6rag/g;漢黃芩苷含量為0.2mg/g;巴馬汀含量為1.7mg/g;鹽酸小檗堿含量為2.2mg/g。權利要求1.一種葛根芩連藥物的有效成分的檢測方法，該方法由以下步驟組成(1)配制待檢進樣液取葛根芩連藥物用溶劑配制成含藥物0.2mg～2mg/ml的待檢進樣液；配制混合對照品溶液取葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃芩苷、巴馬汀和小檗堿混合后用溶劑配制成各成分濃度為1～200μg/ml的對照品溶液；然后將待檢進樣液和混合對照品溶液分別按以下方法進行高效液相色譜檢測按進樣量為1～20μl對以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱進樣，控制柱溫10～40℃，接著用由A相和B相組成的流動相以0.3～1.5ml/min的流速并按表1的程序進行梯度洗脫，同時采用檢測波長為248～256nm、274～285nm和344～350nm的紫外光檢測洗脫液，獲得被檢藥物以及對照品的高效液相色譜圖譜；表1<tablesid="tabl0001"num="0001">id="icf0001"file="S2008100282182C00011.gif"wi="102"he="52"top="114"left="54"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables>(2)所得混合對照品溶液的高效液相圖譜中左起第2鋒至第7峰依次為葛根素、大豆苷、黃芩苷、漢黃芩苷、巴馬汀和小檗堿；將被檢藥物的高效液相圖譜與對照品溶液所得的圖譜比較，與混合對照品溶液圖譜中相應成分的保留時間相同的峰即是與該成分相同物質的特征峰，并根據峰面積按外標法計算含量；上述步驟中，配制待檢進樣液或對照品溶液所用的溶劑是10～95％乙醇或10～100％甲醇，或者是與流動相相同的溶劑；所述流動相的A相是由三乙胺和0.01mol/L～0.1mol/L醋酸胺溶液按以下方法制成在0.01mol/L～0.1mol/L醋酸胺溶液加入溶液體積0.1％～1％的三乙胺，用冰醋酸調酸度至pH2.5～6；所述流動相的B相是乙腈。2、根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于用如表2所示程序進行梯度洗脫。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>3、根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于用如表3所示的程序梯度洗脫。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>4、如權利要求13所述的檢測方法，其特征在于所述的紫外光多波長檢測的檢測波長為250nm、280nm和346nm。5、根據權利要求13所述的檢測方法，其特征在于當葛根芩連藥物為固態時，所述的待檢進樣液的采用下述方法配制精密稱取適量固體藥物，研細，然后用溶劑溶解并采用常用的中藥提取純化方法與處理，最后用溶劑定容至濃度為含固體藥物0.2mg/ml5mgAi1，過濾，即可。6、根據權利要求13所述的檢測方法，其特征在于當葛根芩連藥物為液態時，所述的待檢進樣液的采用下述方法配制精密量取適量液體制劑，然后用溶劑溶解并采用常用的中藥提取純化方法處理，最后用溶劑定容至濃度為含蒸干藥物0.2mg/ml5mg/ml，過濾，即可。7、根據權利要求13所述的檢測方法，其特征在于所述的A相的制備方法是在0.02raol/L醋酸胺溶液中加入溶液體積0.4%的三乙胺，用冰醋酸調pH44.8。8、根據權利要求13所述的檢測方法，其特征在于所述的流速是0.7ml/min。9、根據權利要求13所述的檢測方法，其特征在于所述的葛根芩連藥物是由以下重量配比的原料藥制備得到的提取物或成品制劑葛根1524份、甘草6份、黃芩9份、黃連9份。全文摘要本發明提供了一種利用高效液相色譜檢測葛根芩連藥物有效成份的方法，該方法由以下步驟組成首先配制待檢進樣液和混合對照品溶液，再分別按下述方法進行檢測按進樣量為1～20μl對以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱進樣，控制柱溫10～40℃，接著用由A相和B相組成的流動相以0.3～1.5ml/min的流速并按規定的程序進行梯度洗脫，同時采用多波長紫外光檢測洗脫液，獲得被檢藥物以及對照品的高效液相色譜圖譜；最后將被檢藥物的高效液相圖譜與對照品溶液所得的圖譜比較，確定葛根芩連藥物中的葛根素、大豆苷、漢黃芩苷、黃芩苷、巴馬汀和小檗堿等6種有效成份及其含量。本發明方法，其中所述的A相為0.01～0.1mol/L的醋酸胺溶液，B相為乙腈。文檔編號A61K36/718GK101278991SQ200810028218公開日2008年10月8日申請日期2008年5月22日優先權日2008年5月22日發明者宋麗軍,羅佳波,譚曉梅申請人:南方醫科大學