以抗survivin核酶為基礎的治療細胞增殖亢進癥的方法

專利名稱：：以抗survivin核酶為基礎的治療細胞增殖亢進癥的方法
技術領域：
：本發明涉及用來抑制存活素(survivin)在細胞中表達的錘頭狀核酶為基礎的材料和方法，來治療包括癌癥在內的細胞增殖亢進性疾病。
背景技術：
：由于抗凋亡基因的激活和/或促凋亡基因的失活引起的凋亡障礙是惡性腫瘤細胞的主要特點之一[l]。抗凋亡因子存活素(SURVIVIN)[2]雖在正常細胞中不表達，在所有的癌癥中均過量表達，呈高度的腫瘤特異性，并通過干預凋亡，有絲分裂，血管生成和應激反應等生命過程的信號通路而對腫瘤學行為作出貢獻[3,4]。例如，SURVIVIN與caspase-9[5]相互作用或與從線粒體釋放出的Smac/DIABLO相結合[6]而抑制細胞凋亡。通過在轉錄和蛋白質穩定性水平上的調控，SURVIVIN在G2/M期量為最高，確保細胞有絲分裂過程的正常進行。除了可以作為癌癥診斷和預后的生物標志物，SURVIVIN已成為的小分子藥物，分子拮抗劑，疫苗和基因療法的抗癌治療手段的重要靶標[4,12]。過度表達SURVIVIN的不能被有絲分裂激酶p34cdc2磷酸化的Thr34Ala突變體(顯性負調)能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長[13，14]。在實驗動物模型和臨床I期試驗中抗SURVIVINmRNA的反義寡聚核苷酸可抑制SURVIVIN的表達并有抗腫瘤效應[15，16]。其他有效的方法還包括RNA干擾[17，18]或錘頭狀的核酶[19-22]。核酶是一種新的能夠特異有效地減少細胞中RNA水平的手段[23]。錘頭狀核酶是最小且研究最為深入的核酶。它由三部分組成一個約為13個序列保守的頸環結構樣的催化域和兩個能夠和目標RNA互補位于催化域的兩側的臂區，錘頭狀核酶在目標mRNA的NUH序列后切開(N為任一核苷酸，H是除G外的核甘酸)從而抑制目標蛋白的表達[24]。底物的特異性是由核酶臂區的與靶RNA的序列互補性來確定的。有較有非靶效應的siRNA[26-28]底物特異性極高的優點。
發明內容發明者已經在試管內，細胞內和活體內系統中全面地分析抗SURVIVIN的錘頭狀核酶的抑制SURVIVIN表達繼而抑制腫瘤細胞生長，促進調亡的能力。所述的核酶系統是一腺病毒載體的形式提供，可用于抗腫瘤等細胞增殖亢進有關的疾病，并且最終完成了這一發明。本發明第一個方面涉及到一種合成的或分離的核酶，所述核酶切割SEQIDNO:l所示的存活素的mRNA，其中所述核酶包含一個催化結構域和接在所述催化結構域兩側的第一和第二核酶結合臂，其中所述第一和第二核酶結合臂包含選自下組的SEQIDNO:1的區域互補的序列(1)+53-60禾B+62-69;(2)+75-82禾口+84-91;(3)+224-231和+233-240;(4)+350-357和+359-366。本發明另一方面涉及一種載體，它包含編碼上述核酶的RNA的序列。本發明另一方面提供了一種用于治療存活素相關疾病的藥物組合物，它包含上述的合成的或分離的核酶或載體。本發明另一方面提供了一種治療與存活素相關的疾病或與存活素表達升高相關的病情的方法，該方法包括給有需要的對象有效量的上述的合成的或分離的核酶、載體、或藥物組合物。本發明另一方面提供了一種促進表達存活素的組織或細胞凋亡的方法，該方法包括給予所述組織或細胞有效量的上述合成的或分離的核酶、載體或藥物組合物。本發明另一方面提供了一種提高癌細胞對化療或放療的敏感性的方法，該方法包括使所述細胞與有效量的上述合成的或分離的核酶、載體或藥物組合物接觸。本發明還有一方面涉及了上述合成的或分離的核酶或載體在制備藥物中的應用，所述藥物用于治療與存活素相關的疾病或與存活素基因表達升高相關的病情。這些合成的核酶和載體，比如以腺病毒載體為基礎的抗SURVIVIN核酶，在治療高細胞增殖癥方面有著廣泛的應用，這里所指的高細胞增殖癥包括癌癥但是并不僅僅是癌癥。此外，本發明還詳細介紹了鑒定耐用的綞頭狀核酶能否在體內切割任何給定的RNA的方法。圖1顯示了實驗流程的示意圖。圖2顯示了切割S^TiT/vVmRNA的錘頭狀核酶。圖A描述了由MF0LD程序預測的SUVIVINmRNA的二級結構。核酶Rl—R4各自在6Z^K/KZ^mRNA上的切割位點用圓圈標出；圖B標出^5ZWK/rZVmRNA序列以及被核酶切割的核苷酸；圖C展示了5Z^W^VmRNA底物和核酶(Rl到R4)，重點突出兩者的配對區和切割位點。圖3顯示了表達質粒和腺病毒載體。圖A:用于表達錘頭狀核酶(ribozyme)的質粒載體pGVaL。該載體含有兩個腺病毒小RNA基因VaI和VaII，和位于其上游的T7啟動子(T7pro,用于試管內的轉錄)或polIII(PolIIIpro,用于真核細胞中轉錄)啟動子。核酶序列可引入到位于以人為引進的頸環結構的的環區(loop)的SalI和PstI位點，使核酶分子暴露于其和VaI的融合RNA分子。圖B:表達核酶的腺病毒載體。pGVaL-l—4的各自的BamHI和NheI片段分別插入pDC載體(Microbix腺病毒載體系統)中，產生pDC-Rl—4。pDC-R134中按照標出得順序依次導入了pGVaLRl，R3和R4中的BamHl/NheI片段。圖C為基礎由CMV和T7啟動子指控由一編碼HA三肽段標記的序列引導的5ZWWvVcDNA的表達載體HAS。在HAS的6Z況KiT7^序列的下游同框接上螢火蟲的熒光素酶基因(luciferase)，而產生HASL。圖4顯示試管內試驗系統各自核酶切割6Z/AT/WRNA的特異性和效率。圖A示出所預測的從核酶R1到R4的切割位點和用于引物延伸實驗的引物的在5ZWW;V序列中的位置。圖B:用箭頭示出反映由Rl,R2，R3和R4特異性切割^5Z況K/Ki^RNA的位點的引物延伸片段在測序電泳的位置。用同一個引物的所進行的測序標準(ACGU)同時示出。(-)和(+)分別指無核酶對照和核酶實驗組。圖C，示出HASLRNA受核酶切割后再經試管內翻譯所產生的熒光素酶活性。"All":經所有四種核酶處理的，control是無核酶對照。圖D顯示用HA抗體對HASL產物的Western分析的結果。帶的強度的相對于無核酶處理對照(100%)的比值在圖下示出。圖5顯示細胞內核酶介導的5Z況KiT/yVmRNA切割效應的以及其對肝癌細胞系，S麗C-7721的生存和凋亡的作用。圖A顯示了核酶腺病毒，空載體(GVal)腺病毒侵染的和未侵染的S顧C-7721細胞(它的值被認為是1)MTT值。圖B顯示了劑量為MOI25的腺病毒侵染72小時的細胞的凋亡標記蛋白PARP(85kDa)的表達水平的Western分析結果。以PCNA蛋白的表達水平作為上載內參。前者和后者的比值在圖下示出。圖C顯示了5ZWF/K/7^mRNA和核酶表達水平的半定量性RT-PCR分析。以P-肌動蛋白((3-actin)RNA做為上載內參。前者和后者的比值在圖下示出。圖D顯示了劑量為MOI25的腺病毒侵染72小時的細胞的SURVIVIN表達水平的Western分析結果。以PCNA蛋白的表達水平作為上載內參。前者和后者的比值在圖下示出。圖E顯示了病毒感染干擾腫瘤細胞的有絲分裂。用劑量為MOI25的GVaL(空載體)和R3或R134病毒處理過的細胞的熒光免疫檢測。并用微管蛋白(tubulin)抗體染色(綠色；b，b，和b")，ACA(中心粒)抗體(紅色；a，a，和a")以及DNA染料T0T03(藍色；c，c'和c")。核酶處理導致破壞的有絲分裂細胞被觀察到多級的紡錘體，而對照組的細胞卻呈現出中期和后期等正常的有絲分裂進程。尺度為10"m。圖6顯示了細胞內核酶介導的6Z況K/KZVmRNA切割效應的以及其對肝癌細胞系，PLC(ATCCNo.CRL-8024)的生存和凋亡的作用。圖A顯示了核酶腺病毒，空載體腺病毒侵染的和未侵染的PLC細胞(它的值被認為是1)MTT值。圖B顯示了劑量為MOI25的腺病毒侵染72小時的細胞的凋亡標記蛋白PARP(85kDa)的表達水平的Western分析結果。以PCNA蛋白的表達水平作為上載內參。前者和后者的比值在圖下示出。圖C顯示了WyVmRNA和核酶表達水平的半定量性RT-PCR分析。以P-肌動蛋白RNA做為上載內參。前者和后者的比值在圖下示出。圖D顯示了劑量為MOI25的腺病毒侵染72小時的細胞的SURVIVIN表達水平的Western分析結果。以PCNA蛋白的表達水平作為上載內參。前者和后者的比值在圖下示出。圖7顯示了核酶對于S醒C-7721細胞對于Irinotecan(伊立替康)Hydrochloride的敏感性的增強的作用。圖A和B示出SMMC-7721細胞在遭受了24小時病毒感染的5,10和25和分別接受濃度為50，100和250g/ml的IH處理的MTT值。圖C禾BD顯示了以100和250g/ml的IH作為100%基準所示出的相應的GVaL，R3和R134病毒處理的MTT值的比率。圖E和F示出PARP(85kDa)和PCNA(內參)的Western分析結果。前者和后者的比值在圖下示出。圖8顯示了核酶腺病毒對SMMC-7721腫瘤細胞的裸鼠內成瘤能力的阻止效應。圖A顯示了實驗流程。圖B顯示了劑量為MOI:25的GVaL和R2感染的S醒C-7721細胞在裸鼠內的生長曲線。圖C顯示了來自R2，GVaL，和無病毒感染的S醒C-7721細胞在裸鼠內成瘤35天相對腫瘤大小。圖D顯示了GVaL/S腿C-7721;GVaL/Rl;GVaL/R2，GVaL/R3,GVaL/R4和GVaL/R134感染細胞在裸鼠內成瘤35天的腫瘤。圖E顯示了劑量為MOI:10的GVaL和R4感染的SMMC-7721細胞的生長曲線。圖F顯示了在GVaL和R4感染SMMC-7721在裸鼠內成瘤35天腫瘤的相對大小。圖G顯示了GVaL/R3，GVaL/R4，和GVaL/R134感染細胞在裸鼠內成瘤35天的腫瘤。圖H顯示了GVaL感染的SMMC-7721細胞在R3和R134實驗組的生長曲線。圖I示出GVaL感染的SMMC-7721細胞在R3和R134實驗組的相對腫瘤大小。圖J禾卩I分別顯示GvaL，R2(M0I:25)和R4(M0I:10)核酶病毒感染S醒C一7721細胞在裸鼠中成的瘤的5Z/vK/K/^和Ki67(反映細胞的DNA復制指數)蛋白的表達水平。圖9顯示了5Z/yWyVmRNA的剪切變異體(全長survivinvariantl;2B和deltaEx3)和及其能被核酶切割的潛力。具體實施例方式本發明第一方面提供了合成的或分離的核酶，該核酶能夠切割5Z/;K/W的mRNA(SEQIDNO:1)。所述核酶含一個催化結構域和在該催化結構域兩側的兩個與底物RNA序列特異性配對結合的區域(在本發明中也稱為第一核酶結合臂和第二核酶結合臂)，所述第一核酶結合臂和第二結合臂分別包含選自下組的SEQIDNO:1的區域互補的序列(1)+53-60和+62_69;(2)+75-82和+84-91;(3)+224-231和+233-240;+350-357和+359-366。例如，當第一核酶結合臂包含與SEQIDNO:1中+53-60位區域互補的序列時，第二核酶結合臂包含與SEQIDNO:1中+62-69區域互補的序列，而且兩者之間可以互換。在一個具體實施方案中，所述核酶包含核酶R1、R2、R3或R4的序歹lj(見圖2)。此處使用的術語"核酶"不僅指傳統意義的能序列特異性地切割核糖核酸序列的核糖核酸分子，還包括DNA以及核酸類似物組成，或者其與RNA構成組合分子，如DNA/RNA嵌合物。通過序列互補的方式，核酶以特異地切割RNA底物的磷酸二酯鍵的RNA分子。在切割后，水解了的底物寡核苷酸從核酶上脫落。此核酶又可以參加進一步的反應。原則上說，所有能在分子內切割磷酸二酯鍵的核酸對于本發明來說都是合適的。核酶的催化結構域可以由本領域技術人員根據常規知識來設計。此處所用的術語"包含"是指結合臂中除了與SEQIDNO:1的指定區域互補的序列外還可有其他序列，所述其它序列的長度可以為1-30bp，更佳的為1-10bp。在另一較佳的實施方案中，所述核酶結合臂與SEQIDNO:1中的指定區域完全互補。如上所述，本發明提供了能夠在序列SEQIDNO:1處切割SURVIVINmRNA的錘頭狀核酶。本發明的技術方案也可用其它類型的核酶形式來實施，其包括但不限于錘頭狀核酶，發夾狀核酶，環形核酶，環形/發夾狀核酶，套索狀核酶，發夾/套索狀核酶，RNA酶P核酶，肝炎病毒核酶，I類內含子核酶或者小型酶。對于熟練掌握這些現有技術的本領域技術人員而言，所有這些選擇均為顯而易見。錘頭狀核酶的切割位點的序列要求是任何由NUH(N可以是任意的核苷酸，H可以是除了G以外的任意核苷酸)組成的RNA序列。在SURVIVINmRNA序列(醒一OOl168;SEQIDNO:1)中有449個NUH序列可作為錘頭狀核酶切割的靶序列。本發明對SURVIVINmRNA的+61，+83，+232和+358的核苷酸作為錘頭狀核酶靶切點的價值作了系統的分析。核酶分別含有SURVIVINmRNA(歷—001168,A作為翻譯的起始密碼，ATG被定義為+1)的+53-60和+62-69，+75-82和+84-91，+224-231和+233-240，和+350-357和+359-366特異性配對的臂區(核酶Rl到R4,圖2B)。本發明中的核酶，以及編碼這些核酶的DNA以及其他適合的核酸分子，可通過化學合成來獲得。核酶亦可通過傳統的基因表達的方式從其編碼DNA序列在真核細胞啟動子(在靶細胞中表達)或原核細胞啟動子(在試管內轉錄)的控制下完成。前者為CMV等和其它在腫瘤細胞中高表達的基因的啟動子。后者由T7RNA聚合酶的啟動子和SP6RNA聚合酶的啟動子。本發明中的核酶可以是單體或是多聚體。術語"多聚體核酶"和"聚核酶"在本發明的陳述中意思相同，都是意為一個通過一系列的核酶首尾相連形成的RNA分子。在一個較佳的實施方案中，本發明提供了頭尾連接的3個錘頭狀核酶基因，其中每個核酶的兩個結合臂分別由與SEQIDN0:1的以下區域互補的序列組成(1)+53-60和+62-69;(2)+224-231和+233-240;(3)+350-357和+359-366。例如，第一個錘頭核酶的兩個結合臂分別與SEQIDNO:1的+53-60和+62-69區域互補，第二個錘頭核酶的兩個結合臂分別與SEQIDNO:1的+224-231和+233-240區域互補，第三個錘頭核酶的兩個結合臂分別與SEQIDNO:1的+350-357和+359-366區域互補。所述三個核酶的位置也可以前后互換。用核酶來治療疾病還涉及向受靶細胞引進化學合成的核酶或可以表達核酶分子的基因。這涉及到將能在細胞內產生核酶的核酶基因及其調控區的復合體的轉道。為此，本發明提供了一種包含編碼此核酶RNA的序列的載體。在此，"載體"指一種能夠表達核酶的序列裝配體。在此核酶基因由適于將其導入并在宿主細胞高效表達的載體所攜帶。其中編碼核酶基因的序列受到聚合酶III(例如來自腺病毒的tRNA或VA-1)，CMV，SV40等真核細胞類型特異性的啟動子，亦可由組織或腫瘤細胞特異性的啟動子控制。除了本發明中所使用的非增殖性腺病毒載體以外，其他載體也可能同樣有效或更好。病毒類載體還有腺病毒相關病毒，慢病毒，逆轉錄病毒和皰疹病毒載體。本發明所使用的腺病毒載體攜帶受著腺病毒VA-1基因的polIII啟動子控制的編碼針對SURVIVINmRNA的核酶的DNA序列。核酶的編碼序列處于A.Lieber'spGVaL載體的腺病毒VRLRNA基因中，在保留必要序列的前提下，大部分VA1基因區已被去除后轉移到腺病毒載體中。鑒于核酶序列插入腺病毒ValIRNA基因中，在該基因強有力的polIII啟動子驅動下，轉錄產生高水平的RNA，并有較高的穩定性，即，核酶脂A半衰期長。核酶序列置于一個人工引入ValI基因由倒轉重復序列組成的環形區中(圖3A)——核酶RNA可望充分暴露于VA1RNA部分之外，預期可增加核酶與其靶分子RNA的接觸，而達到對其有效地切割。因此，在本發明的一個實施方案中，提供了一種載體(如腺病毒表達載體)，它包含編碼本發明所述的核酶的RNA的序列，以及與該序列操作性相連的一個或多個啟動子。在更佳的技術方案中，所述核酶RNA序列位于腺病毒VALRNA基因中。在更優選的技術方案中，所述核酶RNA序列位于人工引入ValI基因的由倒轉重復序列組成的環形區中。在另一技術方案中，該載體內的一個或多個核酶基因在一個或多個啟動子的控制之下。本發明還提供了攜帶上述載體的原核細胞和真核細胞。合適的宿主細胞包括但不限于如大鼠、小鼠以及人細胞等。本發明通過系統的分析涉及到生物信息方法設計，對在試管、細胞和體內實驗系統中錘頭狀核酶對底物RNA切割的特異性和有效性的系統分析(a)通過mfold軟件預測的SURVIVINmRNA的開放區域，對其中4個符合錘頭狀核酶切點序列的順序進行了相對應的核酶的設計和表達載體的構建。(b),用RT-PCR法在mRNA水平以及免疫檢測方法(Western和免疫細胞化學)在腫瘤組織和細胞的蛋白質水平上測度SURVIVIN表達。(c),通過用T7噬菌體RNA的轉錄酶在試管內轉錄，制作核酶和底物RNA。(d)，通過引物延伸，報告基因活性測定和蛋白水平檢測來判定錘頭狀核酶切割SURVIVINmRNA的特異性和有效性。(f)，通過攜帶非增殖性腺病毒載體感染腫瘤細胞并高效表達核酶。通過RT-PCR方法對核酶的表達進行定量。(g)，SURVIVIN表達受抑所致的細胞水平上生物學效應通過MTT方法對細胞增殖和細胞凋亡狀態進行度量，通過Western分析對PARP(85KD)水平的度量來判斷細胞的調往狀態，和通過RT—PCR在RNA水平上，Western在蛋白質水平上評估核酶對SURVIVIN表達的影響。(f)，SURVIVIN表達受抑所致的活體動物水平上生物學效應通過對裸鼠體內荷瘤的生長的度量，和以免疫組化手段對腫瘤組織中的SURVIVIN蛋白和K67蛋白(反映細胞增殖的速率)在的水平的度量。上述核酶及其載體可用于治療所有與SURVIVIN表達過高相關聯疾病狀態。在本發明中需要這種治療的試驗對象包括動物，特別是哺乳動物，比如人類，家畜，非人類的靈長類，寵物，動物園動物等等，雖然在本發明中的試驗對象為人類。以用本發明來治療的病情為所有與SURVIVIN相關或與其表達過高(過表達)相關聯的疾病狀態，其可包括，但不局限于腫瘤(所有組織來源，如心血管疾病和自身免疫性疾病(例如風濕性關節炎)等。本發明也提供了在表達SURVIVIN的組織和細胞里促進凋亡的方法和一種增加癌細胞對化療和放射療法敏感性的方法。在簡要的介紹這項發明后，通過下面的這個實施例可以使這項發明更容易理解。這個例子只是為了說明，并不是為了將本發明的范圍僅局限在這個實施例。實施例材料與方法1、構建質粒和腺病毒1)抗-^7AF/r/iV核酶表達質粒載體通過MFOLD軟"f牛(http:〃www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/forml.cgi)對人^7if7^77VmRNA(GenBankNo.BC008718;SEQIDNO:l)進行分析，獲得編碼區(從ATG的A:1至TGA中的A:426，環狀)中的暴露區。繼而根據NUH核酶切割準則設計4個核酶分別在+61,+83,+232和+358處切害U(R1—4)(圖2A)。合成的寡聚核酸對(表1)5'端磷酸化后退火成雙鏈，然后克隆到pGVaL質粒載體的Sail和PstI酶切位點[25](圖3A)。構建的質粒命名為pGVaL-Rl、-R2、-R3、-R4。表1核酶的寡聚核苷酸核酶Rl(+61)R2(+83)R3(+232)序列R1U5-TCGACCTTGAATGCTGATGAGTCCGTGCGGACGAAAGAGATGCATGCA-3(SEQIDNO:2)RIB5-TGCATCTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCATTCAAGG-3(SEQIDNO:3)R2U5-TCGACAGCCCTCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAAGGGCATGCA-3(SEQIDNO:4)R2B5-TGCCCTTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGAGGGCTG-3(SEQIDNO:5)R3U5-TCGACATGCTTTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATGTTCCTATGCA-3(SEQIDNO:6)R3B5-TAGGAACATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAAAAGCATG-3(SEQIDNO:7)_R4U5-TCGACTTTCTTCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATTGTTGGATGCA-3(SEQIDNO:8)R4(+358)R4B5-TCCAACAATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGAAGAA__AG-3(SEQIDNO:9)_U:上鏈；B:下鏈；2)SL^WT77V質粒表達載體F/raV的編碼區(從ATG的A:1至TGA中的A:426)用pfu-PCR從SMMC-7721肝癌細胞的cDNA擴增獲得，引物為SurL5-CCGCTCGAGATGGGTGCCCCGACG-3(SEQIDNO:10);SurR5-GAAGATCTATCCATGGCAGCCAGCT-3(SEQIDNO:1l)(帶下劃線部分分別是BglII和Xhol的識別位點。然后通過克隆到pcDNA-HA載體的三個HA標記的下游區域，從而獲得HAS。pGL-3-basic中的HindIII(平端)和XbaI熒光酶素間的片斷克隆到HAS的相應酶切位點，從而獲得HASL(圖3C)。3)非復制型的腺病毒-核酶載體(AdMax系統構建，http:〃www.microbix.com/)(圖3.B)pGVaL和pGVaL-Rl-4的BamHI/NheI(平端)片斷通過AdMax系統插入到載體pDC的BglII/HindIII(平端)位點，從而分別得到pDC-GVaL和pDC-Rl-4。pDC-Rl中的EcoRI/SacI(平端)的片斷插入到pDC-R3的EcoRI/SmaI位點(平端)中，獲得pDC-R13。pDC-R13的EcoRI/SacI(平端)片斷插入到pDC-R4的EcoRI/SmaI位點(平端)中從而獲得pDC-R134。上述質粒分別與腺病毒骨架載體(pBHGE3AEl)共轉染293HEK細胞，通過cre-loxp介導的腺病毒重組，而產生預期的腺病毒。經鑒定(測序)后，核酶腺病毒將大規模擴增，純化，定效價后分裝并保存在-2(TC冰箱備用。2、試管內核酶切割特異性和效價的度量1)利用T7RNA聚合酶(Takara)通過試管內轉錄2ug線性化了的pGVaL/pGVaL-R4(XbaI)和HASL(HindIII酶切)而分別獲得核酶和HA-SWF/P7A^熒光素酶RNAs，用DNaseI消化后通過半定量的RT-PCR對RNAs進行定量。2)試管內核酶對HA-SWr/r/A^-熒光素酶RNAs的剪切溶于10ul的50mMTris(pH7.5)/lmMEDTA的核酶和HA-SWWT77V-熒光素酶RNAs(各1nm)經熱變性后迅速降溫到30°C。加入MgCl2至最終濃度為10mM，起始60分鐘的剪切反應。RNAs經用醋酸銨/乙醇沉淀后，進行分析。A，2/3的對照和轉錄剪切樣品通過5-32P標記利用T4多聚核苷酸激酶進行引物延伸分析(SPE1用于Rl和R2,SPE2用于R3和SPE3用于R4,表2,圖2C)。利用同樣的引物以HASL模版通過T7DNA聚合酶驅動的測序反應(Amersham，UK)來作為切口定位的參照。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>寡核苷酸末端通過T4核苷酸激酶將h^P]ATP的32P標記(5000Ci/mmo1)B，剩下的1/3產物在試管內翻譯(RabbitReticulocyteLysateSystem,Promega)而產生蛋白，所得產物的1/5通過Lumat光度計(LB9506)檢測熒光酶素，并作圖。剩下的4/5的翻譯產物通過HA抗體的Western分析，并通過SuperSignalWestPico熒光底物進行顯示，對其定量。3、腺病毒核酶抑制SURVIVIN表達的細胞學效應SMMC-7721和PLC肝癌細胞分別在含10。/。胎兒牛血清(PAA,Austria)或10%新生小牛血清(Si-ji-Qing,中國)的Dulbeccco改進的Eagle培養基(DMEM)(Invitrogen)在37°C，5。/。C02條件下，培養。病毒感染后72小時后通過MTT方法測定細胞存活率。MTT相對值通過如下公式計算絕對值氣樣品OD值-空白組ODy(對照組OD-空白組OD)x100%。病毒感染后48小時后細胞被收集做RT-PCR和Western分析。在分析細胞對Irinotecanhydrochloride細胞毒素的敏感性時[26]，SMMC-7721細胞被病毒感染24h，繼而用最終濃度分別為50，100，250ug/ml的Irinotecanhydrochloride處理48h，然后進行MTT測量。使用半定量的RT-PCR對SURVIVIN，J5—肌動蛋白和核酶的表達水平進行定量，(所用的引物見表3)。核酶病毒感染細胞和無核酶病毒感染的細胞的SURVIVINmRNA的表達程度通過SRVIVIN對P—肌動蛋白的比值)來表示的。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>N.B.，Loop1和Loop2是用來對核酶表達進行RT-PCR分析的。用15%SDS/PAGE凝膠上Western方法來分析St/iF/raV的表達OSWWraV抗體，FL-142,SantaCruz，USA)，以PCNA作為內參。85KDa的PARP(pAB[27]，Promega,USA)/PCNA的Western分析是在7.5%SDS的PAGE凝膠上進行的。SWWWiV或85Kd的PRAR對PCNA帶的相對強度的比值是判斷核酶病毒感染的細胞和對照的指標。4、免疫熒光顯微觀察SMMC-7721細胞分別被SWF/F/iV核酶(;R3或R4)和GVaL(無核酶對照)病毒感染24h后，經富爾馬林固定，2%TritonX-100處理，然后用含0.05%Tween-20和1。/oBSA(Sigma)的PBS封閉。分別用抗鼠微管蛋白抗體DM1A1:5，000;人著絲粒抗體ACA1:2，000對其作用1小時。用TPBS洗3次，以完全去除一抗。用TexasRed-偶聯的羊抗人IgG+IgM和FITC-偶聯的兔抗鼠IgG(JacksonImmunoResearch)作為二抗體進行分別對微管蛋白或著絲粒熒光顯色。將DNA用TOTO-3(Invitrogen)染色。波片用LeicaSP5公焦顯微鏡觀察。5、核酶腺病毒對在裸鼠中腫瘤細胞能力的抑制SMMC-7721細胞分別被MOI:10或25的核酶病毒感染24h/37°C后皮下注入到裸鼠((Balb/c,nu/nu)的側部(3xl0V點)。每組有三只老鼠，每只老鼠的左側注入了SMMC-7721細胞或Adeno/GVaL(不含核酶的病毒)感染的細胞(對照)，右側注入核酶腺病毒感染的細胞。監視和測檢腫瘤的生長直到4周后試驗的結束。對腫瘤秤重。腫瘤經甲醛固定，切片后用H&E染色或免疫熒光來檢測SWWW(抗體，FL-142,SantaCruz,USAl:10稀釋)和Ki67蛋白(1:10稀釋Ki67抗體，Novocastra，UK)的表達，顯色是通過EnVisionSystem(HRP，GK400315，DAKO，USA)獲得。每種蛋白的表達都通過程度(0-3)和陽性細胞的比率(0=小于5%，1=5-25%,2=25-50%，3=50-75%，4=大于75%)打分。整體的免疫熒光分數通過將程度與百分率相乘。l-4分記為+，6-8記為++，9-12記為+++。試驗結果1、設計抗-^WF/F/7V錘頭狀核酶禾ij用MFOLD軟件(http:〃www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/ma/forml.cgi)[28](圖.2A)來預測SURVIVINRNA編碼區的暴露區，繼而設計出來分別剪切SWWT77VmRNA的+61(R1),+83(R2),+232(R3)，禾tl+358(114)錘頭狀核酶(圖.2B-C)。核酶基因繼而被插入到Lieber構建的pGVaL載體中[25](圖.3A)。該載體較好地解決了高效地完成錘頭狀核酶介導的mRNA剪切三個關鍵環節表達程度，穩定性和接近靶點的可能性[25，29]。核酶基因被插入到受控于一強啟動子polIII腺病毒ValIRNA基因內部，不僅使其能夠高效轉錄，并有效地延長了其穩定性。核酶基因插入到Vall基因一個人為構建的環中部[25](pGVaL-Rxin圖.3A)，預期核酶將會有效地暴露在此融合RNA的外部。為了方便試管內合成，在ValI基因的上游引入了一個額外的T7噬菌體的啟動子(圖.3A)。為了方便在細胞和動物中分析，以便最終能應用到臨床癌癥治療，我們將pGVaL-Rx中的含核酶的BamHI和NheI片段被引入到腺病毒載體中(圖.38)。HA標記的SWWWiV-熒光蟲熒光素酶融合基因被加入到以pcDNA3.1構建的載體中，獲得HASL(圖.3C)。所以試管內評估SWP7W7VRNA剪切特異性和效率可以通過以下方法方便的進行1、引物延伸(同時檢測剪切特異性和效率)；2、western分析熒光素酶活性和蛋白含量(剪切特異性)。2、試管內檢測核酶對SURVIVINmBNA的剪切特異性和有效性等量(lnM)的核酶和試管內轉錄的底物mRNA在Mg^起始下進行剪切。剪切位點通過32P末端標記(SPE1到SPE3，圖4A)的反義寡核苷酸引物延伸被精確定位到核苷酸序列水平，同時以人工合成的序列梯度作對照。所有的四種核酶都可以進行對mRNA進行精確的剪切(如圖.48所示)。若以相關的條帶密度是各自核酶的剪切能力的反應，R2的效應較低。對經剪切的SURVIVIN—LUCRNA在試管內被翻譯成的蛋白檢驗熒光素酶的活性(圖.4C)或用Western分析的方法分析相應的蛋白量(圖.4D)。核酶的剪切導致熒光素酶的活性從對照組(無核酶)(100%)分別減少到62.65%(R1),70%(R2),40.35%(R3),57%(R4)和28.7%(所有四個)(圖.4C)。蛋白的密度從對照組(100%)分別減少到48.8%(R1),124.39%(R2),28.7%(R3),61。/。(R4)和16.5%(所有四個)(圖.4D)。所有符合MFOLD預期的核酶都有特異的剪切SWWr/7VmRNA的不同強弱的能力。R3能力最強，然后能力強弱如下R1"R4〉R2。當所有核酶都加入時剪切更為充分(圖.4C和D)。3、用核酶腺病毒感染和對內源性SURVIVINmRNA的剪切及其生物學影響用不同劑量的攜帶核酶基因(R1到R4)或R134三聯體或無核酶的載體(GVaL)的非復制性的腺病毒感染SMMC-7721肝癌細胞72小時后，用MTT試驗檢測細胞損失的生存能力(圖.5A)，用Western分析測量PARP85kDa蛋白的水平來反映細胞凋亡指數(圖.5B)，用Western分析和半定量PCR分析檢驗SWF/F/iV表達的抑制(圖.5C)。和試管內的觀察結果一致(圖.3和4)，R2是功效最低的核酶，甚至在MOI值在50的時候，MMT減少不多于20c/。。R3仍然是活性最強的。以R3做對照，R134有更強的效應MOI12.5:23.2%(R3:38.6%),和MOI25:15.2%(R3:27.77%)(圖.5A)。PARP85kDa是PARP-1的特異性剪切產物。通過對PARP，85kDa(—個檢驗活化的細胞凋零過程的傳統蛋白標記物)量的度量，在SMMC-7721對照為100%失，R2的相關值為164%,Rl:480%，R3:768%,R4:460%禾卩R134:1340%(圖.5B)。因此，由MTT試驗檢測到的細胞活性的下降的確是由于核酶抑制SWr/F/W的表達以引起細胞凋零(圖.5C和D)。半定量RT-PCR分析證明了和被核酶腺病毒感染的細胞P—肌動蛋白和核酶表達水平均無明顯差別。但SMMC-7721細胞中SWK/F/iVRNA則隨核酶不同而異91.4%,Rl:36.14%;R2:108.3%;R3:33.82%;R4:60.45%;R134:22%(圖.5C)。對^7if7P7iV蛋白的Western分析將得出同樣的結論。R134為最為有效(圖.5D)。免疫熒光研究表明SMMC-7721細胞通過R3和R134核酶病毒感染會發生的染色體分離的混亂(圖.5E:d'和d")。83±7%的被感染細胞的染色體在有絲分裂后期不能排在赤道板上，出現多極的紡錘絲(c'和c")，而GVaL感染的對照組此值為5土3。/0的(11=4)，但是由ACA標記的微管完整性和著絲粒是不改變的，暗示著核酶處理的特異性(a，禾卩a")。對PLC肝細胞瘤系(ATCCNo.CRL-8024)上做了同樣的分析，得到了同樣的結論(圖.6)。SURVIVIN的過度表達是臨床所見的腫瘤放射性和化學抗性的重要機制31,32]。用反義寡核苷酸和siRNA抑制SURVIVIN的表達使本來對化療有抗性的細胞變得敏感[33,34]。分別被MOI為5，10和25的病毒感染24小時后，繼而被IH(—個化學療法藥物的異構酶抑制劑)在3個sub-ID50劑量(50，100和250)ig/ml)中作用48小時后，進行在MTT分析和PARP85kDa的定量(圖.7)。R3只在IH為50和100嗎/ml可促進細胞死亡，但R134病毒甚至在250嗎/ml時仍然有效果(圖.7A和B)。R134較R3更為有效可更明確地在將R3病毒感染/100和250pg/mlIH處理細胞的MTT值分別為100%，輔以R134病毒感染的細胞的MTT與前者的比例來作圖的圖7C和D中示出。病毒劑量為10MOI(10個病毒對1個細胞)/100嗎/mlIH的R134和R3病毒感染細胞的MTT的比值分別為88%和100%;而病毒劑量為10/250pg/ml時,該值為77%和91.5%,而病毒劑量為25/100|ig/mlIH時,該值為78%和94%以及而病毒劑量為25/250pg/ml時72%和83%。對相關蛋白的Western分析支持這一結果。在病毒劑量為25的條件下，PARP8SkDa蛋白的相對量增加到125%(Rl)，140%(R3)和135%(R4)(圖.7E),在病毒劑量為10的條件下，該值為147。/。(R134)(圖.7E)。更為明顯的是，當細胞受到100iag/mlIH處理時。病毒劑量為5的R134(267。/。)導致比病毒劑量為25R3(226。/。)更多的的PARP85kDa蛋白(圖.7F)。4、腺病毒核酶阻止SMMC-7721細胞內的腫瘤生長SMMC-7721細胞經劑量為25的病毒感染24小時后，注入裸鼠背部皮下。為了避免個體差異的影響，每個鼠的右背注入未感染的或無核每空載體腺病毒感染的SMMC-7721細胞，而鼠的左背注入核酶腺病毒(圖.8A)。除了R2核酶病毒感染細胞以較對照為緩的速率成瘤，形成較小的瘤(與GVaL腺病毒的瘤重比為0.64:1)，其它核酶病毒感染的細胞不能成瘤(圖.8B-D)。在病毒劑量為10的情況下，R4核酶病毒感染的細胞以較對照為緩的速率成瘤，形成較小的瘤(與GVaL腺病毒的瘤重比為0.45:1)，R3和R134核酶病毒未能成瘤(圖.8E-H)。與腫瘤成瘤行為相符，R2和R4感染所成的腫瘤細胞中，SW^7F/W(圖.8J)和ki67(圖.8K)的表達遠低于GVaL腺病毒對照的水平。GVaL腺病毒感染SMMC-7721細胞的成瘤潛力可能較準確地反應了實驗鼠個體間的成瘤能力的個體差異。從而，GVaL腺病毒腫瘤生長在R134(100。/。)中比R3實驗鼠(31%)中快2倍，盡管無腫瘤生長背觀察到，仍提示R134確較R3核酶腺病毒更為有效地在裸鼠中抑制腫瘤生長(圖.8H)。討論SWK/W7V是治療癌癥的常用的耙基因[3，4]。已進入臨床一或二期實驗的小分子對抗劑包括4-甲基去甲二氫愈創木酸作為抑制依賴于SWWF/iV基因表達的Spl[35]和干擾SWP7^7iWHsp90的相互作用的17-烯丙胺-格爾德霉素[36]或Shepherdin[37，38]。通過反義寡核苷酸，干擾RNA和核酶在mRNA水平抑制表達是在嘗試中的另一手段。錘頭核酶有著比反義寡核苷酸更為有效和可通過載體形式導入的優點，又有較干擾RNA底物特異性高的優勢。本發明中，我們針對SURVIVINmRNA的四個暴露區域設計了四種錘頭核酶R1:61,R2:83,R3:232，和R4:358(圖2)。試管內實驗結果表明所有四種核酶均能不同程度地特異地切割SURVIVINmRNA(圖.4A和B)，提示用MFOLD軟件預測的底物RNA暴露區域在核酶設計過程中的價值。其它試管內實驗的結果均提示R3是最為有效的，其次為R1，R4,和效率最低的R2(圖4C和D)。慮及RNA高級結構的高度可塑性和動態性，可供各個核酶切割的針對區處于暴露狀態是有限的。與此理念相苻，四個核酶同時使用可產生較任一單核酶為強的效果(圖.4)。從而，在細胞內和活體內實驗中，攜帶核酶R1，R3和R4核酶基因的腺病毒(R134)較任一單個核酶為有效(圖5—8)。這還有細胞內SURVIVIN的RNA存有的多種剪切形式，繼而產生多種蛋白的根源。如圖9所示，常見的剪切形式有SURVIVIN(全長)，SURVIVIN-AEx3(缺少外顯子3),以及SURVIVIN-2B(保留作為隱藏外顯子的內含子2)。核酶R3是不能剪切與白血病預后兇險相關的SURVIVIN-AEx3的RNA。從而，本發明中R134腺病毒有著更好的臨床應用的前景。這個發現結合所選擇的相關實例已經清楚的展示和說明，這些內容會被在這個領域精通的人所理解。在不改變本發明的精神和所要求范圍的情況下，在形式或細節上可能會出現不同。那些在這個領域精通的人會認識到或有能力確信只用常規的實驗手段就可以找到和這里發現的具體實例描述的一樣的許多類似物。這些類似物都包括在所附權利要求的范圍中。參考文獻1.Hanahan,D.和R.A.Weinberg,thehallmarksofcancer,cell,2000.100(1):p.57-70.2.Salvesen,GS.，Duckett,C.S.，lapproteins:blockingtheroadtodeath'sdoor.NatureRev.Mol,CellBoil.,2002.3:p.401-410.3.Altieri,D,C.，Molecularcircuitsofapoptosisregualtionandcelldivisioncontrol:theSURVIVINparadigm.JCellBiochem,2004.92(4):p,656-63,4.Altieri,D.C.,Targetedtherapybydisablingcrossroadsignalingnetworks:theSURVIVINparadigm.MolCancerTher,2006,5(3):p.478-82.5.Dohi,T.，等，MitochondrialSURVIVINinhibitsapoptosisandpromotestumorigennesis.JClinInvest,2004.114(8):p.1117-27,6.Song，Z.，X.Yao，和M.Wu，DirectinteractionbetweenSURVIVINandSmac/DIABLOisessentialfortheanti-apoptoticactivityofSURVIVINduringtaxol-inducedapoptosis.JBiolChem，2003.278(25):p.23130-40,7.Schultz,I.J.,等,Bladdercancerdiagnosisandrecurrenceprognosis:comparisonofmmarkerswithemphasisonSURVIVIN.ClinChimActa,2006.368(1-2):p.20-32.8.Parker,A.S.，等HighcancerexpressionlevelsofSURVIVINproteinindependentlypredictapooroutcomeforpatientswhoundergosurgeryforclearcellrenalcellcarcinoma.Cancer，2006.107(1):p.37-45.9.Karczmarek-Borowska,B,,等,SURVIVINantiapoptoticgeneexpressionasaprognositicfactorinnon-smallcelllungcancer:insituhybridizationsyudy.FoliaHistochemCytobiol,2005.43(4):p,237-42,10.Zhang，Y.,D.Huang，和G.Yu，SURVIVIVNexprssionanditsrelationshipwithapoptosisandprognosisinnasalandparanasalsinuscarcinomas.ActaOtolaryngol,2005.125(12):p.1345-50.11.LoMuzio，L.，等，SURVVINasprognsticfactorinsquamouscellcarcinomaoftheoralcavity.cancerLett,2005.225(1):p.27-33.12.Zaffaroni，N.，M.Pennati，和M,G.Daidone,SURVIVNasatargetfornewanticancerinterventions.JCellMolMed,2005.9(2):p.360-72.13.Mesri，M,，等，CancergenetherapyusingaSURVIVNmutaneadenovirus.JClinInvest,2001.108(7):p,981-90.14.Tu，S.R，等Genetherapyforcoloncancerbyadeno-associatedviralvector-mediatedtransferofSURVIVINCys84Alamulant.Gastroenterology,2005.128(2):p.361-75.15,Li,F.,等,Pleiotropiccell-divisiondefectsandapoptosisinducedbyinterferencewithSURVIVINfunction.NatCellBiol,1999.1(8):p.461-6.16.Zangemeister-Wittke，U.,Antisensetoapoptosisinhibitorsfacilitateschemotherapyandr緒Z-/油ce"^牟a""g.AnnNYAcadSci，2003.1002:p.90-4.17.Uchida,H.,等,^dewov/nw-zwec/zfl/ec/^a"s^ro/w7A^ag"/wWS[/iK/K/iV/"c/wcedap07^a/s加ewwa^//wwoa*ce〃growAv//rav/vaMolTher，2004.10(1):p.162-71.18.Caldas，H.，等,iWWK/KU/廠ectoi/她/^mcecoctez//&"/她wfswp/m^o/"o//w膨wrg腳A/wv/vaJMedGenet,2006.43(2):p.119-28.19.Pennati，M.，等，i/Zoz>7we-wed//a&(i/w/zz力"/o"o/iSf/iK/F/iVexpre^/ow/"creoyes5po/^a"eowsapopfos/sa"(itfecreaywAe/w附on^w/cpo/^w//"/0//z歸aw/ro加^ca"cerOncogene,2004.23(2):p.386-94.20.Choi,K.S.,T.H.Lee，禾口M.H.Jung，礎oz戸e匿膨cfetoic/eav，o///e/w腿wSt/7K/KWw/W」awdzw/nM/owa/7to/o/7/o"'co/5"t/WF7K/7VAfCF-7ce/fe.CancerGeneTher，2003.10(2):p.87-95,21.Pennati,M.,等,W/Zjozy/we-wed/a&t/doww-regw/a"owo/5"L^/F/K/^exprew/owsew5/"ze5/zw附aw附e/"wo附"to鄉o/ec(3T7W/ra/"v/vaCarcinogenesis,2004.25(7):p.1129-36.22.Pennati,M.,等，iad/aye/is7/z'za"owo//w附awwe/awowace〃sZ)ynAozy/we-zwed/a/^i0/SWK/K/A^xpm^o".JInvestDermatol,2003,120(4):p.648-54.23.Sullivan,S.M.，Z)eve/o，ewfo/》/"gewe/fera^y.JInvestDermatol,1994.103(5Suppl):p.85S-89S.24.Haseloff,J.和W丄.Gerlach，S/mpfew///"ewawd/2/g/2(ys;e"ycew^on力owwc/eoseac"v/to.Nature,1988,334(6183):p.585-91.25.Lieber，a.禾口M.Strauss,Se/ec"'o"q/"^7c/eWc/eavagej//^/arge/^/a^san力02yme邵固/ow版哼MolCellBiol，1995.15(1):p.540-51.26.Furue,H.，/7b;o&o膨rase/"http:///Mo^ydeve/op/"gJ"/a"7.GanToKagakuRyoho，1993.20(1》p.42-9.27.Promega,力""-/^尸/S5Fmgwewf2000，Promga.p.http:〃www.promega.com/tbs/tb273/tb273.pdf.28.Zuker,M.禾卩A,B.Jacobson，t/s//7g/"ybr附a".owa""o^r/eiA^4化co"(ia^Wrwc,wrey.Rna,1998.4(6):p.669-79.29.Tanner,N.K.,i/Z)o^yme&,f/2ec/zarac/en^/os/npe""eyo/i^A^s.FEMSMicrobiolRev,1999,23(3):p,257-75.30.Ame,J,C.,C.Spenlehauer，andG.deMurcia，iM/PBioessays,2004.26(8):p,882-93.31.Che,X.F.,等，Overacpms^/ow0/iSt/7F/K/7///pr/zwa/^爿7Xce〃sawdso力腦ar5e/2"ecfeww-^wto/"gSL^F7「/7V邵r^/o"/"7Xce〃Blood，2006.107(12):p.4880-7.32.McLaughlin,N,，等,7feiSt/iF/K/jV-附^a^rai/omy,-加W//e"o妙eg7/oWa加way^wtoed7/7o4/"/歸ed/Z/zegrm7Zea;o一/^"o/(^匿￡7加//0^"^/《"〃她.BrainRes，2006.1071(1):p.1-9.33.Chawla-Sarkar,M，等，Z)owwgw/a//owo/5c/-2，F丄/尸orZ4ftcmc/SWK/K/A9"7^M^化mteesmy/加W/y/e/awo/Tiace〃sto々a2Zy77^/丄-,Wwcet/a/o//cw、.CellDeathDiffer,2004.11(8》p.915-23.34.Sah，N.K.，等，o/fifowwegw/a"owo/iSL^K/KZ/Vex/ms"owoaracZ/ose^"."http://)^/2w即"rfmno/c/c"/r/"om"ce〃s.IntJRadiatOncolBiolPhys，2006.66(3):p.852-9.35.Chang，C.C,，等，7^"-0膨~/woraWz>vircgw"/'are"cac/dgraw/7i"at^s/ce〃w/arapopto^/"礎/""ga"c/St/WF/K/ZV邵mys/o".ProcNatlAcadSdUSA,2004.101(36):p,13239-44.36.Sausville，E.A.，J.E.Tomaszewski，禾卩P,Ivy,(ivefo/7附e"f/7-a〃y/am/打o,/7-d^we//zox>^e/^2/"/wycz>7.CurrGancerDrugTargets,2003.3(5):p.377-83.37.Plescia，J.,等,尺ato"a/^/gw0/s/2印/^W"，aAwve/aw".c"wcerage/^.CancerCell，2005.7(5):p.457-68.38.Gyurkocza,B.，等，ac"v/zyo/Wep/zeWwa"t/腳fecw/ard/vera'/y0/"fep卯/"http://toonJNatlCancerInst,2006.98(15):p.1068-77.39.Caldas，H.，等，iSlL^F7F/A^;//cevana船gwtoeAe6a/g"ce戸"，a"o"a"dce〃Oncogene,2005.24(12):p.1994-2007.40.Wagner,M.，等，v/vo^c/re^/owiSL^K/K/ZVtmdv"n'"wfS/7^K/K/7V匿25.'/mpa"o"c//mca/owfco膨acz^emyefo/dfew&m/a.IntJCancer，2006.119(6):p.1291-7.序列表<110〉上海市腫瘤研究所<120〉以抗SURVIVIN核酶為基礎的治療細胞增殖亢進癥的方法<130>074408<160〉11〈170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>1653<212〉DNA〈213〉智人(Homosapiens)<400>1gcgggacccgtggcagccctggctgcgcctaacgagccaggatgacgaccaag犯gcagtaaagtgcgcccctggtcccatgtgggccccactgtgctccgctgctggtatgttttgatttgctagagctctcatgttgtg3gctgc鄉tgtgttUttttggc,ggttctcaaggagcaccccggaacttggcccaccatagaggattgaagaattttgc肌aggagtgccatcgagagtggctgcttagcaatgttgttttgtctacagtggctgcccgggcttagacagctttgtgaggctgtcttccttatcttgtttttttttggcggcggcccaccgcatcgcggatggccgtgtttcttcaacccttggtgcagctggctaccacttccacttaggaaagtgaaagtggccttctctctcccaggtg,Ucgcgtgggacagtcctgagtcacacctgtttttggtagggcatgggtgtctacattcagaggctggcttgcttcaaggcattcgtccggaatttttgaaag船ga肌ggccatggattgggtttattcgagatcaacaaccagaggtgtctctctcttagtgagggagcagagccttcgtgtggactttgcctcctcaatgcatgactccccgacgttagaactggcctcatccactgagctggaagggttgcgctttaactggacagaatttgaggag鄉cctctgcctggtgccattttcaaattcttctgcctgttttgggggccacagtgaatggcaggtgccgaggacagUtgtgtgtgatgccccctgcccttcttggagccccactgagctgggagccacctttctgtcagaaagagcc犯ctgcgaaggccggagctgccagccttccagatgtttcatgcagcgggttcatttttgcgtgtccctttgtgtctggactgttgaatcttttttgttgtgagag犯tgg601201802403003604204805406006607207808409009601020agacagagtccctggctcctctactgtttaacaacatggctttcttattttgtttgaattgttaattcac3gaatagc3c3朋ct3C33tt3肌actai3gC3c肌3gccattct紛gtc3ttggggaaacggggtgaacttcaggtggatgaggagacagaatagagtgataggaagcgtctggcagatactccttttgccactgctgtgtgattagacaggcccagtgagccgcggggcacatgctggccgctcctccctcagaaaaaggcagtggcctaaatcctttttaaatgacttggctcgatgctgtgggggactggctgggctgctgcaggccgtgtgtctgtcagcccaaccttcacatctgtcacgttctccacacgggggagagacgcagtccgcccaggtccccgctttctttggaggcagcagctcccgcagggctgaagtctggcgtaagatgatggatttgattcgccctcctccctgtcatagagctgcagggtggattgttacagcttcgctggaaacctctggaggtcatctcggctgttcctgagaaataaaaagcctgtcatttcaaaaaaaaaaaaaaaa犯3朋a3朋333333333333333肪33犯幼3<210〉2<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>用于^酶設計的寡核苷酸<400>2tcgaccttgaatgctgatgagtccgtgcggacgaaagagatgcatgca<210〉3<211〉40<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>用于f亥酶設計的寡核苷酸<400〉3tgcatctctttcgtcctcacggactcatcagcattcaagg<210〉4<211>48<212〉DNA10801140120012601320138014401500156016201653<213>人工序列<220><221>misc一featu:re<223〉用于^酶設計的寡核苷酸<400〉4tcgacagccctccctgatgagtccgtgaggacgaaagaagggcatgca48<210>5<211>40<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉用于f亥酶設計的寡核苷酸<400〉5tgcccttctttcgtcctcacggactcatcagggagggctg40<210〉6<211〉48<212〉DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223〉用于^酶設計的寡核苷酸<400>6tcgacatgcttttctgatgagtccgtgaggacgaaatgttcctatgca48<210〉7<211〉40<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>用于^酶設計的寡核苷酸<400〉7taggaacatttcgtcctcacggactcatcagaaaagcatg40<210〉8<211>48<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于^酶設計的寡核苷酸<400>8tcgactttcttctctgatgagtccgtgaggacgaaattgttggatgca48<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉用于^亥酶設計的寡核苷酸<400〉9tcc助caatttcgtcctcacggactcatcagagaagaaag40<210〉10<211〉24<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>10ccgctcgagatgggtgccccgacg24<210〉11<211〉25<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>11gaagatctatccatggcagccagct25<210>12<211〉30<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400>12tgaagcagaagaaacactgggccaagtctg30<210〉13<211>32<212>DNA〈213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>13gcaattttgttcttggctctttctctgtccag32<210〉14<211〉25<212〉脆<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>14atccatggcagccagctgctcgatg25<210〉15<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc_feature<223>引物<400>15tttgccactgctgtgtgatt20<210〉16<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400〉16atttctcaggaacagccgag<210〉17<211〉20〈212〉DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物〈400〉17aagtactccgtgtggatcgg<210>18<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature〈223〉引物〈400>18tcaagttgggggacaaaaag<210〉19〈211>17<212>腿<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400〉19tgtgcgacgtcgtcgac<210〉20<211>17<212>DNA<213>人工序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>權利要求1.一種合成的或分離的核酶，所述核酶切割SEQIDNO1所示的存活素的mRNA，其中所述核酶包含一個催化結構域和連接在所述催化結構域兩側的第一和第二核酶結合臂，其中所述第一和第二核酶結合臂分別包含選自下組的SEQIDNO1的區域互補的序列(1)+53-60和+62-69；(2)+75-82和+84-91；(3)+224-231和+233-240；(4)+350-357和+359-366。2.如權利要求1所述的合成的或分離的核酶，其中所述核酶選自錘頭核酶，環狀核酶，發夾狀核酶，環狀/發夾狀核酶，套索狀核酶，發夾套索狀核酶，RNAaseP或微型酶。3.如權利要求1或2所述的合成的或分離的核酶，其中所述核酶是單體或多聚體。4.如權利要求1所述的合成的或分離的核酶，其中所述核酶是三個錘頭核酶的順式三連體，所述三個錘頭核酶的所述第一和第二兩個核酶結合臂分別包含選自下組的SEQIDNO:1的區域互補的序列(1)+53-60和+62-69;(2)+224-231禾卩+233-240;(3)+350-357和+359-366。5.如權利要求1所述的合成的或分離的核酶，其中所述核酶包含核酶R1、R2、R3或R4的序列。6.—種載體，它包含編碼權利要求1-5任一項所述的核酶的RNA的序列。7.如權利要求6所述的載體，其中所述序列受控于一個或多個啟動子。8.如權利要求6所述的載體，其中所述載體是腺病毒表達載體。9.如權利要求6所述的載體，其中所述序列在腺病毒VALRNA基因中。10.如權利要求9所述的載體，其中所述載體是經過修飾的以避免同源重組。11.一種用于治療存活素相關疾病的藥物組合物，它包含權利要求1-5任一項所述的合成的或分離的核酶或權利要求6-10任一項所述的載體。12.—種治療與存活素相關的疾病或與存活素表達升高相關的病情的方法，該方法包括給有需要的對象有效量的權利要求1-5任一項所述的合成的或分離的核酶、或權利要求6-10任一項所述的載體、或權利要求11所述的藥物組合物。13.如權利要求12所述的方法，其中所述與存活素相關的疾病選自高增殖細胞疾病或癌癥。14.如權利要求12所述的方法，其中所述對象是人或動物。15.如權利要求12所述的方法，其中所述合成的或分離的核酶、所述載體或所述藥物組合物可通過選自腹膜內、口腔、鼻內、腸胃外、鞘內、心室內、靜脈內注射的途徑給予所述對象。16.如權利要求13所述的方法，其中所述癌癥選自肺癌、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、中樞神經系統癌癥、軟組織肉瘤、血液的惡性病變、兒童癌癥或橫紋肌肉瘤。17.如權利要求12所述的方法，其中所述病情是自身免疫疾病或心血管疾病。18.如權利要求17所述的方法，其中所述自身免疫疾病是風濕性關節炎。19.如權利要求17所述的方法，其中所述心血管疾病是肺動脈高血壓或動脈硬化癥。20.—種能夠引起SURVIVIN基因高表達的組織或細胞凋亡的方法，該方法包括給予所述組織或細胞有效量的權利要求1-5任一項所述的合成的或分離的核酶，權利要求6-10任一項所述的載體或權利要求11所述的藥物組合物。21.如權利要求20所述的方法，其中所述細胞是肺癌細胞、結腸癌細胞、胰腺癌細胞、乳腺癌細胞、胃癌細胞、中樞神經系統癌細胞、軟組織肉瘤細胞、血液的惡性病變細胞、兒童癌癥細胞、或橫紋肌肉瘤細胞。22.如權利要求20所述的方法，其中所述細胞是人細胞。23.如權利要求20所述的方法，其中所述細胞是干細胞、祖細胞、骨髓細胞、動脈血管內皮細胞、或子宮內膜細胞。24.—種提高癌細胞對化療或放療的敏感性的方法，該方法包括使所述細胞與有效量的權利要求1-5任一項所述的合成的或分離的核酶、權利要求6-10任一項所述的載體或權利要求11所述的藥物組合物接觸。25.如權利要求24所述的方法，其中所述細胞是肺癌細胞、結腸癌細胞、胰腺癌細胞、乳腺癌細胞、胃癌細胞、中樞神經系統癌細胞、軟組織肉瘤細胞、血液的惡性病變細胞、兒童癌癥細胞、或橫紋肌肉瘤細胞。26.如權利要求24所述的方法，其中所述細胞是人細胞。27.如權利要求24所述的方法，其中所述細胞是干細胞、祖細胞、骨髓細胞、動脈血管內皮細胞或子宮內膜細胞。28.權利要求l-5任一項所述的合成的或分離的核酶或權利要求6-10任一項所述的載體在制備藥物中的應用，所述藥物用于治療與存活素相關的疾病或與存活素基因表達升高相關的病情。全文摘要本發明涉及用來抑制SURVIVIN在細胞中表達的錘頭狀核酶為基礎的材料和方法，來治療包括癌癥在內的細胞增殖亢進性疾病。文檔編號A61P9/10GK101338306SQ20081003736公開日2009年1月7日申請日期2008年5月14日優先權日2008年5月14日發明者朱景德申請人:上海市腫瘤研究所