專利名稱：一種從雷公藤中快速大量分離高純度雷公藤甲素的方法
技術領域：
本發明涉及一種從中草藥藥材中分離活性成分的方法，具體而言，本發明涉 及一種從雷公藤中快速大量分離高純度雷公藤甲素的方法。
背景技術：
雷公藤甲素(triptolide)是從衛矛科植物雷公藤Tripterygiuffl wilfordii Hook. f.中分離出的活性最高的環氧化二萜內酯化合物，是雷公藤的主要有效 成分之一，其相關效價比雷公藤總苷高100—200倍。經藥理和臨床試驗表明，其 具有確切的免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等生物活性。目前，雷公藤多甙片 是市場上主要的以雷公藤為原料的制劑，用于類風濕性關節炎，腎病綜合癥，白 塞氏三聯癥，麻風反應，自身免疫性肝炎等，但是其毒性較大，有效劑量和中毒 劑量差別很小，藥物的安全性很難控制，其中的單一的最有效成分雷公藤甲素由 于可以很好控制劑量，也可作為結構改造的前體，其需求越來越大。雷公藤甲素 在植物中含量極低，目前主要采用常壓反復硅膠柱層析進行分離，得率低，不但 對操作人員毒性很大，而且有毒溶劑消耗也大。
發明內容
本發明旨在克服上述缺陷，提供一種從雷公藤中快速大量分離高純度雷公藤 甲素的方法。該方法簡便易行、消耗溶劑少、得率高，安全無毒、環保。 為實現上述發明目的，本發明釆用的技術方案如下 ' 一種從雷公藤中快速大量分離高純度雷公藤甲素的方法，其特征在于按如下 工藝步驟進行
A.加熱提取選取粒度為10 — 60目的雷公藤莖葉粗粉，按質量比加入5 倍量的醇溶劑，于25—65-C加熱2 — 5小時，經過濾除渣，濾液減壓回收除去醇 溶劑后，得到水懸浮液；
'所述醇溶劑選自體積百分比濃度為95%的乙醇或100%的甲醇，優選95%的乙醇。
所述雷公藤莖葉粗粉的粒度優選20目。 '所述雷公藤莖葉粗粉與醇溶劑的加熱溫度優選55'C 。
B. 溶劑萃取將步驟A所得水懸浮液，先用2倍體積比的石油醚萃取，水 相再用氯仿或者二氯甲烷萃取，各萃取3—5次，每次用量按體積比，均為水懸 浮液的3 — 5倍，石油醚層回收石油醚后棄去，合并氯仿或者二氯甲烷層萃'取液， 于45—65。C溫度下經減壓濃縮得到深黃色沉淀(密度為1.26)。
所述石油醚、氯仿或者二氯甲烷均為分析純。
C. 色譜柱層析將B步驟所得的深黃色沉淀甲醇溶解干法拌樣后進行常壓 色譜柱層析。其中，層析柱填料為中性氧化鋁或者硅膠，粒度為100—400目； 色譜柱規格據分離量而定，直徑為5—50cm。梯度洗脫所選用的洗脫劑為二氯甲 烷一甲醇或者氯仿一甲醇的混合溶劑，按體積比由高到低，依次按100 — 5: 1 的洗脫劑比例，分段收集餾分。
D. 高效制備液相分離將C步驟分段收集的餾分合并后，加入甲醇至剛好 溶解，再經高效制備液相分離得到雷公藤甲素半成品。
所述高效制備液相填料為十八垸基硅烷鍵合硅膠(C18),柱規格為 25cm+10cm或25cm+5cm,色譜條件檢測波長215咖，流動相為甲醇一水或者乙 腈一水，含量都可達90%。
新述流動相中甲醇的體積百分比濃度為20—80%。
所述流動相中乙腈的體積百分比濃度為15—45%。 .E.結晶將D步驟所得雷公藤甲素半成品，采用兩相溶劑結晶法進一步純 化得到純度達99.5%的無色針狀結晶產品。所用結晶溶劑為石油醚一乙酸乙酯、 二氯甲垸一甲醇或者二氯甲烷一乙酸乙酯組合中的任意一種或者幾種。
所述石詢醚一乙酸乙酯的體積比為5 — 1:1。 .
所述二氯甲垸一甲醇的體積比為20-10:1。
所述二氯甲烷一乙酸乙酯的體積比為20-5:1。
本發明的優點在于
1、步驟少，耗時短，得率高，操作簡便，易于工業化生產。2、 溶劑消耗少，提取、萃取、柱層析、制備液相分離等步驟中的溶劑都可 回收再利用。
3、 所用溶劑毒性較小，層析過程中所用的石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，可 替代通常柱層析采用的氯仿、甲醇等，安全無毒，環保。
4、 經濟效益好。能進行大規模生產，且工序簡便，僅包括5個步驟，'易于 控制，分離效率高。
5、 具有較高的學術價值。目前國內關于雷公藤甲素分離純化的文獻報道都 是常規柱層析，高效制備液相色譜用于雷公藤甲素的分離純化也屬首次。本發 明為雷公藤甲素的進一步開發利用提供藥理原料、理論和實踐支持。
圖1為本發明B步驟所述HPLC檢測圖譜
圖2為本發明D步驟所述制備分離在線監測圖譜
圖3為本發明D步驟所述HPLC檢測圖譜
圖4為本發明E步驟所述HPLC檢測圖譜
具體實施例方式
實施例l
,一種從雷公藤中快速大量分離高純度雷公藤甲素的方法，其特征在于按如下
工藝步驟進行
A. 加熱提取選取粒度為10目的雷公藤莖葉粗粉30kg，按l: 5的質量比
加入甲醇，在5(TC下加熱3小時，經過濾除渣，濾液減壓回收除去甲醇后，得
到水懸浮液；.
B. 溶劑萃取取步驟A所得水懸浮液IOL，先用20L石油醚萃取，水相再 用30L二氯甲烷萃取，各萃取3次。石油醚層回收石油醚后棄去，二氯甲烷萃取 液合并后5(TC濃縮，得到深黃色沉淀(密度為1.26) 150g。
C. 色譜柱層析取B步驟深黃色沉淀20g，甲醇溶解干法拌樣后進行常壓 色譜柱層析。層析柱填料為硅膠，粒度為300—400目。色譜柱規格為直徑5cm。 梯度洗脫，洗脫劑為二氯甲烷一甲醇的混合溶劑，由高到低，依次按100: 1， 50: 1， 20: l和5: 1，分段收集餾分。餾分中段雷公藤甲素純度達50% 。
D. 高效制備液相分離將C步驟分段收集的餾分合并后，加入甲醇至剛好 溶解，再經高效制備液相分離得到純度達90%的雷公藤甲素半成品。
所述制備液相填料為十八烷基硅垸鍵合硅膠(C18)，柱規格為25cm*5cm， 色譜條件檢測波長215nm，流動相為乙腈一水(乙腈的體積百分比為19%)。
E. 結晶將D步驟所得雷公藤甲素半成品，采用兩相溶劑結晶法進一步純 化得到純度達99.5%的無色針狀結晶產品lg。所用結晶溶劑為石油醚一乙酸乙 酯，其體積比為5:1。
實施例2
一種從雷公藤中快速大量分離高純度雷公藤甲素的方法，其特征在于按如下
工藝步驟進行
A. 加熱提取選取粒度為20目的雷公藤莖葉粗粉500kg,按l: 5的質量 比加入95%的乙醇，在55。C下加熱3小時，經過濾除渣，濾液減壓回收除去乙 醇后，得到水懸浮液；
B. 溶劑萃取取步驟A所得水懸浮液500L,先用1000L石油醚萃取，水相 再用1500L二氯甲烷萃取，各萃取5次。石油醚層回收石油醚后棄去，二氯甲烷 萃取液合并后55。C濃縮，得到深黃色沉淀9000g (密度為1.26)。
C. 色譜柱層析取B步驟深黃色沉淀9000g甲醇溶解干法拌樣后進行常壓 色譜柱層析。層析柱填料為硅膠，粒度為100—200目。色譜柱規格為直徑50cm。 梯度洗脫，洗脫劑為氯仿一甲醇的混合溶劑，由高到低，依次按100: 1， 50: 1， 20: l和5: 1，分段收集餾分。餾分中段雷公藤甲素純度達50%以上、前段和 后段中雷公藤甲素純度為10% — 30%。
D. 高效制備液相分離將C步驟分段收集的餾分合并后，加入甲醇至剛好
溶解，再經高效制備液相分離得到雷公藤甲素半成品。
所述制備液相填料為十八垸基硅垸鍵合硅膠(C18)，柱規格為25cm*20cm， 色譜條件檢測波長215nm,流動相為甲醇一水(甲醇的體積百分比濃度為40 %)。
E.結晶將D步驟所得雷公藤甲素半成品，采用兩相溶劑結晶法進一步純 化得到純度達99.5%的無色針狀結晶產品20g。所用結晶溶劑選用二氯甲垸一乙 酸乙酯，其體積比為4:1。
權利要求
1.一種從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，其特征在于按如下工藝步驟進行A. 加熱提取選取粒度為10—60目的雷公藤莖葉粉，按質量比加入5倍量的醇溶劑，于25—65℃加熱2—5小時，經過濾除渣，濾液減壓回收除去醇溶劑后，得到水懸浮液；B. 溶劑萃取將步驟A所得水懸浮液，先用2倍體積比的石油醚萃取，水相再用氯仿或者二氯甲烷萃取，各萃取3—5次，每次用量按體積比，均為水懸浮液的3—5倍，石油醚層回收石油醚后棄去，合并氯仿或者二氯甲烷層萃取液，于45—65℃溫度下經減壓濃縮得到密度為1.26深黃色沉淀；C. 色譜柱層析將B步驟所得的深黃色沉淀甲醇溶解干法拌樣后進行常壓色譜柱層析，其中，層析柱填料為氧化鋁或者硅膠，粒度為100—400目，色譜直徑為5—50cm；梯度洗脫所選用的洗脫劑為二氯甲烷—甲醇或者氯仿—甲醇的混合溶劑，按體積比由高到低，依次按100—51的洗脫劑比例，分段收集餾分；D. 高效制備液相分離將C步驟分段收集的餾分合并后，加入甲醇至剛好溶解，再經高效制備液相分離得到雷公藤甲素半成品；E. 結晶將D步驟所得雷公藤甲素半成品，采用兩相溶劑結晶法進一步純化得到純度達99.5％的無色針狀結晶產品，所用結晶溶劑為石油醚—乙酸乙酯、二氯甲烷—甲醇或者二氯甲烷—乙酸乙酯組合中的任意一種或者幾種。
2、 根據權利要求l所述的從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，其特 征在于步驟A所述醇溶劑選自體積百分比濃度為95%的乙醇或100%的甲醇。
3、 根據權利要求1所述的從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，其特 征在于步驟A所述雷公藤莖葉粉與醇溶劑的加熱溫度為55°C 。
4、根據權利要求1所述的從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，其特 征在于步驟D所述高效制備液相填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，柱規格為 25cm*10cm或25cm*5cm，色譜條件檢測波長215nm，流動相為甲醇一水或者乙 腈一水。
5、根據權利要求4所述的從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，其特 征在于所述流動相中甲醇的體積百分比濃度為20—80%。
6、 根據權利要求4所述的從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，'其特 征在于所述流動相中乙腈的體積百分比濃度為15—45%。
7、 根據權利要求l所述的從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，其特 征在于步驟E所述石油醚一乙酸乙酯的體積比為5 — 1:1。
8、 根據權利要求l所述的從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，其特 征在于步驟E所述二氯甲垸一甲醇的體積比為20-10:1。
9、根據權利要求1所述的從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，其特 征在于步驟E所述二氯甲烷一 乙酸乙酯的體積比為20-5:1 。
全文摘要
本發明公開了一種從雷公藤中分離純化雷公藤甲素單體的工藝方法，它按如下工藝步驟進行A.加熱提取乙醇或甲醇溫浸后除渣；B.溶劑萃取采用有機溶劑萃取提取濃縮液以富集產品；C.色譜柱層析用中性氧化鋁或者硅膠作為填料，二氯甲烷-甲醇或者氯仿-甲醇梯度洗脫，分段收集餾分；D.高效制備液相分離；E.結晶采用兩相溶劑結晶法，將分段收集的餾分用石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇或者二氯甲烷-乙酸乙酯結晶，得到純度99.5％以上的雷公藤甲素無色針狀結晶產品。本發明方法簡易快速，溶劑消耗少，經濟環保，且得率高，可以一次性制備得到較大量的產品，具有較高的經濟價值和學術價值。
文檔編號A61P13/12GK101367862SQ20081004616
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月25日 優先權日2008年9月25日
發明者柯 夏, 黎 張, 兵 楊, 董維臻 申請人:成都普思生物科技有限公司