專利名稱：從猴頭菌絲體發酵產物提取的猴頭菌絲體寡糖及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及從猴頭菌絲體發酵產物提取的猴頭菌絲體寡糖及其 應用，尤其涉及在制藥領域中的應用；IPC分類號為A61K 36/06。
背景技術：
本發明所稱的猴頭菌為齒菌科真菌小刺猴頭菌(Hericium caput-medusae)，其菌絲體的發酵產物多年來作為原料藥應用于臨 床。關于小剌猴頭菌的發酵，可以采用本領域常用的深層培養通氣攪 拌條件；例如參見《微生物通報》1985年第12巻第5期第198至200頁。
我國市場上以猴頭菌絲體培養浸膏為原料制成的藥品有胃樂新 沖劑。盡管該制劑對胃、十二指腸潰瘍、慢性胃炎等顯示出良好的療 效，但對菌絲體中有效成分的提取、分離、純化方法及活性成分的基 本化學組成等問題仍未得到解決，長期以來一直制約著猴頭菌絲體的 開發和利用。
通過對猴頭菌絲體中有效成分的提取、分離、純化得到了猴頭菌 絲體寡糖，其基本化學結構為-
HPGPC分析結果表明，該化合物的分子量分布在O. 36-1. 5X 103， 說明該化合物主要為寡糖類成分；理化性質結果表明，糖的含量占 90%左右；組成糖分析結果表明，該化合物主要由Man， Glc兩種單
糖組成，摩爾比為l: 5;液一質結果表明，該化合物主要由2—7個
單糖連接的寡糖構成，其中雙糖和三糖各占20%左右，其它為四糖、
五糖、六糖、和七糖，還有少量的單糖。雙糖、四糖、五糖均有兩種
構型，六糖有三種構型，三糖和七糖有一種構型。采用HPLC法，氨 基柱純化分離得到的雙塘、三糖，利用麗R， LC-MS，GG-MS，GC及甲基 化分析，推測雙糖是以a —Glcl—4a-Glc和a-Glcl—6Man(或a-Manl —6Glc)兩種形式存在，三糖是以a—Glcl—4a—Glcl—6a-Glc形 式存在。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供猴頭菌絲體寡糖及其用途，尤其 在制藥中的應用。
實際上本發明提供猴頭菌絲體寡糖作為制備治療胃部疾病的藥 中的應用。
為了更好地理解本發明，下面給出猴頭菌絲體寡糖的提取方法， 以及藥理試驗來說明其在制藥領域中的用途。 方法l
將猴頭菌絲體發酵浸膏10kg，加水1-2倍稀釋，攪拌，離心， 離心液加乙醇至醇濃度為80%，離心，收集沉淀，加蒸餾水配成水 溶液，對透析膜分子量范圍8仟-1萬水透析，收集透析外液，濃縮 至浸膏lkg，冷凍干燥，得猴頭菌絲體寡糖800g。
方法2
取猴頭菌絲發酵浸膏10kg，加水1-2倍稀釋，攪拌，離心，離
心液加乙醇至醇濃度為80%，離心，收集沉淀lkg，加蒸餾水配成水 溶液，通過DEAE-S印hadexA50離子交換樹脂柱，分別用蒸餾水洗脫， 收集洗脫液，濃縮至浸膏，冷凍干燥，得猴頭菌絲體寡糖780g。 方法3
取猴頭菌絲發酵浸膏10kg，加水1-2倍稀釋，攪拌，離心，離 心液加乙醇至醇濃度為80%，離心，收集沉淀1 kg，加蒸餾水配成 水溶液。通過分子量范圍在8仟一1萬的中空纖維超濾，得到猴頭菌 絲體寡糖800g。
經過藥理學實驗篩選，上述化合物具有治療急、慢性胃炎，胃潰 瘍，慢性萎縮性胃炎效果。
按藥劑學方法，猴頭菌絲體寡糖能夠制備多種臨床藥物制劑作為 治療急、慢性胃炎，胃潰瘍，慢性萎縮性胃炎的藥物，所說的藥劑是 任何一種藥劑學上所說的劑型，特別是作為各種口服劑型。
本發明的藥物含有治療有效量的上述化合物為活性成分，以及含 有一種或多種藥學上可以接受的載體。
上文的載體是指藥學領域常規的藥物載休，包括稀釋劑、賦形刑、 填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附 載體。
本發明藥物可以通過口服、直腸、靜脈、肌肉注射或胃腸外給藥 方式施用于這種治療的患者。按照藥學領域的常規生產方法制備各種 劑型如片劑、顆粒劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑和注射劑。 也可使其活性成分或組合物與多種載體或藥物混合，制成所需劑型。 下述的藥理實驗證實了猴頭菌絲體寡糖的藥物制劑具有治療急、 慢性胃炎，胃潰瘍，慢性萎縮性胃炎的藥理活性。 一、猴頭菌提取物對乙酸所致損傷型胃潰瘍的影響
摘要本實驗觀察猴頭菌寡糖對乙酸所致損傷型胃潰瘍大鼠的影
響。分別連續灌胃給予乙酸所致損傷型胃漬瘍大鼠4S0mg / kg猴頭菌 寡糖14天，對乙酸所致損傷型胃潰瘍均有顯著的抑制作用。
藥物陽性藥為胃樂新，由白求恩醫大藥廠生產，批號041205。 動物220-260g雄性大鼠。購自中國人民解放軍208醫院動物室。
方法取大鼠禁食不禁水48小時，乙醚麻醉，仰位固定，腹部 去毛，碘酒、酒精消毒，劍突下正中開2.5cm左右的切口，用彎止血 鉗在右肝臟下方將十二指腸輕輕勾出，將胃部輕輕拉出腹外，在胃的 腹側面胃體部與幽門竇交界處，用0.25ml注射器刺入大鼠胃漿膜下 0.4-0.5mm，注入10%醋酸溶液0. 05ml，將胃輕輕送回，縫合腹壁肌 層及皮膚，消毒后常規詞養，于術次日起，分組，連續給藥14天， 末次給藥2h，斷頭，結扎幽門和賁門，胃浸于1%甲醛液中，固定 10分鐘，沿胃大彎剪開，外翻洗滌，在注射醋酸溶液相應部位的粘 膜面觀察潰瘍形成情況，以潰瘍最長徑和最短徑的均值作為潰瘍直 徑，計算潰瘍指數。見表l。
表1.猴頭菌提取物對乙酸所致損傷型胃潰瘍的影響
組別 劑量mg/kg 潰瘍直徑mm 潰瘍愈合百分率％
模型組 5. 13±1. 13
陽性組 480 3.63士1.39※ 29.24
猴頭菌寡糖 480 3.46 ±0.89※※※ 32.55
猴頭菌寡糖 240 4. 04 ±1. 09※ 21.25
注n=8，義士SD。※P〈0.05，※※※P〈0.001。
小結480mg/kg猴頭菌寡糖14天，對乙酸所致損傷型胃潰瘍 均有顯著的抑制作用。480mg/kg對乙酸所致損傷型胃潰瘍的抑制作 用尤其顯著。
二，猴頭菌提取物對應激性胃潰瘍的影響
摘要采用應激性胃潰瘍模型比較猴頭菌提取物與胃樂新的抗潰 瘍作用。
分別連續灌胃給予大鼠4S0mg / kg猴頭菌寡糖15天，結果猴頭菌寡 糖具有明顯的抗潰瘍作用。
動物Wister大鼠32只，購自白求恩醫科大學動物室。 藥物陽性藥為胃樂新，由白求恩醫大藥廠生產，批號041205。 方法取大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，每天灌胃給予 480mg/kg猴頭菌寡糖及胃樂新各一次，對照組給予常水，連續給予 15天，第14天給藥后將大鼠饑餓32h，次日下午16時用乙醚麻醉， 將大鼠四肢用蠅綁在鐵籠上，同時將綁完的大鼠頭朝下，垂直放置 18h，將動物拉頸處死。將其胃的賁門及幽門結扎，取全胃，并向內 注入lQ/。福爾馬林固定5min后，沿胃大彎剪開，平展于玻璃扳上，觀 察判斷等級。
結果對照組為3. 87±0.35， 480mg/kg猴頭菌寡糖為2.38士 1. 51 (P〈0. 05)，胃樂新為2. 13±1. 13(P<0. 001)。 由此可見猴頭菌寡糖有非常明顯的抗潰瘍作用。
三、猴頭菌提取物對大鼠慢性萎縮性胃炎實驗研究
摘要采用主動免疫加灌服膽汁及熱水的綜合方法觀察猴頭菌寡
糖對大鼠慢性萎縮性胃炎CAG的治療作用，結果Xmg/kgHl、 Xmg /kgL2可明顯改善CAG大鼠胃粘膜的變薄，并使胃黏膜固有腺體增 多，有良好的治療CAG的作用。 1.實驗材料及方法
1. l動物Wistar雄性大鼠，購自長春高新醫學動物實驗研究中心， 合格10—5112，體重220—260g。
1. 2藥物陽性藥為胃樂新，由白求恩醫大藥廠生產，批號041205。 1. 3模型的制備-
1. 3 . 1佐劑抗原的制備取160—180gWistar大鼠，將其饑餓 24h后處死取胃黏膜，每只鼠胃黏膜加生理鹽水3ml，利用組織勻漿機 將其打勻，然后加入等體積液體石臘制備成均勻的乳劑，備用。 1.3. 2模型的制備取220—260g大鼠90只，在每只大鼠2點背 部皮下注射佐劑抗原2ml，每點lml， 2周后重復1次，再1周后又 重復1次,共免疫3次；自免疫起每隔3天給人鼠灌服豬膽汁2ml / 只(膽汁甘油=1:1);同時除灌服豬膽汁當天外，每天連續灌服35 天55"C熱水。
1.3. 3動物處理首次免疫35天處死10只大鼠取胃作組織形態學 檢測，可見胃黏膜腺體變薄，胃腺體減少，個別胃可見有潰瘍、出血、 粘膜下大量細胞浸潤。
1. 3. 4分組及給藥將余下大鼠隨機分為六組，即模型對照組，每天給予常水4ml /只，480mg / kg胃樂新，480mg / kg猴頭菌寡糖， 每天給藥1次，連續給藥30天，并于每周稱重l次。
1. 3. 5對胃粘膜病理組織中變化的影響動物自胃竇沿小彎至賁 門取材，包埋切片。采用？檢驗。
2. 結果-
2. 1對胃黏膜組織形態學的影響
從表2可見，模型組胃黏膜變薄、腺體減少等現象的陰性率還是 明顯高于給藥組，并伴有大量炎細胞浸潤從肌層增厚而猴頭菌寡糖對 上述現象均有明顯的抑制作用而且未見肌層增厚現象。 2. 2對慢性萎縮性胃炎大鼠體重變化的影響見表3。表3表明， 對慢性萎縮性胃炎大鼠體重的變化無影響。
小結上述結果表明，猴頭菌寡糖對大鼠慢性萎縮性胃炎有一定
的治療作用。
表2. 對慢性萎縮性胃炎胃粘膜組織形態學的影響
組別劑量動物數胃粘膜變薄胃腺的減少血管充血或出血
mg / kg陰性陰性陰性
模型對照組109107
陽性藥■122承54
猴頭菌寡糖480102氺2氺4
猴頭菌寡糖240124承56
注同表l。
表3. 對慢性萎縮性胃炎大鼠體重變化的影響
組別劑量;f 體重變化
mg/kg只 0周 l周 2周 3周 4周
模型對照 ^~256.6~~± 262.8"""± 281.0~± 280.4~± 283.7~~^ 組 18.6 17.9 25.5 27.0 27.3
陽性藥 480 12 猴頭菌寡
480 12
猴頭菌寡 糖
240 12
257.9 ± 264.4 ± 274.5
17.522.5 23.2
254. 1 ± 271.6 ± 278.4
19. 125. 0 29. 3
262.8 ± 280.2 ± 291.8
17. 726. 3 27. 3
± 275.3 ± 280.9 ±
23. 4 24. 0
± 275.3 ± 283.7 ±
32.2 31.7
± 281.6 土 290.6 ±
24. 9 29. 5
從以上結果可以得出本發明的優點在于有效部位明確,結構清 楚,服用量少，對于治療急、慢性胃炎，胃潰瘍，慢性萎縮性胃炎有 顯著的療效。并優于陽性對照藥。
具體實施例方式
實施例1
將猴頭菌絲體發酵浸膏10kg，加水1-2倍稀釋，攪拌，離心， 離心液加乙醇至醇濃度為80%，離心，收集沉淀，加蒸餾水配成水 溶液，對透析膜分子量范圍8仟-1萬水透析，收集透析外液，濃縮
至浸膏lkg，冷凍干燥，得粉狀猴頭菌寡糖800g，裝入藥瓶中密封，
消毒制成產品。
實施例2
取猴頭菌絲發酵浸膏10kg，加水1-2倍稀釋，攪拌，離心，離 心液加乙醇至醇濃度為80%，離心，收集沉淀lkg，加蒸餾水配成水 溶液，通過DEAE-S印hadexA50離子交換樹脂柱，分別用蒸餾水洗脫， 收集洗脫液，濃縮至浸膏，冷凍干燥，得猴頭菌寡糖780g，裝入藥 瓶中密封，消毒制成產品。
實施例3
取猴頭菌絲發酵浸膏10kg，加水1-2倍稀釋，攪拌，離心，離 心液加乙醇至醇濃度為80%，離心，收集沉淀1 kg，加蒸餾水配成
水溶液。通過分子量范圍在8仟一l萬的中空纖維超濾，得猴頭菌寡
糖800g，裝入藥瓶中密封，消毒制成產品。
權利要求
1、從小刺猴頭菌(Hericium caput-medusae)菌絲體的發酵浸膏提取的猴頭菌絲體寡糖。
2、 權利要求1所述猴頭菌絲體寡糖的應用，用于制備治療胃部 疾病的藥物。
3、 根據權利要求2的應用，所述胃部疾病是胃炎疾病。
4、 根據權利要求2的應用，所述胃部疾病是胃潰瘍疾病。
5、 根據權利要求3的應用，所述胃炎疾病是慢性萎縮性胃炎疾病。
6、 一種猴頭菌絲體寡糖的提取方法，將猴頭菌絲體發酵浸膏 10kg，加水1-2倍稀釋，攪拌，離心，離心液加乙醇至醇濃度為80 。％，離心，收集沉淀，加蒸餾水配成水溶液，對透析膜分子量范圍8 仟-1萬水透析，收集透析外液，濃縮至浸膏lkg，冷凍干燥，得猴頭 菌絲體寡糖800g。
7、 一種猴頭菌絲體寡糖的提取方法，取猴頭菌絲發酵浸膏10kg， 加水l-2倍稀釋，攪拌，離心，離心液加乙醇至醇濃度為80%，離 心，收集沉淀lkg，加蒸餾水配成水溶液，通過DEAE-S印hadexA50 離子交換樹脂柱，分別用蒸餾水洗脫，收集洗脫液，濃縮至浸膏，冷 凍干燥，得猴頭菌絲體寡糖。
8、 一種猴頭菌絲體寡糖的提取方法，取猴頭菌絲發酵浸膏10kg， 加水l-2倍稀釋，攪拌，離心，離心液加乙醇至醇濃度為80。％，離心， 收集沉淀1 kg，加蒸餾水配成水溶液。通過分子量范圍在8仟一l萬的中空纖維超濾，得到猴頭菌絲體寡糖(
全文摘要
從猴頭菌絲體發酵產物提取的猴頭菌絲體寡糖及其應用，涉及從猴頭菌絲體發酵產物提取的猴頭菌絲體寡糖及其應用，將猴頭菌絲體發酵浸膏加水稀釋，攪拌，離心，離心液加乙醇至醇，離心，收集沉淀，加蒸餾水配成水溶液，對透析膜透析，收集透析外液，濃縮至浸膏，得猴頭菌絲體寡糖。其有效部位明確，結構清楚，服用量少，對于治療急、慢性胃炎，胃潰瘍，慢性萎縮性胃炎有顯著的療效。
文檔編號C07H1/00GK101375867SQ200810051238
公開日2009年3月4日 申請日期2008年9月28日 優先權日2008年9月28日
發明者屹 馮, 劉淑芳, 孫立群, 李鳳才, 李敬軒 申請人:白求恩醫科大學制藥廠