含有順序發酵或同時發酵的提取物的組合物的制作方法

含有順序發酵或同時發酵的提取物的組合物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種含有來自同時發酵或順序發酵的發酵提取物的局部用組合物。當局部涂敷皮膚時，本發明的組合物可有效刺激皮膚細胞中的透明質酸、CD44和半胱天冬酶14蛋白質的產生。
【專利說明】含有順序發酵或同時發酵的提取物的組合物
[0001]【技術領域】
[0002]本發明涉及適合用于個人護理和治療應用的組合物，更具體地，本發明涉及含有雙重發酵提取物的這種組合物。
[0003]【背景技術】
[0004]通過諸如酵母菌(Saccharomyces sp.)或乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)之類的單一微生物發酵得到的提取物是已知的并已經被用于局部用組合物。最近，美國專利申請公開第2010/0021532號表明來源于微生物與植物的多酚的發酵已經作為產生對皮膚具有有益效果的代謝物的方法公開。
[0005]已在食品工業范圍內，特別是在釀酒工藝中探索了多種發酵劑培養物微生物的使用和共培養的多種微生物的構思(參見例如，Toro M.E等，World Journal ofMicrobiology and B iotechnologyl8:347 - 354.(2002)和 Herrero M.等，Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology22:48 - 51 (1999))。據建議，多種發酵劑酒的味道和生化概貌可優于單一培養接種的酒的味道和生化概貌，由于在多種發酵劑微生物釀酒過程中微生物的相互作用對增強的味道起關鍵的影響作用，Ciani M.等，International Journal of Food Microbiologyl08:239 - 245(2006) ? 然而，不建議將多種發酵劑培養物用于個人護理產品。
[0006]最近，酵母菌及其衍生物的使用在美容應用中越來越受歡迎。這由如下事實引起:作為真核生物的酵母菌具有與人體細胞相似的細胞生物學過程，并且已知其在應激下引發有益蛋白的產生。同時還有使用酵母菌衍生物及其在局部皮膚施用中提高攝氧量的益處的大量歷史證據。例如，美國專利第4，540，571號公開了酵母菌衍生物促進皮膚呼吸作用。還報道了酵母細胞衍生物刺激皮膚細胞中的膠原和彈性蛋白的生成。
[0007]最近的研究表明酵母細胞提取物能夠產生刺激傷口愈合的‘生長因子’。例如，美國專利第7，217，417號公開了將酵母細胞衍生物加入用于傷口愈合的基于凝膠的制劑的方法。
[0008]本領域還沒有報道同時使用發酵提取物或按順序使用發酵提取物獲得新的活性物質。
[0009]
【發明內容】

[0010]一方面，本發明提供含有從至少兩種微生物的同時發酵或順序發酵過程中取出的發酵提取物的局部用組合物。
[0011]另一方面，本發明提供一種含有從至少兩種微生物的同時發酵或順序發酵過程中取出的發酵提取物、足以對所述發酵提取物起滅菌或生物靜態作用的防腐劑以及皮膚病學上可接受的載體的局部用組合物。
[0012]本發明提供的一種示例性局部用組合物含有第一微生物和第二微生物的雙重發酵提取物，所述第一微生物為謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii),所述第二微生物為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。
[0013]本發明提供的另一示例性局部用組合物含有第一微生物和第二微生物的雙重發酵提取物，所述第一微生物為微藻，所述第二微生物為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。
[0014]本發明還提供一種含有以下加工步驟的制備發酵提取物的方法:使用通過化學方法定義的第一營養培養基使第一微生物生長至對數生長后期以生成含有第一微生物和由第一微生物表達的次級代謝產物的第二營養培養基；使第二營養培養基與第二微生物接觸；使第一微生物和第二微生物在第二營養培養基中同時發酵以生成含有水溶性部分和水不溶性部分的發酵混合物；從發酵混合物中分離水不溶性部分，由此隔離水溶性部分并生成雙重發酵提取物。
[0015]本發明的另一方面為通過對需要用含有雙重發酵提取物的局部用組合物治療的使用者的皮膚施用局部用組合物來刺激皮膚細胞中透明質酸和CD44的產生的方法。
[0016]本發明的另一方面為通過對需要用含有雙重發酵提取物的局部用組合物治療的使用者的皮膚施用局部用組合物來刺激皮膚細胞中透明質酸和半胱天冬酶-14的產生的方法。
[0017]在閱讀本發明的具體描述時，本發明的上述這些方面和其它方面將會是顯而易見的。
[0018]【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是用于比較的乳桿菌科發酵提取物的GC-MS圖譜。
[0020]圖2是用于比較的丙酸桿菌科發酵提取物的GC-MS圖譜。
[0021]圖3是來自乳桿菌科和丙酸桿菌科同時發酵的雙重發酵提取物的GC-MS譜。
[0022]圖4表示用乳桿菌科發酵提取物、丙酸桿菌科發酵提取物和來自乳桿菌科和丙酸桿菌科同時發酵的雙重發酵提取物處理的全層組織中的HASl表達。
[0023]圖5表示用乳桿菌科發酵提取物、丙酸桿菌科發酵提取物和來自乳桿菌科和丙酸桿菌科同時發酵的雙重發酵提取物處理的全層組織中的CD44表達。
[0024]圖6A、6B和6C分別表不未經處理的體外角質層破壞模型中的透明質酸表達。
[0025]圖6B表示用視黃醇處理的體外角質層破壞模型中的透明質酸表達。
[0026]圖6C表示用來自乳桿菌科和微藻的同時發酵的雙重發酵提取物處理的體外角質層破壞模型中的透明質酸表達。
[0027]圖7A表示未經處理的處理的體外角質層破壞模型中的半胱天冬酶-14表達。
[0028]圖7B表示用視黃醇處理的體外角質層破壞模型中的半胱天冬酶-14表達。
[0029]圖7C表示用來自乳桿菌科和微藻的同時發酵的雙重發酵提取物處理的體外角質層破壞模型中的半胱天冬酶-14表達。
[0030]圖8A和SB顯示施用微藻和乳桿菌科雙重發酵物后，通過皮膚彈性測量儀(cutometer)對皮膚彈性的體內評價。
[0031]圖9A和9B顯示施用微藻和乳桿菌科雙重發酵物后，對細紋和皺紋的體內評價。
[0032]圖1OA和IOB顯示施用微藻和乳桿菌科雙重發酵物后，對眼周部位的細紋和皺紋的體內Silflo評價。
[0033]【具體實施方式】 [0034]目前本發明出乎意料地發現含有從至少兩種微生物的同時發酵或順序發酵過程中取出的發酵提取物的局部用組合物在用于個人護理和治療用途的局部用組合物中具有有益性質。所述有益性質包括，例如，當含有所述發酵提取物的組合物局部施用于皮膚時，發現該組合物在刺激皮膚細胞中的透明質酸、CD44和半胱天冬酶14的蛋白的生成方面是有效的。
[0035]在不受任何理論束縛的條件下，相信同時發酵或順序發酵使一種微生物可與另一微生物競爭。在存在來自第一微生物的代謝產物的條件下，第二微生物的競爭環境使第二微生物開始表達使其在該競爭環境中生長旺盛的代謝產物。具體而言，第二微生物可代謝來自第一微生物的次級代謝產物和細胞因子，反之，第一微生物也可代謝來自第二微生物的次級代謝產物和細胞因子。因此，發酵提取物變成含有獨特的代謝活性物質的新組合物，而所述獨特的代謝活性物質不能在上述微生物單獨發酵時得到。
[0036]為了制備本發明的發酵提取物，在一種實施方式中，使第一微生物在通過化學方法定義的營養培養基中生長。如本文所使用的“通過化學方法定義的營養培養基”是指含有用于微生物生長的營養物質的特定化學來源的培養基，例如氮、碳的化學來源等。通過化學方法定義的營養培養基一般不含營養物質的生物來源，例如酵母菌或動物/植物組織營養物質。第一微生物通過表達次級代謝產物改良營養培養基。次級代謝產物包括蛋白、細胞因子、多糖、核酸等。接著，第二微生物可接種于含有第一微生物和來自第一微生物的代謝產物的改良的營養培養基中。然后，使第一微生物和第二微生物在改良的營養培養基中同時發酵以生成發酵混合物。可選地，在第一微生物發酵之后，使第二微生物在改良的營養培養基中發酵。一般而言，所述發酵會含有水溶性部分和水不溶性部分。可從發酵混合物中除去水不溶性部分，由此分離水溶性部分(本發明的發酵提取物)。本文使用的“水溶性”是指溶于I克水中的I克雙重發酵提取物。所述提取物還可溶于水/有機溶劑混合物，所述水/有機溶劑混合物例如，但不限于，水性乙二醇和水性丙三醇。
[0037]如本文使用的“發酵提取物”是指來自兩種或兩種以上微生物的發酵的組合物。本發明的發酵提取物含有來自兩種微生物的細胞質成分和細胞外成分，包括，但不限于，營養肉湯(nutrient broth)、細胞蛋白物質、細胞核物質、細胞原生質物質和/或細胞壁成分
坐寸ο
[0038]當兩種微生物同時或按順序生長時，該過程在本文中稱作為“雙重發酵”。來自雙重發酵的發酵提取物在本文中稱作為“雙重發酵提取物”。如本文所述的，實例涉及用于制備雙重發酵提取物的雙重發酵；然而，預期額外的微生物可同時或按順序進行發酵。[0039]一般而言，為了制備雙重發酵提取物，使第一微生物在生長培養基中生長至對數生長后期。如本文使用的“對數生長后期”是指微生物培養物的指數生長的最后階段。指數生長的特征為指數的細胞生長或加倍的細胞生長。指數生長的持續時間取決于在給定時間存在的微生物的種群數量以及培養基中營養物質的可用性。典型地，使第一微生物生長直至600nm下的光密度為至少約6。使第一微生物在規定的溫度范圍下生長持續規定的時間段。在無菌轉移罐中收集得到的改良的營養培養基。可進一步純化改良的營養培養基以除去第一微生物。可選地，在添加諸如乳桿菌之類的第二微生物的過程中，可使第一微生物保留在改良的培養基中。通過光密度和活菌數^OOnm下光密度至少為6 ;或者活菌數約為IO9菌落形成單位/ml)的改變監測第二微生物的生長。
[0040]基本上任何營養培養基均可用于本發明，其沒有特別限制。營養培養基是本領域技術人員已知的，并且對本發明有用的營養培養基的生成沒有特別限制。典型的營養培養基可在例如“Handbook of Microbiological Media，，CRC Press 出版(Boca Raton, FL)中找到。例如，用于本發明發酵過程的合適的營養培養基為通過化學方法限定的培養基，不含任何動物來源的產物，含有明確定義的且充足的碳源、氮源和磷源。
[0041]在發酵過程中，使流加培養物一般在約20至30°C下，在補充有碳源(丙三醇、乳糖)；氮源(肽和氨基酸)以及磷的營養培養基中生長。PH—般通過滴加2M NH4OH保持恒定為5.0±1.5。發酵氧條件通過可滅菌的氧探針時刻監測，發酵環境一般通過在發酵罐中以最低限度攪拌維持，所述攪拌的最大速度為介于IOOrpm至150rpm之間。氮氣的進給速度一般設定為0.01至0.5VVM(體積空氣/容器體積/每分鐘)。可采用其它氣體或可不采用其它氣體，可施加額外的外部壓力或者可不施加額外的外部壓力，例如，使用氧化壓力(stress)促進技術(例如添加臭氧或UV光)或者使用壓力相關技術(例如，加熱)。
[0042]發酵工藝可以在任何類型的攪拌生物反應器或波型生物反應器中實施。對本發明有用的生物反應器包括，但不限于，可獲自New Brunswick Scientif ic (新澤西州愛迪生)或Applikon Biotechnology (加州福斯特城)的分批補料反應器。
[0043]第一微生物和第二微生物菌兩者可在有氧條件下生長或在無氧條件下生長，或者在有氧和無氧條件下生長以刺激次級代謝產物。任選地，在發酵過程中，可將微生物暴露在壓力源下，所述壓力源例如，諸如過氧化氫和臭氧之類的化學品，諸如超聲、UV、紅外輻射或熱之類的能量。
[0044]可使用本領域技術人員已知的技術對次級代謝產物進行檢測。一種特別有效的技術包括與質譜結 合的色譜分析法(LC/MS或GC/MS)。檢測次級代謝產物的另一有效方法為通過使用商售的微生物基因組陣列。這種陣列是本領域技術人員已知的，并且諸如酵母和乳桿菌之類的微生物的陣列可購買得到。用于檢測次級代謝產物表達的其它方法可包括流式細胞術。可使用氣相色譜和質譜分析(GC/MS)檢測次級代謝物表達。這些儀器的實例包括來自 Skyray Instrument 公司和 Thermo-Scientific 公司的儀器。
[0045]可通過從第一微生物和第二微生物的胞外分泌物中分離生物質和提取活性成分得到發酵提取物。可選地，可通過本領域技術人員已知的方法溶解細胞得到雙重發酵提取物的溶解物。在這些方法中,通過化學方式、酶解方式或物理方式或者通過這些方式的組合使細胞壁破裂。可通過本領域技術人員已知的許多方式進一步純化雙重發酵提取物，包括但不限于，色譜法、溶劑萃取、離心、傾析、過濾或活性炭處理。可通過本領域技術人員已知的任何方式進一步濃縮雙重發酵提取物，包括但不限于，蒸發、噴霧干燥、低壓升華干燥、帶式或轉鼓式干燥。
[0046]用于本發明的同時或順序發酵的合適的微生物可包括本領域技術人員已知的各種不同的微生物科屬，包括，但不限于:脈孢菌屬(Neurospora),長_殼屬(Ceratostomella),麥角菌屬(Claviceps),炭角菌屬(Xylaria),座堅殼屬(Rosellinia),柔膜菌屬(Helotium),核盤霉屬(Sclerotinia),柄灰包屬(Tulostoma),須腹菌屬(Rhizopogon),耳柱干真菌類(Truncocolumella)，毛霉菌屬(Mucor),根霉屬菌(Rhizopus),蟲霉屬(Entomophthora),網柱菌屬(Dictostylium),芽枝莓屬(Blastocladia),壺菌屬(synchytrium)，水霉屬(Saprolegnia)，霜霉屬(Peronospora),白銹菌屬 Albugo,腐霉屬(Pythium),喇卩入菌屬(Craterellus),皮特瑞菌屬(Pterygellus)，疫霉屬(Phytophthora)，根腫菌屬(Plasmodiophora)，塊菌屬(Tuber)，齒菌屬(Hydnum)，荼潰屬(Lecanora)，染料衣屬(Roccella)，雞皮衣屬(Pertusaria)，松蘿屬(Usnea)，扁枝衣屬(Evernia)，樹花屬(Ramalina)，樹發屬(Alectoria)，石蕊屬(Cladonia)，梅衣屬(Parmelia)，冰島衣屬(Cetraria)，傘菌屬(Agaricus)，雞油菌屬(Cantharellus)，類胳燕屬(Omphalotus)，鬼傘屬(Coprinus)，乳燕屬(Lactarius)，皮傘屬(Marasmius)，側耳屬(Pleurotus)，鱗傘屬(Pholiota)，紅燕屬(Russula)，球蓋燕屬(Stropharia)，粉紅孢子傘菌類(Entoloma)，環柄燕科(Lepiotaceae)，伏革菌屬(Corticium)，薄膜革菌屬(Pellicularia)，口蘑屬(Tricholoma)，臺蕈屬(Volvaria)，杯傘屬(Clitocybe)，火燕屬(Flammulina)，酵母屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，曲霉菌屬(Eurotium)，曲霉屬(Aspergillus)，梭孢殼屬(Thielavia)，盤菌屬(Peziza)，普拉塔暗盤菌屬(Plectania)，羊肚菌屬(Morchella)，叢耳菌屬(Wynnea)，馬鞍菌屬(Helvella)，鹿花菌屬(Gyromitra)，鬼筆目(Phallales)，狄克提歐菌屬(Dictyophera)，蛇頭菌屬(Mutinus)，籠頭菌屬(Clathrus)，三叉鬼筆屬(Pseudocolus)，馬勃菌屬(Lycoperdon，馬勃屬(Calvatia)，地星屬(Geastrum)，根灰包菌屬(Radiigera)，阿斯特斯菌屬(Astreus)，鳥巢菌屬(Ni dularia)，伽氏灰燕屬(Gastrocybe)，地紅燕屬(Macowanites)，腹牛肝菌屬(Gastroboletus)，地花菌屬(Albatrellus)，新香郝屬(Neolentinus)，黑孔菌屬(Nigroporus)，褐腐干酪屬(Oligoporus)，多孔菌屬(Polyporus)，牛排菌屬(Fistulina)，層孔菌屬(Fomes)，牛肝菌屬(Boletus)，褐小牛肝菌屬(Fuscoboletinus)，撫柄牛肝菌屬(Leccinum)，糟孔牛肝菌屬(Phylloporus)，乳牛肝菌屬(Suillus)，松塔牛肝菌屬(Strobilomyces)，牛肝菌(Boletellus)，銀耳屬(Tremella)，木耳屬(Auricularia)，花耳屬(Dacrymyces)，柵鎊菌屬(Melampsora)，柱鎊菌屬(Cronartium)，柄銹屬(Puccinia)，膠銹菌屬(Gymnosporangium)，腥黑粉菌屬(Tilletia)，條黑粉菌屬(Urocystis)，隔擔菌屬(Septobasidium)，濕傘屬(Hygrocybe)，錯傘屬(Hygrophorus)，濕菌髓(Hygrotrama)，新錯傘屬(Neohygrophorus)，絲膜菌屬(Cortinarius)，裸傘屬(Gymnopilus)，發癬菌屬(Trichophyton)，小孢霉屬(Microsporum)，串珠霉屬(Monilia)，念珠菌屬(Candida)，小尾抱屬(Cercosporella)，青霉菌屬(Penicillium)，芽生菌屬(Blastomyces)，尾孢屬(Cercospora)，綠核菌屬(Ustilaginoidea)，瘤座孢屬(Tubercularia)，德抱菌屬(Fusarium)，絲核菌(Rhizoctinia)，束絲菌屬(Ozonium)，菌核屬(Sclerotium)，地舌菌(Geoglossum)，或松蕈屬(Armillaria);類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)，氣微菌屬(Aeromicrobium);弗萊德門菌屬(Friedmanniella)，撲科研菌屬(Kribbella)，大理石雕菌屬(Marmoricola);微白霜菌屬(Micropruina)，類諾卡氏菌屬(Nocardioides)，脂肪肝菌屬(Pimelobacter)，丙酸胞菌屬(Propionicicella)，丙酸單胞菌屬(Propionicimonas)，熱孔菌屬(Thermasporomyces)，布魯克勞尼亞菌屬 Brooklawnia，黃絡球菌屬(Luteococcus)，丙酸桿菌屬(Propionibacterium)，微丙酸菌屬(Propionimicrobium)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，夏普氏菌屬(Sharpea)，兩性囊霉屬(Ambispora)，無梗囊霉菌屬(Acaulospora)，恩氏孔菌屬(Enthrophospora)，殘孔菌(Abortiporus)，阿米露孔菌屬(Amylocystis)，薄孔菌屬(Antrodia)，似薄孔菌屬(Antrodiella)，深黃孔菌屬(Aurantiporus)，黃孔菌屬(Auriporia)，牛舌草孔菌屬Buglossoporus，錯孔菌屬(Ceriporia)，擬錯菌屬(Ceriporiopsis)，齒毛菌屬(Cerrena)，克里歐孔菌屬(Criolopsis),隱孔菌屬(Cryptoporus),迷孔菌屬(Daedalea),擬迷孔菌屬(Daedaleopsis),丹特羅亞菌屬(Dantronia), 二絲孔菌屬(Diplomitoporus),董氏孔菌(Donkioporia)，擬孔菌屬(Fomitopsis)，彩孔菌屬(Hapalopilus)，硫色絢孔菌屬(Laetiporus)，拉氏孔菌 Laeptoporus,大孔菌屬(Megasporoporia),灰黑孔菌(Melanoporia),亞灰樹花菌屬(Meripilus),黑孔菌屬(Nigroporus),少孔菌屬(Oligoporus),歐式孔菌屬(Ossicaulis),銳孔菌屬(Oxyporus),帕氏孔菌屬(Parmastomyces)，皮拉孔菌屬(Pilatoporus)，剝管菌屬(Piptoporus)，臥孔菌屬(Poria),波斯特孔菌屬(Postia),硬孔菌屬(Rigidoporus),苔芝屬(Taiwanofungus),紅木色孔菌屬(Tinctoporellus)，栓菌屬(Trametes)，干酪菌屬(Tyromyces),獲茶菌屬(Wolf iporia),古老球菌屬(Palaeococcus),火球菌屬(Pyrococcus),高溫球菌屬(Thermococcus)，絲衣霉屬(Byssochlamys)，毛薩托菌屬(Chaetosartorya)，克勞姆菌屬(Chromocleista),雙叉菌屬(Dichotomomyces),埃德菌屬(Edyuillia),翅抱霉屬(Emericella)，艾里斯菌屬(Erythrogymnotheca)，正青霉屬(Eupenicillium)，散囊菌屬(Eurotium),芬尼菌屬(Fennellia),鉤囊菌屬(Hamigera),半內果菌屬(Hemicarpenteles),新石座菌屬(Neopetromyces),新薩托菌屬(Neosartorya),擬青霉屬(Penicilliopsis),石座菌屬(Petromyces),西格菌屬(Segenoma),裸節菌屬(Talaromyces),嗜熱子囊菌屬(Thermoascus),特里希菌屬(Thrichocoma),沃卡菌屬(Warcupiella),曲菌屬(Aspergillus),梅 _ 霉屬(Merimbla),擬青霉(Paecilomyces),菲亞羅霉屬Phialosimplex,賽捷羅霉屬(Sagenomella),隔梭孢屬(Septofusidium),綴霉屬(Thysanophora),撫青霉(Geosmithia),乳酸桿菌科,丙酸桿菌科,放線菌目，馬拉色菌屬(Malasezzia),和微藻和其它類似種類。還應理解的是,原核生物、藻類細胞、植物細胞、動物細胞或昆蟲細胞也可與一種或一種以上上述微生物共同發酵。上述微生物/生物(mirobe/organism)酵母屬,裂殖酵母屬，丙酸胞菌屬，丙酸單胞菌屬,熱孔菌屬，丙酸桿菌科，微丙酸菌屬，乳酸桿菌科，彩孔菌屬(Hapalopilus),革菌科(Coriolaceae),半知發菌科(Mitosporic Trichocomaceae),馬拉色菌科(Malasseziaceae),乳酸桿菌科,丙酸桿菌科，放線菌目(Actinomycetales)和微藻尤其優選。
[0047]在一種實施方式中，使用屬于乳酸桿菌科和丙酸桿菌科的微生物培養物制備雙重發酵提取物。分別使乳酸桿菌和丙酸桿菌生長的方法是本領域技術人員已知的。典型地，屬于乳酸桿菌門和丙酸桿菌門的細菌為喜歡在沒有氧的條件下生長的專性厭氧菌或微嗜氣的細菌。一些種類可忍受存在少量氧的條件。
[0048]為了制備雙重發酵提取物，使第一微生物(例如丙酸桿菌屬)在生長培養基中生長至對數生長后期。優選地，使第一微生物生長直至600nm下的光密度至少為6。在一種實施方式中，在25°C至30°C下使第一微生物生長約16小時至約18小時。在無菌的轉移罐中收集得到的改良的營養培養基。可進一步純化改良的營養培養基以除去第一微生物。可選地，可在添加諸如乳酸桿菌之類的第二微生物的過程中，使第一微生物保留在改良的培養基中。通過光密度和活菌數(600nm下光密度至少為6 ;或者活菌數為109菌落形成單位/ml)的改變監測第二微生物的生長。
[0049]在另一實施方式中，使用屬于微藻科吾肯氏壺菌屬(Ulkenia sp.)和乳桿菌科的培養物制備雙重發酵提取物。使吾肯氏壺菌和乳桿菌分別生長的方法是本領域技術人員已知的。 典型地，屬于吾肯氏壺菌和乳桿菌門的細菌為專性厭氧菌或微嗜氣的細菌，并且這種細菌喜歡在含有無機鹽的富營養培養基中生長。
[0050]為了制備雙重發酵提取物，使第一微生物(例如微藻)在生長培養基中生長至對數生長后期。在一種實施方式中，在20°C至24°C下使第一微生物生長持續約96小時至約388小時。在無菌轉移罐中收集得到的改良的營養培養基。可進一步純化改良的營養培養基以除去第一微生物。可選地，可在添加諸如乳酸桿菌之類的第二微生物的過程中，使第一微生物保留在改良的培養基中。通過光密度和活菌數^OOnm下光密度至少為6 ;或者活菌數為IO9菌落形成單位/ml)的改變監測第二微生物的生長。
[0051]可使用本領域技術人員已知的技術封裝雙重發酵提取物，所述技術包括，但不限于，形成脂質體或其它脂質封裝物、對雙重發酵提取物進行噴霧干燥、將雙重發酵提取物封裝在聚合物膠囊中、將雙重發酵提取物吸收或吸附在惰性基質上等。
[0052]所述雙重發酵提取物可用于局部用組合物。所述局部用組合物可通過次級代謝產物的表達向皮膚細胞提供保護，所述次級代謝產物在單一微生物的發酵過程中不表達。通過施用含有雙重發酵提取物的局部用組合物，其可提供抗老化、皮膚增白、皮膚細胞更新、皮膚細胞保護、皮膚屏障保護、皮膚保濕以及其它療效的益處。
[0053]本發明的局部用組合物可含有基于所述局部用組合物的重量的約0.01wt%至高達約10wt%的發酵提取物。一般而言，所述局部用組合物可含有基于所述局部用組合物的重量的約0.1wt%至5wt%，典型地，約0.5wt%至約2￥丨％的發酵提取物。
[0054]除了發酵提取物，所述局部用組合物可優選含有防腐劑。可將防腐劑加至所述發酵提取物或局部用組合物中以保持發酵提取物的環境并保護發酵提取物不被不期望的空氣傳播的微生物污染。如本文使用的“防腐劑”是指使發酵提取物無菌或對不期望的微生物保持生物穩定的成分。防腐劑包括酸、醇、乙二醇、對羥基苯甲酸酯、含四氮的化合物、異噻唑啉酮、釋放甲醛的化合物和鹵代化合物以及酶。示例性的醇包括苯氧乙醇、異丙醇和芐醇；示例性的乙二醇包括丙二醇、丁二醇和戊二醇；示例性的對羥基苯甲酸酯(paraben或parahydroxybenzioc acid)包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯；示例性的含四氮化合物包括苯扎氯銨、季銨鹽(Quaternium) 15 ;示例性的異噻唑類包括甲基異噻唑啉、甲基氯代異噻唑啉；示例性的醛釋放劑包括DMDM乙內酰脲、咪唑烷基脲和雙咪唑烷基脲；示例性的抗氧化劑包括丁羥甲苯、生育酚，示例性的鹵代化合物包括三氯生和氯己定二葡糖酸鹽。示例性的酶包括葡萄糖氧化酶和乳過氧化酶。可用于本發明的目的的防腐劑的實例可在 Steinberg, D.“Frequency of Use of Preservatives2007”.Cosmet.Toilet.117,41 - 44 (2002)和“Preservative Encyclopedia”Cosmet.Toilet.117，80 - 96 (2002)中找到。此外，諸如“Cosmetic and Drug Microbiology”, OrthDS ed., Francis&Taylor, Boca Raton, Fla.(2006)中的 Ciccognani D.的文章 CosmeticPreservation Using Enzymes中描述的那些防腐劑之類的酶防腐體系也可有效用于局部用組合物中。
[0055]一般而言，優選地，防腐劑的量至少為局部用組合物的總重量的約0.01wt%，至少為約0.lwt%，高達約10wt%。典型地，使用所需防腐劑的最小量，典型地，所述防腐劑以少于局部用組合物的重量的約5wt%存在，更典型地，所述防腐劑以基于局部用組合物的重量的約0.^^%至約2.0wt%的范圍存在。[0056]局部用組合物還可含有皮膚病學上可接受的載體。如本文使用的短語“皮膚病學上可接受的載體”是指所述載體適于局部施用于具有良好的美學特性的皮膚、毛發、指甲等，與發酵提取物和任何其它成分相容，并且不會引起任何不期望的安全性問題或毒性問題。皮膚病學上可接受的載體也是一般美容和/或藥學上可接受的。
[0057]所述皮膚病學上可接受的載體或“載體”可為多種不同形式的載體。例如，乳劑載體，包括，但不限于，水包油、油包水、水包油包水和硅樹脂包水包油乳劑在本文中是有用的。這些乳劑可包括較大的粘性范圍，所述粘性范圍例如約IOOcps至約200000cps。這些乳劑也可使用機械泵容器或使用常規推進劑的加壓氣溶膠容器以噴霧形式遞送。這些載體還可以奶油凍(mousse)的形式遞送。其它合適的局部用載體包括無水液體溶劑，例如油、醇和硅樹脂(例如礦物油、乙醇、異丙醇、二甲聚硅氧烷、環甲硅油等)；基于水性的單相液體溶劑(例如含氫的醇溶劑體系)；這些無水和基于水性的單相液體溶劑的增稠形式(例如，其中通過添加適當的膠、樹脂、蠟、聚合物、鹽等增大溶劑的粘性以形成固體或半固體)。可用于本發明的局部用載體體系的實例在以下四篇文獻中描述:"Sun ProductsFormulary^Cosmetics&ToiIetries,第 105 卷，第 122 - 139 頁(1990 年 12 月)；"SunProducts Formulary", Cosmetics&Toiletries,第 102 卷，第 117 - 136 頁(1987 年 3 月)；美國專利第4，960，764號；和美國專利第4，254，105號。
[0058]所述載體可含有局部用組合物的重量的約50wt%至約99wt%，一般而言，所述載體的量為基于所述局部用組合物的總重量的約75wt%至約99wt%。典型地，所述載體占所述組合物的總重量的約85wt%至約95wt%。
[0059]示例性的載體包括含氫的醇體系和水包油乳劑。當所述載體為含氫的醇體系時，所述載體可含有約0%至約99%的乙醇、異丙醇或者其混合物，以及約1%至約99%的水。更優選的是含有約5%至約60%的乙醇、異丙醇或其混合物，以及約40%至約95%的水的載體。尤其優選的是含有約20%至約50%的乙醇、異丙醇或者其混合物，以及約50%至約80%的水的載體。當所述載體為水包油乳劑時，所述載體可包括用于制備這些乳劑的常規賦形劑成分中的任何一種。對合適載體的更加詳細的討論可在美國專利第5，605，894號和美國專利第5，681，852號中找到。
[0060]任選地，局部用組合物可含有其它功能性成分，例如，水、表面活性劑、乳化劑、調節劑、軟化劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色劑、濕潤劑、保濕劑、穩定劑、稀釋劑、溶劑和芳香劑。此外，個人護理組合物還可含有活性成分，例如植物萃取物、營養素、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑止癢劑、抗痘成分、遮光劑、防腐劑等。
[0061]含有所述發酵提取物的局部用組合物可用于各種不同類型的美容制劑，包括，但不限于乳液、軟膏、霜齊?、噴霧、針齊?、水性凝膠或水-醇混合物凝膠、奶油凍、貼齊?、護具、罩、濕潤的面膜、擦拭巾、固體棒、清潔棒、唇膏、氣溶膠霜劑、無水粉末、滑石、補劑、油、乳劑和浴鹽。這些美容制劑可通過局部施加在皮膚上使用。
[0062]根據本發明的另一實施方式，本發明還提供組合物的濃縮物，所述組合物的濃縮物含有(a)發酵提取物；(b)足以對成分(a)起滅菌作用或生物靜態作用的防腐劑，其中，成分(a)的量為所述組 合物的重量的約90%至約99.9%，成分(b)的量為所述組合物的重量的約0.1%至10%。一般而言，所述發酵提取物為所述組合物的重量的約98%至約99.5%，成分(b)的量為所述組合物的重量的0.5%至2%。諸如溶劑或載體之類的其它額外的成分也可存在于所述濃縮物中。
[0063]下列實施例意于舉例說明本發明的范圍，對本發明的范圍不構成任何限制。除非另有明確說明，所有部分和百分數為重量部分和重量百分數，所有溫度的單位為攝氏度。
[0064]實施例
[0065]實施例1
[0066]微生物和培養基
[0067]從乳清粉提取物中分離細菌細胞培養物。為了實現本發明的目的，特別優選屬于乳桿菌科和丙酸桿菌科的微生物培養物。嚴格根據生長速率選擇第一微生物(乳桿菌科vs.丙酸桿菌科)。丙酸桿菌科由于其具有更快的生長速率而被選擇，因為理想情況是代謝并富集培養基中的大多數初級成分。為了實現本發明的目的，使兩種微生物在缺氧條件下生長或在微嗜氣的條件下(沒有氧氣或有限的氧氣)生長。將原種培養物保持在含有胰蛋白胨、酵母 提取物、過濾的乳清提取物(PH7.0)和瓊脂(Sigma，St.Louis, MO)的培養基中。使母種培養物在含有培養基的震蕩燒瓶中生長，所述培養基包含酵母提取物10%、大豆胰蛋白胨肉湯5%、磷酸二氫鉀2.5%、磷酸氫二鉀1.5%、乳糖10%、丙三醇5% (SigmaSt.Louis, MO)。除了上述培養基成分，向生長培養基中添加諸如氨基酸、微生物混合物和礦物質之類的補充生長因子(Sigma，St.Louis, MO)。在整個過程中使用阻沫劑σ -乳劑B (Sigma, St.Louis, MO)。
[0068]生物反應器
[0069]在通過震蕩燒瓶試驗優化處理之后，將工藝按比例增加至2L和15L發酵階段(2L:新澤西州愛迪生的New Brunswick Scientific和15L:加州福斯特城的ApplikonBiotechnology) 0使兩種微生物在缺氧條件下生長，通過溶氧檢測器監測氧濃度。將氮氣噴入生物反應器中以控制氧的濃度并用于次級代謝產物表達。通過可滅菌的DO探針時刻監測缺氧條件，并通過在發酵罐中以最低限度攪拌保持缺氧環境，所述攪拌的最大速度為100至150rpm。氮速率設為0.01至0.5VVM (體積空氣/容器體積/每分鐘)。為了制備本發明的雙重發酵提取物，使謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)細胞培養物在25°C至30°C下生長；最優選地，在27°C下生長。為了實現本發明的目的，使兩種微生物同時在發酵罐中生長(第二微生物植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)在存在第一微生物的條件下生長)。在發酵過程中，當營養培養基有限時，在特定時間點(接種第一微生物后16至18小時；600nm下光密度> 5)接種植物乳桿菌；由此引起封閉環境中對營養物質的競爭。在營養受限階段引入第二微生物植物乳桿菌導致在兩種微生物之間產生競爭性的、‘生存型’反應，尤其當生長在諸如生物反應器之類的封閉體系中時。連續監測培養基中的生長和營養消耗(通過在線監測、光密度檢測)。在引入第二微生物之前，由營養限制和第一微生物對氧的消耗引起壓力。
[0070]通過從雙重微生物的胞外分泌物中分離生物質和提取活性成分獲得最終雙重發酵提取物。可通過過濾進一步純化所述雙重發酵提取物。可通過本領域技術人員已知的選擇性分子量膜過濾方法進一步濃縮該雙重發酵提取物。水性培養基中雙重發酵提取物的最終濃縮物至少為0.01%。更優選地，雙重發酵提取物的濃度至少為0.1 %。使用濃度為0.5至1.1 %的苯氧乙醇作為防腐劑(密蘇里州圣路易斯的Sigma)。
[0071]兩種單一微生物對照(乳桿菌科與丙酸桿菌科)在與上述相同的條件下生長。微生物對照樣品的區別參數為沒有第二微生物且沒有誘導次級代謝產物。使用上述選擇性分子量膜過濾技術純化單一微生物的提取物。
[0072]實施例2:通過GC/MS進行代謝物分析
[0073]在實施例1中的雙重發酵結束之后進行GC-MS以分析不同代謝物的表達。三種樣品如下分析:
[0074]發酵對照1-乳桿菌科
[0075]發酵對照2-丙酸桿菌科
[0076]雙重發酵提取物
[0077]對水性樣品(1、2和3)進行特定的酸提取；其中，分離酸部分，用重氮甲烷試劑進行甲基化，對有機酸的相應甲酯進行GC-MS分析。將測試樣品直接注入GC中，通過揮發性成分頂部空間分析(頂部空間GC-MS)還對低分子量酸進行分析。圖1和圖2為對照樣品微生物I和微生物2的GC-MS分析。圖3表示雙重發酵提取物的GC-MS分析，說明兩種微生物的競爭誘導新代謝物的表達，否則所述新代謝物不表達(如果微生物單獨生長)。
[0078]實施例3人皮膚細胞微陣列分析
[0079]使用人基因組微陣列(Agilent Technologies)檢測如實施例1所述制備的雙重發酵產物對兩種皮膚細胞系(纖維母細胞和角質細胞)的影響。用來自實施例1的1%的雙重發酵物處理細胞24小時。離心得到的處理過的皮膚細胞，用RNA Later(Ambion)重懸含有細胞核物質的小粒并在4°C下保存。使用RiboPure RNA提取試劑盒(Ambion)提取來自人細胞的總RNA，隨后使用Message AMP aRNA試劑盒(Ambion)擴增mRNA。對于該陣列，使用MicroMax陣列標記試劑盒(Perkin Elmer)用Cy_3或Cy_5對aRNA的樣品進行突光標記。然后將標記的aRNA施加至表皮纖維母細胞和角質細胞的皮膚細胞DNA微陣列芯片并雜交過夜(Agilent Technologies)。第二天,洗漆芯片并用Axon4100A DNA微陣列掃描
儀掃描，使用Axon Genepix-Pro?軟件分析。用于基因微陣列分析的方法可在美國專利申請公開第US2006/0110815號中找到。
[0080]從獲自人體表皮角質細胞和人體皮膚纖維母細胞基因微陣列的感興趣的基因中篩選與重要的特定皮膚功能有關的基因。對與多種不同的皮膚新陳代謝功能有關的幾個基因的上調(與中等水平的比率> 1.3)或下調(與中等水平的比率< 0.7)進行分析。為了進行基因微陣列分析，術語“上調”是指RNA過表達的基因。術語“下調”是指RNA低表達。結果在表1中報道。
[0081]
【權利要求】
1.一種局部用組合物，所述組合物含有從至少兩種微生物的同時發酵或順序發酵中取出的發酵提取物。
2.根據權利要求1所述的局部用組合物，其中，所述發酵提取物含有第二微生物的代謝物，所述第二微生物的代謝物在存在第一微生物的代謝物的條件下生長。
3.根據權利要求2所述的局部用組合物，其中，所述第二微生物的代謝物與所述第一微生物的代謝物同時生長。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的局部用組合物，所述組合物還含有數量足以對所述發酵提取物起滅菌作用或生物靜態作用的防腐劑和皮膚病學上可接受的載體。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的組合物，其中，每一微生物選自:脈孢菌屬，長_殼屬，麥角菌屬，炭角菌屬，座堅殼屬，柔膜菌屬，核盤霉屬，柄灰包屬，須腹菌屬，耳柱干真菌類，毛霉菌，根霉屬菌，蟲霉屬，網柱菌屬，芽枝莓屬，壺菌屬，水霉屬，霜霉屬，白銹菌屬，腐霉屬，喇叭菌屬，皮特瑞菌屬，疫霉屬，根腫菌屬，塊菌屬，齒菌屬，茶潰屬，染料衣屬，雞皮衣屬，松蘿屬，扁枝衣屬，樹花屬，樹發屬，石蕊屬，梅衣屬，冰島衣屬，傘菌屬，雞油菌屬，類臍菇屬，鬼傘屬，乳菇屬，皮傘屬，側耳屬，鱗傘屬，紅菇屬，球蓋菇屬，粉紅孢子傘菌類，環柄菇科，伏革菌屬，薄膜革菌屬，口蘑屬，臺蕈屬，杯傘屬，火菇屬，酵母屬，裂殖酵母屬，曲霉菌屬，曲霉屬，梭孢殼屬，盤菌屬，普拉塔暗盤菌，羊肚菌屬，叢耳菌屬，馬鞍菌屬，鹿花菌屬，鬼筆目，狄克提歐菌屬，蛇頭菌屬，籠頭菌屬，三叉鬼筆屬，馬勃菌屬，馬勃屬，地星屬，根灰包菌屬，阿斯特斯菌屬，鳥巢菌屬，伽氏灰菇屬，地紅菇屬，腹牛肝菌屬，地花菌屬，新香菰屬，黑孔菌屬，褐腐干酪屬，多孔菌屬，牛排菌屬，層孔菌屬，牛肝菌屬，褐小牛肝菌屬，疣柄牛肝菌屬， 褶孔牛肝菌屬，乳牛肝菌屬，松塔牛肝菌屬，牛肝菌，銀耳屬，木耳屬，花耳屬，柵銹菌屬，柱銹菌屬，柄銹屬，膠銹菌屬，腥黑粉菌屬，條黑粉菌屬，隔擔菌屬，濕傘屬，蠟傘屬，濕菌髓，新蠟傘屬，絲膜菌屬，裸傘屬，發癬菌屬，小孢霉屬，串珠霉屬，念珠菌屬，小尾孢屬，青霉菌屬，芽生菌屬，尾孢屬，綠核菌屬，瘤座孢屬，鐮孢菌屬，絲核菌，束絲菌屬，菌核屬，地舌菌，或松蕈屬；類諾卡氏菌科，氣微菌屬；弗萊德門菌屬，撲科研菌屬，大理石雕菌屬；微白霜菌屬，類諾卡氏菌屬，脂肪肝菌屬，丙酸胞菌屬，丙酸單胞菌屬，熱孔菌屬，布魯克勞尼亞菌屬，黃絡球菌屬，丙酸桿菌屬，微丙酸菌屬，乳桿菌屬，夏普氏菌屬，兩性囊霉屬，無梗囊霉菌屬，恩氏孔菌屬，殘孔菌屬，阿米露孔菌屬，薄孔菌屬，似薄孔菌屬，深黃孔菌屬，黃孔菌屬，牛舌草孔菌屬，蠟孔菌屬，擬蠟菌屬，齒毛菌屬，克里歐孔菌屬，隱孔菌屬，迷孔菌屬，擬迷孔菌屬，丹特羅亞菌屬，二絲孔菌，董氏孔菌，擬孔菌屬，彩孔菌屬，硫色絢孔菌屬，拉氏孔菌，大孔菌屬，灰黑孔菌，亞灰樹花菌屬，黑孔菌屬，少孔菌屬，歐式孔菌屬，銳孔菌屬，帕氏孔菌屬，皮拉孔菌屬，剝管菌屬，臥孔菌屬，波斯特孔菌屬，硬孔菌屬，苔芝屬，紅木色孔菌屬，栓菌屬，干酪菌屬，茯苓菌，古老球菌屬，火球菌屬，高溫球菌屬，絲衣霉屬，毛薩托菌屬，克勞姆菌屬，雙叉菌屬，埃德菌屬，翹孢霉屬，艾里斯菌屬，正青霉屬，散囊菌屬，芬尼菌屬，鉤囊菌屬，半內果菌屬，新石座菌屬，新薩托菌屬，擬青霉屬，石座菌屬，西格菌屬，裸節菌屬，嗜熱子囊菌屬，特里希菌屬，沃卡菌屬，曲菌屬，梅麗霉屬，擬青霉，菲亞羅霉屬，賽捷羅霉屬，隔梭孢屬，纓霉屬，疣青霉，乳酸桿菌科，丙酸桿菌科，放線菌目，馬拉色菌屬和微藻。
6.根據權利要求5所述的組合物，其中，每一微生物選自:酵母屬，裂殖酵母屬，丙酸胞菌屬，丙酸單胞菌屬，熱孔菌屬，丙酸桿菌科，微丙酸菌屬，乳酸桿菌科，彩孔菌屬，革菌科，半知發菌科，馬拉色菌科，乳酸桿菌科，丙酸桿菌科，放線菌目和微藻。
7.根據權利要求2至6中任一項所述的組合物，其中，所述第一微生物為謝氏丙酸桿菌，所述第二微生物為植物乳桿菌。
8.根據權利要求2至6中任一項所述的組合物，其中，所述第一微生物為微藻，第二微生物為植物乳桿菌。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的組合物，所述組合物還含有防腐劑，所述防腐劑選自:水楊酸、山梨酸、苯氧乙醇、芐醇、乙醇、季銨鹽-15、與底物組合的葡糖氧化酶和乳過氧化物酶、及上述物質的組合。
10.根據權利要求9所述的組合物，其中，所述防腐劑含有苯氧乙醇。
11.根據權利要求9或10所述的組合物，其中，所述防腐劑的量為基于所述組合物的總重量的至少0.1wt%。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的組合物，所述組合物還含有至少一種選自以下的成分:水、表面活性劑、乳化劑、調節劑、軟化劑、蠟、油、聚合物、增稠劑、固定劑、著色齊?、濕潤劑、保濕劑、穩定劑、稀釋劑、溶劑、芳香劑、植物萃取物、營養素、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗菌劑、留族激素、去屑止癢劑、抗痘成分、遮光劑、防腐劑及其組合。
13.根據權 利要求4所述的組合物，其中，所述組合物含有0.lwt%至10wt%的所述發酵提取物、0.1￥1:%至10wt%的所述防腐劑以及5(^1:%至95wt%的所述皮膚病學上可接受的載體。
14.根據權利要求1至13中任一項所述的組合物，所述組合物含有按重量計90.0%至99.9%的所述發酵提取物和按重量計0.1%至10.0%的所述防腐劑。
15.根據權利要求14所述的組合物，其中，所述發酵提取物含有在存在植物乳桿菌的代謝物的條件下同時生長的謝氏丙酸桿菌的代謝物。
16.根據權利要求14所述的組合物，其中，成分(a)含有在存在植物乳桿菌的代謝物的條件下同時生長的微藻的代謝物。
17.根據權利要求1至16中任一項所述的組合物，其中，所述發酵提取物通過含有以下步驟的方法制備: (i)使用通過化學方法定義的第一營養培養基使第一微生物生長至對數生長后期，以制備含有所述第一微生物和由所述第一微生物表達的次級代謝物的第二營養培養基； (?)使所述第二營養培養基與第二微生物接觸； (iii)在第二營養培養基中使所述第一微生物和所述第二微生物同時發酵以制備含有水溶性部分和水不溶性部分的發酵混合物；以及 (iv)從所述發酵混合物中分離所述水不溶性部分，由此隔離所述水溶性部分并制備出所述雙重發酵提取物。
18.一種制備來自同時發酵的發酵提取物的方法，所述方法包括: (i)使用通過化學方法定義的第一營養培養基使第一微生物生長至對數生長后期，以制備含有所述第一微生物和由所述第一微生物表達的次級代謝物的第二營養培養基； (?)使所述第二營養培養基與第二微生物接觸； (iii)在第二營養培養基中使所述第一微生物和所述第二微生物同時發酵以制備含有水溶性部分和水不溶性部分的發酵混合物；以及(iv)從所述發酵混合物中分離所述水不溶性部分，由此隔離所述水溶性部分并制備出所述雙重發酵提取物。
19.根據權利要求18所述的方法，其中，所述第一微生物為謝氏丙酸桿菌，所述第二微生物為植物乳桿菌。
20.根據權利要求18 所述的方法，其中，所述第一微生物為微藻吾肯氏壺菌，所述第二微生物為植物乳桿菌。
21.根據權利要求18至20中任一項所述的方法，其中，所述第一微生物與所述第二微生物在有氧條件下、無氧條件下或者組合條件下生長。
22.—種刺激皮膚細胞中的透明質酸和⑶44生成的方法，所述方法包括使使用者的皮膚與根據權利要求1至17中任一項所述的局部用組合物接觸。
23.一種刺激皮膚細胞中的透明質酸和半胱天冬酶-14生成的方法，所述方法包括使使用者的皮膚與根據權利要求1至17中任一項所述的局部用組合物接觸。
【文檔編號】A61K36/02GK103957997SQ201280052827
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年10月25日 優先權日:2011年10月25日
【發明者】詹姆斯·文森特·格魯伯, 史密瑟·拉奧 申請人:奧麒個人護理產品公司