專利名稱：：含peg化人生長激素綴合物的藥物及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物制藥領域，具體而言，本發明涉及含低含量的聚乙二醇(PEG)化人生長激素綴合物的藥物組合物以及低劑量的PEG化人生長激素綴合物針對人患者(尤其是內源性生長激素缺乏而致病的人患者)的藥物用途。該低劑量藥物具有毒副作用更小、生產成本更低等優勢。
背景技術：
：人生長激素(hGH)可用于治療因腦垂體機能不足而導致的侏儒癥或Turner綜合癥，另外也可用于促進兒童生長，治療慢性腎功能不全、艾滋病衰竭、和衰老等。天然的hGH是由人腦下垂體分泌的蛋白質，其由191個氨基酸殘基組成，分子量為22kDa。hGH的主要生物學功能是促進幼小的哺乳動物身體組織的生長并保持住老年哺乳動物的組織，其中所涉及的組織包括骨骼、結締組織、肌肉、以及諸如肝、腸、和腎等器官的組織。人生長激素還可以通過成熟的基因重組技術獲得，如可參見Chang等(Gene,55:189，1987)、Goeddel等(Nature，281:544，1979)和Gray等(Gene，39:247，1985)的工作。當前已經有多種重組hGH可以從市場上購買，如Genotropin、Nutropin禾nSomatonorm。直接給藥hGH等蛋白質將由于身體內對蛋白質的高清除率而使其藥理學活性作用時間較短，影響其穩定性。為此，人們通過用水溶性聚合物化學修飾這些蛋白質來有效阻滯蛋白水解酶與蛋白質主鏈直接接觸，防止其降解，從而有效降低了其體內清除率，改善其穩定性，增加了其在體內循環的時間，從而可以減少給藥次數。聚乙二醇(PEG)是最常用于化學修飾蛋白質的水溶性聚合物之一。PCT申請W09300109A就報道了用PEG修飾人生長激素。然而，據Clark等(JournalofBiologicalChemistry,271:21969-21977，1996)的研究分析，并非所有PEG化的hGH綴合物都能保持原有hGH活性，某些hGH的PEG化形式甚至將大大降低其體外活性，以至于無法進行具有實用性的應用。由此，人們進行大量嘗試來開發在特定位點上進行特異PEG修飾的hGH綴合物，以期在保持hGH活性的基礎上，降低不均一性和體內清除率、增加其在體內的循環時間、提高穩定性。例如，PCT申請W09711178A公開了通過在hGH中的賴氨酸位點上進行PEG化，但是這需要在天然人生長激素中引入新的賴氨酸(如K168A和K172R的取代)，其他研究記載于中國專利(申請)CN100369953C和CN10109080A等文獻內。PCT申請W02003044056A和中國專利申請CN1477126A分別披露了在hGH的N端進行PEG修飾的綴合物，然而其中公開的制備步驟只能使最終綴合產物中只有大約90y。的PEG綴合到hGH的N端上，即使再加上其中公開的進一步純化的步驟，最終產生的PEG化的hGH綴合物也只能達到95y。左右的純度，其中包括未綴合的PEG、hGH及它們的降解產物。盡管中國專利申請CN1565624A聲稱可以獲得純度大于98。/。的綴合物，但是其制備(純化)的工藝細節被刻意掩蓋，甚至沒有PCT申請W02003044056A和中國專利申請CN1477126A所披露的達到95y。左右的純度的技術方案詳細，也沒有通過公認的檢測手段確認該純度產物的存在，無法預期能取得相應純度效果。而本發明人經過艱苦、長期的努力，也令人驚訝地優化出了一種與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物的制備方法，它可以在不增加生產成本的條件下，通過特定綴合和純化步驟的優化組合，所獲得的綴合物的純度可以遠遠超過95%，甚至可以達到用高效大小排阻層析(SEC-HPLC)和反相高效液相層析(RP-HPLC)等通用檢測手段檢測達到99%以上的純度水平。除了具有現有技術中PEG化的hGH綴合物的優點之外，在當前藥物不良反應越來越引起患者和藥物監管部門重視的情況下，這種高純度的hGH綴合物對于制備高質量的藥物制劑有著非常重要的意義，不但能減少由于不均一而引起的藥物不良反應，而且便于藥物制劑生產中的質量管理。該高純度的hGH綴合物記載于2008年5月30日申請的題名為"純化的PEG化人生長激素綴合物及其藥物制劑"的中國專利申請第200810050760.8號中，其全文納入本文參考。但是，為了能夠實際對人體施用，需要確定有效而安全的人施用量，并據此制備相應單位劑量的藥物組合物(或藥物制劑)。然而，現有技術對于hGH綴合物的人施用的藥物劑量方面的研究很欠缺，多是利用鼠等動物模型來推算藥物達到藥效的劑量，而人患者的劑量還沒有解決，而且接受PEG化的hGH治療的人的體型特殊性更進一步增加了藥物劑量研究的復雜程度。例如，在使用與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH的情況下，具有藥效(而非用于藥物代謝研究)的PEG化的hGH的大鼠劑量被證實要達到1.8mg/kg體重(參見中國專利(申請)CN1608079A和CN1929857A);而根據等(藥)效劑量的換算規則(可參見FDA、SFDA等藥品管理機構的指導意見，具體換算在"黃繼漢等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算.中國臨床藥理學與治療學，2004S印；9(9):1069-1072"中有記載，成人與大鼠的劑量比為1:6.17)，標準體重的成人的劑量應當為0.288mg/kg體重；而且對于需要接受hGH的人(因為生長發育不良才需要治療)來說，其體型較小(為兒童或兒童體型，體重為10至40kg)，體表面積相對較大，故而根據相應修正公式推算的相應患者的劑量將大于0.288mg/kg體重。然而，本發明人經過長期而艱苦的結合臨床研究，基于翔實的研究成果，令人驚訝地發現了，對于人患者，尤其對于內源性生長激素缺乏的人患者，更低劑量的與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物已經具有優異的藥效，甚至可以優于現有藥物的藥效，而且由于所需劑量更低，相應地具有毒副作用更小、不良反應更少、生產成本更低等優點。當前，在藥品不良反應以及醫療保健成本越來越受到政府和大眾重視的情況下，相信這些優點能起非常積極而重要的作用。
發明內容本發明的目的在于提供兩個層面的發明，一為提供低劑量的聚乙二醇(PEG)化人生長激素綴合物在作為治療人方面的應用或產品，二為提供高純度的聚乙二醇(PEG)化人生長激素綴合物及其組合物、應用和制備方法。這兩個層面的技術方案可以結合在一起，相互替換對應的技術特征，也可以不結合而單獨構成兩個發明。在發明的第一個層面上，本發明的目的在于提供含低含量的聚乙二醇(PEG)化人生長激素綴合物的藥物組合物、藥品以及低劑量的PEG化人生長激素綴合物針對人患者的藥物用途，其劑量低于現有技術從動物有效的劑量換算過來的劑量，但仍舊能達到優良的治療效果，尤其是確實能對人患者取得作為可批準上市藥物級別的治療效果。這樣的低劑量具有毒副作用更小、不良反應更少、生產成本更低等優點。以下
發明內容部分將具體闡述第一個層面的技術方案。具體而言，在第一個方面，本發明提供了低劑量的與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物在制備用于治療需要接受hGH治療的人患者的疾病的藥物中的應用。其中，所述低劑量指的是低于通過現有動物有效劑量換算而得的人劑量，即低于通過1.8mg/kg大鼠體重換算而得的人劑量，如低于0.288mg/kg體重。本發明人通過嚴謹的人臨床實驗發現，用比現有技術(如，CN1608079A和CN1929857A)推算的人劑量少的劑量給藥，甚至相應劑量比現有技術推算的少三分之一甚至一半以上，不但能減少被給藥的人患者發生不良反應的可能性，降低了生產成本，而且仍舊取得了優異的對人患者的治療效果。在第一個方面，優選其中所述低劑量是0.01-0.26mg/kg體重，優選是O.03-0.25mg/kg體重，更優選是0.05-0.24mg/kg體重，更優選是O.07-0.23mg/kg體重，更優選是O.08-0.22mg/kg體重，更優選是0.09-0.21mg/kg體重，特別優選是O.1-0.20mg/kg體重，尤其特別優選是O.2mg/kg體重、0.15mg/kg體重或0.lmg/kg體重。在本發明的具體實施方式中，用于人患者的劑量為O.1mg/kg體重和0.2mg/kg體重。根據所需劑量，制藥廠商可以根據市場需求為人患者個人或相同體重的患者群體制備相應的藥物，如可生產適用于15kg體重人患者的藥物或生產適用于25kg體重人患者的藥物。在本文中(即，不但在本發明層面，而且也可應用于本說明書的其他層面和方面，下同)，如果沒有特別指明，與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的的hGH綴合物是hGH的單一游離氨基與PEG綴合的產物。這樣的hGH綴合物是現有技術中已知的，例如6W02003044056A、CN1477126A、CN1565624A、CN1608079A和/或CN1929857A中公開的那些。在本文中，與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的的hGH綴合物優選其中超過60。/。的單一游離氨基是hGH的N端氨基酸的游離氨基，更優選其中其中超過70%的單一游離氨基是hGH的N端氨基酸的游離氨基，更優選其中超過80l的單一游離氨基是hGH的N端氨基酸的游離氨基，特別優選與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物是本發明第二層面提供的高純度的hGH綴合物。另外，在本文中，如果沒有特別指明，綴合物的劑量是以綴合物中有效活性成分計的劑量，即，與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物的劑量是以其中hGH蛋白計的劑量，如0.2mg/kg體重的劑量指綴合物中hGH蛋白為0.2mg/kg體重的劑量。相應劑量的綴合物的給藥途徑和給藥頻率優選是本發明具體實施方式所述的。在第二個方面，本發明提供了用于治療需要接受hGH治療的人患者的疾病的藥物組合物，其包含與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物以及藥學上可接受的載體，所述與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物的含量是低含量。其中，所述低含量指的是上述第一個方面所述的低劑量與人患者體重相乘而得的重量，即該低含量是人患者在一次給藥中的使用量，也就是相應藥物單位劑型(如，一針)的有效活性成分量。需要接受hGH治療而促進生長的人患者體重低于正常人，其體重介于10-40kg之間，因此可以根據第一方面所述的低劑量范圍計算出相應藥物組合物中與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物的含量。因此，在該第二個方面，優選其中所述低含量是是O.1-10.4mg，優選是0.3-10mg，更優選是O.5-9,6mg,更優選是O.7-9.2mg，更優選是0.8-8.8mg，更優選是0.9-8.4mg，特別優選是卜8mg，更特別優選是2-8mg、1.5-6mg或l-4mg。為了方便醫務工作者或患者或其家屬在給藥時使用而不進行藥物合并，優選的低含量應當能滿足絕大多數患者的需要而且使得浪費量盡量少，因此上述低含量也優選是llmg、10.5mg、10mg、9.5mg、9mg、8.5mg、或8mg,根據本發明人對于臨床試驗中出現的患者體重的分布情況來看，最優選低含量是9rag。該藥物組合物的給藥方式和給藥頻率可以按照現有技術所記載的來進行，最優選本發明的具體實施方式中所述的臨床治療方案來進行。與該第二個方面相對應，在第三個方面，本發明還提供了本發明第二個方面的藥物組合物在制備用于治療需要接受hGH治療的人患者的疾病的藥物中的應用。在本文中，藥物和藥物組合物有著相同的含義，都為本領域普通技術人員所熟知，均指具有治療或預防效果的藥用化學產品，通過其中有治療或預防活性的成分起作用。另外，如果沒有特別指明，組合物中綴合物的含量是以綴合物中有效活性成分計的含量，即，組合物中與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物的含量是以其中hGH蛋白計的含量，如2-8mg/kg的含量指組合物中所含的綴合物中hGH蛋白重量為2-8mg,在第四個方面，本發明提供了用于治療需要接受hGH治療的人患者的疾病的藥品，其包括，(1)容器，其裝有與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物或本發明第二個方面的藥物組合物；和(2)用于指示以低劑量的與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物給藥的標簽，優選其中所述低劑量是0.01-0.26mg/kg體重，優選是0.03-0.25mg/kg體重，更優選是0.05-0.24mg/kg體重，更優選是0.07-0.23mg/kg體重，更優選是0.08-0.22mg/kg體重，更優選是0.09-0.21mg/kg體重，特別優選是0.1-0.20mg/kg體重，尤其特別優選是0.2mg/kg體重、0.15mg/kg體重或0.1mg/kg體重。藥品是為大眾所常見的產品，可在藥店、醫院等場所獲得。其中，容器可以是瓶、盒、注射器等能容納上述綴合物、藥物組合物或用于臨時配制藥物的輔劑的常用容器。藥品可以只包括一個容器，也可以包括多個容器，不同容器可以裝有相同化學產品，也可以裝有不同化學產品。標簽可以貼在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以以獨立的形式存在，如作為能裝上述容器的藥盒或作為單獨提供的說明書。標簽是藥品這一產品所必需的，因為根據有關藥品監督管理法規，藥品中應當包括有標明劑量的說明書，因此所述標簽正是起了該說明書的作用，用以使藥品符合強制性要求。當然，在用于指示以低劑量的與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物給藥的標簽上也可以指示其他必要條件，如有效成分、給藥方式等。根據本文記載的有效成分、給藥方式等內容，尤其是本發明實施例中的臨床試驗，本領域技術人員能夠制備(如，印制)出這些標簽。標簽指示以低劑量的與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物給藥，其中，標簽的指示具體可以是以"用藥劑量/單位體重"來表示的，也可以以特定人群的絕對用藥量來表示，如"15kg體重人患者的用量"、"25kg體重人患者的用量"，這時需要根據體重情況進行簡單換算。如果容器中裝的是藥物組合物，則可以根據單位劑型(如一粒、一針)中與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物的含量，而將低劑量換算成單位劑型的數量，用標簽指示。這些計算對本領域及刷人員來說是很容易的。通常優選一件藥品的不同容器中只裝相同劑型的藥物組合物。盡管不優選，但是不同劑型的容器被包括在一件藥品中的情況也包括在本發明的范圍內。根據需要，如方便運輸、存放，藥品可以進一步包裝進更大的包裝中，這樣的產品也在本發明的范圍內。優選在本發明第一個層面的各個方面中，所述人患者為兒童或兒童體重的人。其中，兒童是年齡大于等于3歲而且在青春發育期前的人，而且其體重介于10-40kg之間，其性別不限；兒童體重的人指的是年齡較兒童大，但是體重仍舊介于10-40kg之間的人。這些人需要促進正常生長，或需要接受治療以彌補落后于正常的生長，因此優選包括在本發明第一個層面的各個方面中。優選在本發明第一個層面的各個方面中，除了促進正常的生長之外，所述疾病是因缺少生長激素而導致的疾病。因缺少生長激素而可以導致的疾病包括但不限于，身材矮小癥、極低出生體重、侏儒癥(生長激素缺乏癥)、代謝綜合征和努南綜合征、燒傷(尤其是重度燒傷)、成人生長激素缺乏及兒童特發性矮小，優選是生長激素缺乏癥，更優選是內源性生長激素缺乏癥，尤其是因內源性生長激素缺乏癥導致的兒童生長緩慢。優選在本發明第一個層面的各個方面中，所述與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物是本發明第二個層面的高純度的hGH綴合物，即基本純的綴合物，該基本純的綴合物由聚乙二醇通過連接基團與hGH的單一游離氨基共價連接而成，所述綴合物的純度不小于96%,優選不小于97%，優選不小于98%，更優選不小于99%，最優選用高效大小排阻層析和/或反相高效液相層析檢測純度達到99%以上。更優選其中hGH的氨基酸序列如SeqIDNCh1所示；和/或其中連接基團是N-羥基琥珀酰亞胺基；和/或其中聚乙二醇的分子量約為40kDa。在本文中，"藥學上可接受的載體"指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、緩沖劑、保護劑、防腐劑、包裹材料或其他制劑輔料。優選在本發明第一個層面的各個方面中，通過注射途徑來給藥，尤其是皮下注射，更優選每周注射一次，因此所述藥物組合物優選是粉針劑(如凍千粉針劑)和液體制劑。尤其是液體制劑無需在使用前臨時配制，方便使用，因此優選在本發明第一個層面的各個方面中，所述藥物組合物為液體制劑，更優選為注射劑，在一個具體實施方式中，最優選為皮下注射劑。在本發明的第二個層面上，本發明的目的還在于提供一種高純度的PEG化的hGH綴合物，其通過特定綴合和純化步驟的組合而得，可以在不增加成本的條件下，增加所得產物的純度，從而可以更有利于將其作為藥物有效成分使用，一方面可以減少由于不均一而引起的藥物不良反應，更便于在藥物制劑生產中加強質量管理，在生產中具有很好的實際意義。本發明的目的還在于提供上述hGH綴合物的制備方法，包括特定的綴合和純化步驟。另外，本發明的目的還在于包含上述hGH綴合物的藥物組合物或藥物制劑以及藥物應用。本發明第二個層面上的
發明內容可以優選應用于本發明第一個層面的應用(用途)、藥物組合物和/或藥品中，但也可以應用于非本發明第一個層面的應用(用途)、藥物組合物和/或藥品等中，例如，本發明第二個層面上的高純度的hGH綴合物或含其的藥物組合物因其藥用質量方面的可靠性，而可以替代現有技術或新開發的技術中hGH或其綴合物。以下
發明內容部分將具體闡述第二層面的技術方案。具體而言，在第一方面，本發明提供了基本純的綴合物，其特征在于，所述綴合物由聚乙二醇通過連接基團與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成，所述綴合物的純度不小于96%。也就是說，本文中所用的"基本純"與純度不小于96%有相同的含義。人生長激素(本文中簡稱為hGH)是促進兒童身體組織的生長并保持住成年人組織的蛋白質。人生長激素可以是提取獲得的，但優選是通過基因重組技術獲得的。從現有發展狀況來看，通過基因重組技術獲得hGH是成熟的技術，而且目前也已經有市售的產品。在本發明中，優選的hGH是天然的hGH，其氨基酸序列如SeqIDN0:l所示。hGH的單一游離氨基可以是其N端的a氨基或其側鏈的游離氨基(如賴氨酸的側鏈氨基)，優選是hGH的N端的a氨基。在優選的情況下，聚乙二醇通過連接基團與人生長激素N端苯丙氨酸的a氨基共價連接。本發明也優選適于在大腸桿菌中表達而得到的hGH，其氨基酸序列可以是在SeqIDNO:1所示的氨基酸序列的N端再添加一個甲硫氨酸。這樣，聚乙二醇通過連接基團與人生長激素N端甲硫氨酸的(i氨基共價連接。在本文中，術語"純度"具有蛋白制藥領域技術人員常規理解的含義，其含義相當于均一性。由于制備蛋白綴合物時，由于蛋白質的降解或沒有有效綴合或綴合位點的不同，造成除了目的產品之外，還會產生蛋白質降解產物或其綴合物、沒有發生綴合的產物、綴合位點不同或同時在多個位點綴合的產物等副產物，由此造成制備出的蛋白綴合物是目的產品與副產物的混合物，并非完全均一(或純)的目的產品。這種不均一性(或不純)造成藥物產品質量難以控制。純度可以用制備出的蛋白綴合物中的目的產品與蛋白綴合物的質量百分比或摩爾百分比來表示，但是在實踐中，通常使用常規的檢測儀器中代表目的產品的峰與代表包括不均一產物的峰的面積的百分比值來表示。在本發明中，如無特別說明，均采用后者所述的百分比來表示純度。在本發明中，本發明人通過優化摸索，采用本發明第三方面所述的制備方法，獲得了純度不小于的96%綴合物。純度的測定是用本領域技術人員所公知的儀器及檢測步驟來進行，通常這些測定方法都來自于相應藥品檢測的規定和標準，優選通過本發明具體實施方式中所列的鑒定方法來進行。本發明優選綴合物的純度不小于97%,優選不小于9鄉，更優選不小于99%，最優選用高效大小排阻層析(SEC-HPLC)和/或反相高效液相層析(RP-HPLC)檢測純度達到99%以上。由于本發明能夠獲得純度高的產物，因此只要適當添加入不均一成分，如可以表征產品來源的痕量無害成分，就可以方便地實現相應純度較低的產品。在本發明的第一方面中，聚乙二醇與連接基團共價連接，形成活化的聚乙二醇(即，聚乙二醇與連接基團共價連接的產物)，再通過活化的聚乙二醇中的連接基團與hGH連接。其中，連接基團能與hGH的單一游離氨基共價連接，優選能與N端的ci氨基共價連接，如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA)或醛等，優選N-羥基琥珀酰亞胺基。PEG可以是直鏈PEG,也可以是支鏈PEG，優選是支鏈PEG。PEG的分子量為10kDa120kDa，優選為3090kDa，更優選為約40kDa或約80kDa。其中，"約"表示上下限為所示數值的土10%，如約40kDa為3644kDa。除了通過化學反應共價連接聚乙二醇與連接基團來制備活化的聚乙二醇之外，也可以直接采用已經商品化的活化的聚乙二醇，如Shearwater公司提供的甲氧基PEG丙醛(mPEG-ALD)、雙甲氧基PEGN-羥基琥珀酰亞胺基酯(mPEG2-NHS)和甲氧基PEG琥拍酰亞胺丙酸酯(PEG-SPA)等，用以直接與hGH綴合。在第二方面，本發明提供了藥物組合物，其包含本發明第一方面所述的綴合物和藥學上可接受的載體。采用高純度的綴合物原料制備藥物組合物，能夠改善產生的產品的質量。根據本領域的公知技術，可以根據治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，優選該組合物為單位劑量形式，如固體制劑(如片劑、膜劑、丸劑、膠囊、粉劑、粉針劑、或顆粒劑等)、液體制劑(如糖漿劑和乳液劑、消毒的住射用溶液或懸浮液、氣霧劑或液體噴劑、滴劑、或針劑等)、以及自動注射裝置或栓劑，更優選是粉針劑和液體制劑。尤其是液體制劑無需在使用前臨時配制，方便使用，因此本發明的藥物組合物優選是液體制劑。然而，由于與在固體環境中不同，在液體環境中，蛋白質或其綴合物更容易受水解而降解，因此開發含PEG化的hGH綴合物需要大量實驗摸索。pH值對蛋白綴合物的穩定和溶解性質有很大影響，本發明的藥物組合物的pH優選為約6.0,即為5.T6.6，最優選為6.0。本發明的藥物組合物包括的緩沖劑優選選自檸檬酸鹽、組氨酸鹽、和馬來酸鹽，其中通過本發明人的研究發現，當采用檸檬酸鹽作為緩沖劑時，能夠最大化地保持本發明的藥物制劑穩定，因此本發明的藥物組合物優選包括用作緩沖劑的檸檬酸鹽，更優選檸檬酸鹽的濃度為3-7mM，最優選檸檬酸鹽的濃度為5niM。本發明的藥物組合物包括的表面活性劑優選選自泊洛沙姆188、吐溫80、和吐溫20,其中通過本發明人的研究發現，當采用泊洛沙姆188作為表面活性劑時，能有效防止PEG化的hGH綴合物降解，因此本發明的藥物組合物優選包括用作表面活性劑的泊洛沙姆188，更優選泊洛沙姆188的濃度為0.53mg/ml，最優選泊洛沙姆188的濃度為lmg/ml。在本發明的一個具體實施方式中，本發明的液體制劑包含5raM擰檬酸三鈉，lmg/ml泊洛沙姆188，2.5tng/ml苯酚，9mg/ml氯化鈉，和9.Omg/tnlPEG化的hGH綴合物，該液體制劑pH為6.0。在第三方面，本發明提供了制備本發明第一方面所述的綴合物的方法，其包括-(a)將人生長激素溶液與活化的聚乙二醇混合，使人生長激素與聚乙二醇發生綴合反應；和(b)將步驟(a)得到的反應混合液稀釋，用以pH6.5-8.0的平衡緩沖液平衡的Sephadex11G-25層析柱純化，收集第一個洗脫峰的洗脫液；和(c)將步驟(b)得到的洗脫液上樣于以pH6.5-8.0的平衡緩沖液平衡的Q-Sepharose層析柱，用含lOmMNaCl的平衡緩沖液梯度洗脫，然后用含50mMNaCl的平衡緩沖液洗脫并收集洗脫液。其中，步驟(a)優選為將人生長激素溶液與活化的聚乙二醇混合，于4t:以50-100rpm攪拌16~18小時，使人生長激素與聚乙二醇發生綴合反應。其中，平衡緩沖液的pH為為pH6.5-8.0，優選為pH7.0-7.8，更優選為pH7.2-7.6，最優選為pH7.4，在本發明的具體實施方式中，平衡緩沖液是Tris-HCl。其中，活化的聚乙二醇是聚乙二醇與連接基團共價連接的產物，優選是雙甲氧基PEGN-羥基琥珀酰亞胺基酯，在本發明的具體實施方式中mPEG2-NHS中的mPEG的分子量為約40kDa。通過本發明第三方面的方法，可以得到本發明第一方面純度不小于96%的綴合物。按照在本發明的具體實施方式中所述的方法，得到的綴合物用高效大小排阻層析(SEC-HPLC)和/或反相高效液相層析(RP-HPLC)檢測純度在99%以上。在第四方面，本發明提供了本發明第一方面所述的綴合物或本發明第二方面所述的藥物組合物在制備促進生長的藥物中的應用。本發明的藥物可通過所屬領域技術人員所熟知的給藥方式來進行給藥，來促進受試者(尤其是人)的生長。可用給藥方式的例如注射、口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內給藥，優選胃腸道外給藥，如皮下、肌內或靜脈內注射。給藥劑量根據制劑形式和期望的作用時間以及治療對象的情況而有所變化，實際治療所需的量可以由臨床醫生根據受試者實際情況(如，病人的病情、體重、年齡、性別等)而方便地確定。對于向兒童注射給藥，本發明的藥物劑量，以PEG化的hGH綴合物計，可以是0.05-0.5mg/kg體重，優選的劑量是0.1-0.3mg/kg體重，最優選的是如本發明第一個層面所述的，為0.2mg/kg體重、0.15mg/kg體重或0.lmg/kg體重。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，并不構成對本發明范圍的限制。顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻也是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本發明進行參考，就好像它們的全文己經在本發明說明書中重復敘述過一樣。圖1.本發明的高純度PEG化的hGH綴合物的SEC-HPLC圖譜12圖2.本發明的高純度PEG化的hGH綴合物的RP-HPLC圖譜圖3，本發明的高純度PEG化的hGH綴合物的SDS-PAGE電泳圖，其中第一道為PEG-GH,第二道為蛋白分子量標記圖4A本發明的高純度PEG化的hGH綴合物的蛋白酶水解質譜圖圖4B作為對照的hGH的蛋白酶水解質譜圖圖4C本發明的高純度PEG化的hGH綴合物的基質輔助激光解吸離子化飛行時間-質譜(MALDI-TOF-MS)圖具體實施例方式以下本文將通過具體的實施例來描述發明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子克隆實驗指南》(第三版)(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《蛋白質技術手冊》(科學出版社，2000)等手冊和相關藥物法規、規定以及本文所引用的參考文獻中所列的方法來實施。另外，實施例中所使用的材料除有特別說明外，均可通過商業途徑從市場上購買。實施例1入生長激素與聚乙二醇的綴合1，將人生長激素溶液(人生長激素濃度為10mg/ml，溶于50mM磷酸鹽緩沖液中，pH至6.5)置于無菌三角瓶中，以50-100rpm的速度攪拌。在持續攪拌的條件下，分批向加入反應容器中加入雙甲氧基PEG-N-羥基琥珀酰亞胺基酯(mPEG2-NHS，分子量為42.5kDa，購自Shearwater公司)，雙甲氧基PEGN-羥基琥珀酰亞胺基酯的加入總重量為人生長激素的4倍(即其與rhGH的重量比為4:1)，至加入的雙甲氧基PEGN-羥基琥珀酰亞胺基酯全部溶解，于4'C以50-100rpm攪拌1618小時，使人生長激素與聚乙二醇發生綴合反應，得反應混合液。2，將人生長激素溶液(人生長激素濃度為10mg/ml，溶于50mM磷酸鹽緩沖液中，pH至6.5)置于無菌三角瓶中，以50-100rpm的速度攪拌。在持續攪拌的條件下，分批向加入反應容器中加入雙甲氧基PEG-N-羥基琥珀酰亞胺基酯(mPEG2-NHS,分子量為42.5kDa,購自Shearwater公司)，雙甲氧基PEGN-羥基琥珀酰亞胺基酯的加入總重量為人生長激素的6倍(即其與rhGH的重量比為6:1),至加入的雙甲氧基PEGN-羥基琥珀酰亞胺基酯全部溶解，于4'C以50-100rpm攪拌16~18小時，使人生長激素與聚乙二醇發生綴合反應，得反應混合液。實施例2PEG化的hGH綴合物的純化用10mM氫氧化鈉洗滌SephadexG-25層析柱(購自華美公司)，然后用注射用水沖洗至中性，接著用20mM、pH7.4的Tris-HCl緩沖液平衡該層析柱。平衡后，向記作1倍體積的實施例1-1得到的反應混合液加入5倍體積注射用水來稀釋，然后上樣，其中上樣體積不超過柱體積的15%,用20mMTris-HclpH7.4的緩沖液洗脫，上樣和洗脫的流速介于150250cm/h之間，在波長280nm處檢測洗脫產物的光吸收值，收集第一個洗脫峰的洗脫液。用10mM氫氧化鈉洗滌Q-Sepharose層析柱(購自華美公司)，然后用注射用水沖洗至中性，接著用平衡緩沖液(即20mM、pH7.4的Tris-HCl緩沖液)平衡該層析柱。平衡后，將上述第一個洗脫峰的洗脫液上樣到Q-Sepharose層析柱上，然后用平衡緩沖液洗滌層析柱至基線平穩，接著用含10mMNaCl的平衡緩沖液梯度洗脫雜質，然后用含50mMNaCl的平衡緩沖液洗脫，其中上樣、洗滌至基線和洗脫的流速都介于90150cm/h之間，檢測波長280nm，收集用含50mMNaCl的平衡緩沖液洗脫的280nm處有吸收的吸收峰，得PEG化的hGH綴合物溶液，其中PEG與hGH上的單一游離氨基綴合。實施例3PEG化的hGH綴合物的的鑒定取實施例2所得的PEG化的hGH綴合物溶液，進行如下鑒定1，大小排阻高效液相層析(SEC-HPLC)采用SEC-HPLC對實施例2所得的產物進行評價。根據廠商說明，采用ProteinPak300SW柱(7.8mmx300mm，購自Waters公司)以pH6.5的50mM磷酸緩沖液為流動相，0.1%SDS中，以流速0.6mL/分鐘，進行SEC-HPLC分析，檢測波長214nm。如圖1所示，純度99.14%。2，反相高效液相層析(RP-HPLC)采用RP-HPLC對實施例2所得的產物進行評價。根據廠商說明，采用Vydac(250mmx4.6mm)RP-HPLC柱(購自美國GRACEVYDAC公司)，進行RP-HPLC。實驗在室溫中進行，典型載樣量為10mg蛋白質/試樣。A相為pH6.5、50mM的磷酸緩沖液；B相為乙腈，梯度洗脫，20分鐘內B相由0%增加至20%，流速0.6ml/min，檢測波長為214nm。如圖2所示，結果為單峰，純度99.51%。3，SDS-PAGE以4.5%濃縮膠和10%分離膠對實施例2所得的產物進行SDS-PAGE。如圖3所示，結果顯示為分子量為64kDa左右的單一條帶。4，肽圖分析取實施例2所得的PEG化的hGH綴合物(以下簡稱為PEG-GH)和作為對照的未PEG化的hGH,進行肽圖分析。取0.5mg的hGH和0.5mgPEG-GH脫鹽、凍干，分成20ug/份，各取一份溶于lOul的pH8.5、25mMTris緩沖液中制成測試樣品，向測試樣品中分別加入Lys-C內切蛋白酶(0.5mg/mL)2ul，在37。C保溫16.5小時。于美國BioAgePharmaceuticalsInc.進行質譜分析。結果如下表3.1和圖4A和4B所示，只有一個N末端片段在hGH的質譜圖中出現，但該片段未在PEG-GH的質譜圖中出現，表明在PEG-GH中hGH的N端的a氨基上均一地綴合了PEG。取20ugPEG-GH凍干樣品溶于lOul的pH8.5、25mMTris緩沖液中，于美國BioAgePharmaceuticalsInc進行基質輔助激光解吸離子化飛行時間-質譜(MALDI—TOF—MS)，結果如圖4C所示，顯示PEG—GH的分子量為64918，表明一個PEG只偶聯到一個生長激素分子上。表3.1質譜數據分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例4含PEG化的hGH綴合物的液體制劑研究1，液體制劑配方5mM檸檬酸三鈉，lmg/ml泊洛沙姆188，2.5mg/ml苯酚，9mg/ml氯化鈉，9.0mg/mlPEG化的hGH綴合物，PH6.0。2,制備方法準確稱取檸檬酸三鈉、泊洛沙姆188(下文簡稱PoL188)、苯酚、氯化鈉，用注射用水配制成0.IM檬酸三鈉溶液、50mg/ml泊洛沙姆溶液、20mg/ml苯酚溶液、4M氯化鈉溶液。將PEG化的hGH綴合物與上述上述溶液及注射用水混合，用鹽酸調pH值至6.0，使得終濃度為檸檬酸三鈉5mM，lmg/ml泊洛沙姆188，苯酚2.5mg/ml，氯化鈉9mg/ml和聚乙二醇重組人生長激素9.0mg/ml。也可以在上述方法中換用其他試劑或濃度，進行以下對比試驗。3，液體制劑的篩選對配方中緩沖劑、表面活性劑、濃度和pH進行研究，在40'C進行加速試驗。結果如下表4.1-4.4所述。表4.1各種緩沖劑對PEG-GH的保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結果顯示，擰檬酸三鈉與其他緩沖液相比，對于PEG-GH具有更好的保護作用。表4.2檸檬酸三鈉緩沖液濃度對PEG-GH穩定性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>HPSEC(聚合體％)0.891.111.2810mMRP-HPLC(脫酰胺％)0.450.70.82HPSEC(聚合體％)0.891.231.3120mMRP-HP1X<脫酰胺％)0.450.690.82HPSEC(聚合體％)0.891.291.38結果顯示，檸檬酸三鈉緩沖液濃度為5mM時對PEG-GH保護作用最好。表4.3pH對PEG-GH穩定性的影響^、、、、、、第O天第7天第14天p恥.ORP-HPLC(脫酰胺％)0.510.670.78HPSEC(聚合體％)0.881.021.16pH5.5RP-HPLC(脫酰胺％)0.510.710.84HPSEC(聚合體y。)0.881.181.29pH6.5RP-HPLC(脫酰胺％)0.510.720.85HPSEC(聚合體％)0.881.11.27^，當PEG-GH液體制劑pH在6.0時穩定性最好。表面活性劑及其濃度的確定第O天第7天第14天T-201.0mg/mlRP-HPLC(脫酰胺％)0.470.750.94HPSEC(聚合體％)0.881.231.42T-202.0mg/mlRP-HPLC(脫酰胺％)0.470.740.92HPSEC(聚合體％)0.881.261.46T-205.0mg/mlRP-HPLC(脫酰胺％)0.470.780.99HPSEC(聚合休％)0.881.271.4617<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結果顯示，lmg/mlP0II88對于PEG-GH具有最佳的保護作用。3，液體制劑配方比較根據上述研究，組合出如下不同配方的PEG-GH液體制劑配方l:5mM擰檬酸三鈉，lmg/ml泊洛沙姆188，2.5mg/ml苯酚，9mg/ml氯化鈉，9.0mg/mlPEG化的hGH綴合物，pH6.0;配方2:5mM組氨酸，lmg/ml吐溫80，2.0mg/ml苯酚，5mg/ml氯化鈉，9.0mg/mlPEG化的hGH綴合物，pH6.0;配方3:5mM馬來酸，lmg/ml泊洛沙姆188，1.5mg/ml苯酚，9mg/ml氯化鈉，9.0mg/mlPEG化的hGH綴合物，pH6.0。分別將hGH液體制劑與PEG-GH液體制劑置于4'C放置，每隔2個月取樣檢測，比較它們的穩定性，結果如下表5.5所示。表4.5hGH液體制劑與PEG-GH液體制劑4"C穩定性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>hGH液體制劑RP-HPLC(脫酰胺°/。)3.083394.966.77HPSEC(聚合體％)2.983.146.54PEG-GH液體制劑(配方oRP-HPLC(脫酰胺％)0,460.841.051.29HPSEC(聚合體％)0.871.071.54PEG-GH液體制劑(配方2)RP-HPLC(脫酰胺％)0.460.85U21.31HPSEC(聚合體％)0.871.091.351.62PEG-GH液體制劑(配方3)RP-HPLC(脫酰胺％)0.460.881.19].35HPSEC(聚合體％)0.871.12L341.59結果表明PEG-GH液體制劑都較hGH液體制劑具有更好的穩定性。實施例5PEG化的hGH綴合物的臨床研究以下實驗均根據國家食品藥品監督管理局相應要求進行，其中接受治療的患者體重介于10-40kg。1，人體耐受性試驗研究結果在健康受試者中，研究人體單次皮下注射PEG-GH注射液的安全性與耐受性。將單次給藥劑量組設為0.01mg.kg-1、0.06mg.kg"、0.2mg.kg"、0.5mg.kg-1、0.8mg.kg"五個劑量組，符合試驗要求的34例男女受試者隨機進入各劑量組。0.5-0.8mg,kg—J劑量組分別有1例和3例受試者在用藥期間引起血糖輕度升高，停藥后恢復正常，0.8mg.kg—'劑量組有1例受試者出現水腫癥狀，經關聯性評價上述異常很可能是聚乙二醇重組人生長激素引起的不良反應。0.8mg.kg—1齊1」量組有1例受試者給藥后168h發生腹瀉及大便潛血檢查(+),經關聯性評價上述檢測值異常很可能是聚乙二醇重組人生長激素引起的不良反應。2，臨床藥代動力學試驗研究結果通過受試者單次皮下注射PEG-GH注射液注射液后的藥代動力學試驗，了解該藥在人體內的吸收、分布、代謝的規律，為制定合理的給藥方案提供依據。研究方法單次給藥臨床藥代動力學試驗設0.1mg.kg"、0.2mg.kg"、0.4mg.kg"三個劑量組；每個劑量組受試者均為IO例；單次皮下注射PEG-GH注射液。*每個劑量組10例男性受性者。19*采用酶聯免疫法(ELISA法)測定PEG-GH的濃度，根據所得濃度-時間數據計算各主要藥代動力學參數。定性研究結果0.1、0.2、0.4mgkg"三個劑量組的PEG-GH的f1/2相近，C隨、JUQm、^f/C。^c隨著給藥劑量的增加而增加，在0.1-0.4mgkg—1范圍內單次皮下注射PEG-GH注射液在人體內的過程基本符合線性動力學特征。3,PEG-GH注射液治療兒童生長激素缺乏癥的隨機、開放、陽性藥物平行對照、多中心II期臨床研究結果本試驗是隨機、多中心、開放、以重組hGH注射液(購自長春金賽藥業有限責任公司)為陽性對照藥的平行對照II期臨床試驗。按照統計學方法進行隨機化分組，共分三組低劑量試驗組(皮下注射PEG-GH0.1mg/(kg-周)，該組以下簡稱低劑量組)、高劑量試驗組(皮下注射PEG-GH0.2mg/(kg'周)，該組以下簡稱高劑量組)和對照組(皮下注射hGH0.25mg/(kg'周))。按照隨機對照1:1:1的比例分配各組受試對象例數，每組36例，總計108例，在六家醫院同時進行。總療程為6個月，共進行4次訪視。主要評價在治療后3個月和6個月進行，如療程不滿6個月，則在治療結束時進行。治療6個月進行終期統計時，六家醫院共完成入選病例數101例的治療，實際納入FAS集(全分析集)分析的病例數為97例，低劑量組32例，男23例，女9例；高劑量組31例，男25例，女6例；對照組34例，男23例，女11例。納入PPS集(有效病例分析集)分析的病例數為95例，低劑量組31例，高劑量組30例，對照組34例。納入SS集(安全分析集)分析的病例數為98例，低劑量組33例，高劑量組31例，對照組34例。三組間性別、年齡、體重、身高等一般情況均無統計學差異(p>0.05)，治療前身體基本情況比較亦無統計學意義(p>0.05)。三組受試者在參加本臨床試驗期間，無嚴重不良事件的情況發生。結果三組受試者接受不同藥物、不同劑量治療4周后，各組試驗前后比較身高增長量及身高年生長速率都顯著增加，統計學上有顯著性差異(pO.OOl)。三組之間身高增長量進行統計學比較后，在治療4周后FAS集和PPS集均無統計學差異(p>0.05)。三組之間身高年生長速率進行統計學比較后，FAS集和PPS集同樣在治療4周后無統計學差異(p>0.05)。4,PEG-GH注射液治療兒童生長激素缺乏癥的隨機、開放、陽性藥物平行對照、多中心III期臨床研究結果本試驗是隨機、多中心、開放、以重組hGH注射液(購自長春金賽藥業有限責任公司)為對照藥的平行對照的III期臨床試驗。選擇試驗組(皮下注射PEG-GH0.2mg/(kg'周))和對照組(皮下注射hGH0.25mg/(kg調))，擴大各組受試者例數，進一步觀察PEG-GH的有效性和安全性。試驗組240例，對照組120例，總計360例，在六家中心同時進行。總療程為6個月，共進行4次訪視。主要評價在治療后3個月和6個月進行，如療程不滿6個月，則在治療結束時進行。治療6個月進行終期統計時，六家醫院共完成入選病例數346例的治療，實際納入FAS集分析的病例數為343例，試驗組228例，男187例，女41例；對照組115例，男93例，女22例。納入PPS集分析的病例數為331例，試驗組218例，對照組113例。納入SS集分析的病例數為343例，試驗組228例，對照組115例。兩組間治療前性別、年齡、體重、身高等一般情況均無統計學差異(p>0.05)，治療前生長發育學情況比較亦無統計學意義(p〉0.05)，身高、年生長速率、IGF-1、IGFBP-3、身高標準差積分等療效指標在治療前兩組間比較無統計學意義(p>0.05)。兩組受試者在參加本臨床試驗期間，無嚴重不良事件的情況發生。結果兩組受試者在治療4周、13周和25周后，各組試驗前后比較身高增長量及身高年生長速率都顯著增加，統計學上有顯著性差異(pO.OOl)。兩組之間身高增長量進行統計學比較后，在治療4周后FAS集和PPS集均無統計學差異(p>0.05)，FAS集試驗組為1.23土0.59cm,對照組為1.09土0.57cm;PPS集分別為1.23土0.59cm和1.09土0.57cm。而在治療13周后FAS集和PPS集均有統計學差異(p<0.05)，FAS集和PPS集均是試驗組增長量高于對照組，FAS集試驗組和對照組身高增長量分別為3.68土1.07cm和3.39±0.91cm;PPS集兩組分別為3.74土1.04cm和3.40士0.92cm。在治療25周后FAS集兩組之間無統計學差異(pX).05)，試驗組為6.71±1.86cm，對照組為6.28±1.49cm;而PPS集有統計學差異(p0.05)，兩組分別為6.88±1.69cm和6.30土1.47cm，試驗組增長量高于對照組。兩組之間身高年生長速率進行統計學比較后，FAS集和PPS集在治療4周、13周和25周后均有統計學差異(p<0.05)，試驗組高于對照組。身高年生長速率FAS集在治療4周時試驗組由治療前的2.26為土0.87cm/yr增加到14.71土7.04cm7yr;對照組由治療前的2.25為土0.82cm/yr增加到13.11土6.83cm/yr。兩組增加量分別為12.45±7.16cm/yr和10.86±6.95cm/yr。13周時兩組分別增加到14.72±4.29cm/yr和13.56±3.66cm/yr，增加量分別為12.47±4.48cm/yr和11.31±3.77cm/yr。25周時兩組分別增加到13.41±3.72cm/yr和12.55土2.99cm/yr，增加量分別為11.15±3.87cm/yr和10.31±3.14cm/yr。PPS集在治療4周時試驗組由治療前的2.26為土0.86cm7yr增加到14.76±7.04cm/yr;對照組由治療前的2.26為土0.82cm/yr增加到13.08土6.88cm/yr。兩組增加量分別為12.50±7.17cm/yr和10.82±7.00cm/yr。13周時兩組分別增加到14.97土4.15cm/yr和13.58±3.69cm/yr，增加量分別為12.70±4.37cm/yr和11.32±3.80cm/yr。25周時兩組分別增加到13.76±3.38cm/yr和12.60±2.94cm/yr，增加量分別為11.50±3.58cm/yr和10.34±3.10cm/yr。骨成熟程度在治療前后組內比較有顯著性統計學差異(p<0.0001)，而兩組之間在FAS和PPS集均無統計學差異(p>0.05)，男性和女性兩組之間骨成熟程度的比較也均無統計學意義(p>0.05)。男性FAS集試驗組治療后的年骨齡變化為1.02土0.77yr，對照組為1.20土0.79yr;PPS集試驗組治療后的年骨齡變化為1.07土0.76yr，對照組為1,20士0.79yr。女性FAS集試驗組治療后的年骨齡變化為1.26土1.06yr，對照組為L08土0.74yr;PPS集試驗組治療后的年骨齡變化為1.26土1.06yr，對照組為1.08士0.74yr。說明經生長激素治療后沒有促進骨齡的加快增長。序列表<110>長春金賽藥業有限責任公司<120>含PEG化人生長激素綴合物的藥物及其應用<160>1<210>1<211>191<212>PRT<213>人(homosapiens)<400>1PheProThrHeProLeuSerArgLeuPheAspAspAlaMetLeuArg151015AlaHisArgLeuHisGinLeuAlaPheAspThrTyrGinGluPheGlu202530GluAlaTyrlieProLysGluGinLysTyrSerPheLeuGinAspPro354045GinThrSerLeuCysPheSerGluSerHeProThrProSerAspArg505560GluGluThrGinGinLysSerAspLeuGluLeuLeuArglieSerLeu65707580LeuLeuHeGinSerTrpLeuGluProValGinSerLeuArgSerVal859095PheAlaAspSerLeuValTyrGlyAlaSerAspSerAspValTyrAsp100105110LeuLeuLysAspLeuGluGluGlyHeGinThrLeuMetGlyArgLeu115120125GluAspGlySerProArgThrGlyGinHePheLysGinThrTyrSer130135140LysPheAspThrAspSerHisAspAspAspAlaLeuLeuLysAspTyr145150155160GlyLeuLeuTyrCysPheArgLysAspMetAspLysValGIuThrPhe165170175LeuArglieValGinCysArgSerValGluGlySerCysGlyPhe180185190權利要求1，低劑量的與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化hGH綴合物在制備用于治療需要接受hGH治療的人患者的疾病的藥物中的應用，優選其中所述低劑量是0.01-0.26mg/kg體重，優選是0.03-0.25mg/kg體重，更優選是0.05-0.24mg/kg體重，更優選是0.07-0.23mg/kg體重，更優選是0.08-0.22mg/kg體重，更優選是0.09-0.21mg/kg體重，特別優選是0.1-0.20mg/kg體重，尤其特別優選是0.2mg/kg體重、0.15mg/kg體重或0.1mg/kg體重。2，用于治療需要接受hGH治療的人患者的疾病的藥物組合物，其包含與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化hGH綴合物以及藥學上可接受的載體，其中所述與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成hGH綴合物的含量是低含量，例如是0.1-10.4mg，優選是0.3-1Omg，更優選是0.5-9.6mg，更優選是0.7-9.2mg，更優選是0.8-8.8mg,更優選是0.9-8.4mg，特別優選是l-8mg，更特別優選是2-8mg、1.5-6mg或l-4mg，也優選是9mg。3，權利要求2所述的藥物組合物在制備用于治療需要接受hGH治療的人患者的疾病的藥物中的應用。4，用于治療需要接受hGH治療的人患者的疾病的藥品，其包括，(1)容器，其裝有與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物或權利要求2所述的藥物組合物；和(2)用于指示以低劑量的與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物給藥的標簽，優選其中所述低劑量是0.01-0.26mg/kg體重，優選是0.03-0.25mg/kg體重，更優選是0.05-0.24mg/kg體重，更優選是0.07-0.23mg/kg體重，更優選是0.08-0.22mg/kg體重，更優選是0.09-0.21mg/kg體重，特別優選是0.1-0.20mg/kg體重，尤其特別優選是0.2mg/kg體重、0.15mg/kg體重或0.1mg/kg體重。5，前述任一項權利要求所述的應用、藥物組合物或藥品，其中所述人患者為兒童或兒童體重的人。6，前述任一項權利要求所述的應用、藥物組合物或藥品，其中所述疾病是因缺少生長激素而導致的疾病，例如重度燒傷、用于已明確的下丘腦一垂體疾病所致的生長激素缺乏癥和經兩種不同的生長激素刺激試驗確診的生長激素顯著缺乏、或兒童特發性矮小等，最優選是用于因內源性生長激素缺乏所引起的兒童生長緩慢。7,前述任一項權利要求所述的應用、藥物組合物或藥品，其中所述與人生長激素的單一游離氨基共價連接而成的PEG化的hGH綴合物是一種基本純的綴合物，該基本純的綴合物由聚乙二醇通過連接基團與hGH的單一游離氨基共價連接而成，所述綴合物的純度不小于96%，優選不小于97%，優選不小于98%，更優選不小于99%，最優選用高效大小排阻層析和/或反相高效液相層析檢測純度達到99%以上。8，權利要求7所述的應用、藥物組合物或藥品，其中hGH的氨基酸序列如SeqIDNO:l所示；和/或其中連接基團是N-羥基琥珀酰亞胺基和/或其中聚乙二醇的分子量約為40kDa。9，前述任一項權利要求所述的應用、藥物組合物或藥品，其中所述藥物組合物為液體制劑，優選為注射劑，最優選為皮下注射劑。10，基本純的綴合物，該基本純的綴合物由聚乙二醇通過連接基團與hGH的單一游離氨基共價連接而成，所述綴合物的純度不小于96%，優選不小于97%，優選不小于98%，更優選不小于99%，最優選用高效大小排阻層析和/或反相高效液相層析檢測純度達到99%以上。11，藥物組合物，其包含權利要求10所述的綴合物和藥學上可接受的載體。12，制備權利要求10所述的綴合物的方法，其包括(a)將人生長激素溶液與活化的聚乙二醇混合，使人生長激素與聚乙二醇發生綴合反應；和(b)將步驟(a)得到的反應混合液稀釋，用以pH6.5-8.0的平衡緩沖液平衡的SephadexG-25層析柱純化，收集第一個洗脫峰的洗脫液；和(c)將步驟(b)得到的洗脫液上樣于以pH6.5-8.0的平衡緩沖液平衡的Q-S印harose層析柱，用含10mMNaCl的平衡緩沖液洗脫，然后用含50mMNaCl的平衡緩沖液洗脫并收集洗脫液。13，權利要求10所述的綴合物或權利要求11所述的藥物組合物在制備促進生長的藥物中的應用。全文摘要本發明涉及含低含量的聚乙二醇(PEG)化人生長激素綴合物的藥物組合物、藥品以及低劑量的PEG化人生長激素綴合物針對人患者(尤其是內源性生長激素缺乏而致病的人患者)的藥物用途。該低劑量藥物具有毒副作用更小、不良反應更少、生產成本更低等優勢。另外，本發明還可以涉及特別適于藥物應用的高純度的聚乙二醇化的人生長激素綴合物，其純度不小于96％，并涉及包含該綴合物的藥物制劑、該綴合物的制備方法及其藥物應用。文檔編號A61K47/48GK101491681SQ20081005156公開日2009年7月29日申請日期2008年12月9日優先權日2008年12月9日發明者俊牛,王俊才,瑾裴,磊金申請人:長春金賽藥業有限責任公司