專利名稱：白唇竹葉青蛇毒降纖酶及其制備方法和在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明提供一種白唇竹葉青蛇毒降纖酶及其制備方法和在制藥中的應用， 屬于生物醫學領域。
技術背景在蝰亞科、蝮亞科和眼鏡科等蛇毒中存在著一類能直接溶解纖維蛋白(原) 的酶,簡稱降纖酶，是一種既能溶解纖維蛋白原，又能溶解纖維蛋白的纖維蛋白 溶解酶。蛇毒降纖酶不存在無活性的酶原形式，而存在有活性的蛋白水解酶， 不需要激活劑激活。因此可直接作用于形成血栓的纖維蛋白，將血栓快速溶解，改善患者的臨床癥狀；通過溶解血漿纖維蛋白原，降低血液黏度，抑制血栓形 成，防止再次梗塞。根據其結構特點，蛇毒降纖酶又可分為絲氨酸蛋白酶(Serine proteinase)和 金屬蛋白酶(metalloproteinase)。絲氨酸蛋白酶的降纖活性可被常見的絲氨酸蛋 白酶抑制劑如二異丙基氟磷酸酯(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)所抑制，但不被 EDTA所抑制,而金屬蛋白酶的降纖活性可被EDTA所抑制。大多數降纖絲氨酸 蛋白酶優先裂解纖維蛋白原的Bp2鏈，而對Aa2鏈則只有很低的裂解活性；而 大多數降纖酶是金屬蛋白酶，優先裂解纖維蛋白原的Aa2鏈,而對B(32鏈則只有 較低程度的裂解。現在臨床使用的溶栓藥主要是鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活物，這類藥物的共同特點是間接作用，且起效慢。我們首次從我國產的白唇竹葉青蛇 的毒液中分離純化的降纖酶與目前臨床使用的t-PA(組織纖溶酶原激活劑)、尿激 酶、鏈激酶等溶栓制相比有許多優點白唇竹葉青蛇毒降纖酶是一種金屬蛋白 酶，其活性不被血液中絲氨酸蛋白酶抑制劑所抑制；由于其不激活生理纖溶酶 可避免，如與生理纖溶酶形成相關的血小板活化等副作用；底物專一，半衰期 長。這些特性均顯示了白唇竹葉青蛇毒降纖酶作為一種強力溶栓劑的潛在價值。 但是在目前，還沒有一套從我國白竹葉青蛇毒液中提取純化白唇竹葉青蛇毒降 纖酶行之有效的方法以及對其藥效的確認。 發明內容本發明的目的是基于上述現有技術基礎，提供一種具有較強的水解纖維蛋 白原活性的白唇竹葉青蛇毒降纖酶及其制備方法和在制藥中的應用。 為了本發明的目的，本發明提供了如下技術方案唇竹葉青蛇毒降纖酶，我們從中國產的白唇竹葉青蛇的毒液中分離得到的 一種金屬蛋白酶，其具有同時水解纖維蛋白原的ct鏈和P鏈的活性，金屬蛋白 酶抑制劑EDTA可抑制其活性，但巰基乙醇和絲氨酸蛋白酶專一性抑制劑PMSF 不能抑制其活性，其在聚丙烯酰胺凝膠電泳上的表觀分子量還原和非還原條件 下為66300道爾頓。唇竹葉青蛇毒降纖酶的制備方法，收集白唇竹葉青蛇毒液，集中后冷凍干 燥制得粗毒凍干粉，取白唇竹葉青蛇毒粗毒凍干粉1 5g，溶于4 6mlpH7.5 8.5， 0.04 0.06 mol Tris-HCl緩沖液中，用離心機以3000 5000r/min離心8 12min，取上清液，經DEAE-Sephadex A-25離子交換層析，用濃度范圍0.01 0.6 mol/L NaC11000 ml的0.04 0.06 mol Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫，洗脫流速為0.20 0.30ml/min，收集所得I峰洗脫液冷凍干燥，(該I峰為 DEAE-Sephadex A-25離子交,層析圖譜左邊數過來第一個峰)，溶解于3ml 0.01 0.6 mol/L Tris-HCl緩沖液中；經DEAE-Sephadex G-100凝膠層析，用pH 7.5 8.5， O.01 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，速為0.11 0.17ml/min,收集 分離出的I峰洗脫液(G-100凝膠層析柱分離出的I峰為SephadexG-100層析 圖譜左邊數過來第一個峰)，凍干燥后，再經CM-Sephadex C-25陽離子交換層 析，用pH5 6.5 ，濃度為0.009 0.011mol/L的NaAc緩沖液洗脫，洗脫流速 為0.25ml/min，取主峰即可。然后用高效液相色譜(HPLC)和SDS-胺凝膠平板 電泳(SDS-PAGE)鑒定其純度，分子量測定采取SDS-胺凝膠平板電泳測定。白唇竹葉青蛇毒降纖酶作為制備治療血栓疾病的應用。下面用發明的白唇竹葉青蛇毒降纖酶的藥理實驗結果來說明本發明的藥效 作用和有益效果1.纖維蛋白原平板法測定白唇竹葉青蛇毒降纖酶的降纖作用 取2%瓊脂溶液(用pH 7.4， 0.15 M/L NaCl, 50 mM/L Tris-HCl buffer配制)5ml，鋪 板前加入1 ml含10單位凝血酶溶液，在37。C-45。C水浴中與0.4%纖維蛋白原溶 液(用pH7.4，含0.15M/LNaCl， 50M/L Tris-HCl buffer配制)5ml,混合后倒入滅菌 過的培養皿(直徑卯mm)中，置室溫形成凝膠后，即成"標準平板"。將標準平 板于85'C溫箱中加熱30min后取出即成"加熱平板氣按需在平板上打直徑3mm 的小孔，每孔加樣10ul，置37'C保溫18h，取出觀察結果。結果顯示白唇竹葉 青蛇毒降纖酶在普通纖維蛋白平板和加熱平板上都能溶解纖維蛋白原，說明其 降纖機制是以直接纖溶為主；溶解纖維蛋白的活性明顯強于同等劑量的粗毒；并且以溶圈直徑對白唇竹葉青降纖組分的量雙對數作圖，二者存在一定的量效關系。2. SDS-胺凝膠平板電泳(SDS-PAGE)法測定白唇竹葉青蛇毒降纖酶的降纖作用取2.5 mg/ml纖維蛋白原與白唇竹葉青蛇毒降纖酶在pH7.4，含0.15 mol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCI buffer中混合，37。C水育保溫，分別在保溫5分鐘、30 分鐘、2小時取50 ul溶液，與50 ul電泳樣品處理液(2% SDS， 5% P -疏基乙醇) 混勻.沸水煮5分鐘。冷卻后上樣進行SDS-PAGE。結果顯示白唇竹葉青蛇毒 纖溶組分能迅速水解纖維蛋白原的Aa鏈，緩慢裂解纖維蛋白原BP鏈，對Y鏈 無影響(如圖1所示)其中，Marker為標準蛋白，1泳道為纖維蛋白原，2泳 道為白唇竹葉青蛇毒降纖酶水解5分鐘后的纖維蛋白原，3泳道為白唇竹葉青蛇 毒降纖酶水解0.5小時后的纖維蛋白原，4泳道為白唇竹葉青蛇毒降纖酶水解2 小時后的纖維蛋白原。從上述實驗結果可得出本發明白唇竹葉青蛇毒降纖酶的有益效果在于 白唇竹葉青蛇毒降纖酶具有直接水解纖維蛋白原的作用，并且可同時水解 纖維蛋白原的A。鏈和B P鏈，而從其它蛇毒來源的降纖酶一般只能水解纖維蛋 白原的一種鏈，要么水解Aa鏈，要么水解B3鏈，同時水解二鏈的蛇毒降纖酶 很少。因此，本發明白唇竹葉青蛇毒降纖酶是一種從我國特有的藥用生物資源 中自己研制的具有可同時水解纖維蛋白原Aa鏈和B P鏈活性的金屬蛋白酶。
圖1是白唇竹葉青蛇毒降纖酶水解纖維蛋白原A a鏈和B P鏈的SDS-PAGE 圖譜；圖2是DEAE-SephadexA-25離子交換層析圖譜； 圖3是Sephadex G-100層析圖譜； 圖4是CM-Sephadex C-50離子交換層析圖譜；具體實施方式
實施例1(1) 白唇竹葉青蛇毒的預處理 采用咬皿采毒法從白唇竹葉青蛇采集蛇毒液，收集的白唇竹葉青蛇毒液集中后冷凍干燥制得毒粗毒凍干粉，取白唇竹葉青蛇毒粗毒凍干粉lg，溶于5ml pH 8.0, 0.05 mol Tris-HCl緩沖液中，用離心機以3000r/min離心10min，取上清液待 用； '(2) DEAE-SephadexA-25離子交換層析用濃度0.05mol/L， pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡SephadexA-25柱，層析 柱2cmx60cm;將步驟(l)中制得的上清液上樣，用濃度范圍0.6 mol/LNaCl 1000ml的0.05molTris-HCl緩沖液線性剃度洗脫，洗脫流速為0.25ml/min，(參 看圖2)將SephadexA-25柱層析分離出的I峰洗脫液冷凍干燥，溶解于3ml 0.6 mol/L Tris-HCl緩沖液中制得待用溶液；(3) DEAE-SephadexG-100凝膠層析用pH7.6， 0.01mol/LTris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sephadex G-100凝膠層析 柱，將步驟(2)中最后制得的待用溶液上樣，洗脫流速為0.14ml/min，(參看圖 3)將DEAE-Sephadex G-100凝膠層析柱分離出的I峰洗脫液冷凍干燥分離物 待用；(4) CM-Sephadex C-25陽離子交換層析用pH5.8 ，濃度0.01mol/L的NaAc緩沖液平衡CM-Sephadex C-50層析柱， 把步驟(3)最后得到的I峰冷凍干燥分離物上樣，用上述緩沖液洗脫， 一洗脫流 速為0.25ml/min。 CM-Sephadex C-50離子交換層析圖譜如圖4所示。實施例2(1) 白唇竹葉青蛇毒的預處理采用咬皿采毒法從白唇竹葉青蛇采集蛇毒液，收集的白唇竹葉青蛇毒液集 中后冷凍干燥制得毒粗毒凍干粉，取白唇竹葉青蛇毒粗毒凍干粉5g,溶于5ml pH 8.5， 0.06 molTris-HCl緩沖液中，用離心機以5000r/min離心12min,取上清液待 用；(2) DEAE-SephadexA-25離子交換層析用濃度0.06 mol/L， pH7.0的Tris-HCl緩沖液平衡SephadexA-25柱，層 析柱2 cm x 60 cm;將步驟(1 )中制得的上清液上樣，用濃度范圍O.Ol mol/LNaCl 1000ml的0.06molTris-HCl緩沖液線性剃度洗脫，洗脫流速為0.30ml/min,將 SephadexA-25柱層析分離出的I峰洗脫液冷凍干燥，溶解于3ml 0.01 mol/L Tris-HC慮沖液中制得待用溶液；(3) DEAE-SephadexG-lOO凝膠層析用pH8.5， 0.02mol/LTris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sephadex G-100凝膠層析 柱，將步驟(2)中最后制得的待用溶液上樣，洗脫流速為0.17ml/min，將 DEAE-Sephadex G-100凝膠層析柱分離出的I峰洗脫液冷凍干燥分離物待用；(4) CM-Sephadex C-25陽離子交換層析用pH 6.5 ，濃度0.011mol/L的NaAc緩沖液平衡CM-Sephadex C-50層析柱，把步驟(3)最后得到的I峰冷凍干燥分離物上樣，用上述緩沖液洗脫，洗 脫流速為0.20ml/min。收集主峰即可。實施例3(1) 白唇竹葉青蛇毒的預處理采用咬皿采毒法從白唇竹葉青蛇采集蛇毒液，收集的白唇竹葉青蛇毒液集 中后冷凍干燥制得毒粗毒凍干粉，取白唇竹葉青蛇毒粗毒凍干粉2.5g，溶于5ml pH 7.5, 0.04 molTris-HCl緩沖液中，用離心機以4500r/min離心8min，取上清液 待用；(2) DEAE-SephadexA-25離子交換層析用濃度0.04 mol/L， pH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡SephadexA-25柱，層 析柱2 cm x 60 cm;將步驟(1)中制得的上清液上樣，用濃度范圍0.6mol/LNaCl 1000 ml的0.04mo1 Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫，洗脫流速為0.20ml/min，將 SephadexA-25柱層析分離出的I峰洗脫液冷凍干燥，溶解于3ml 0.6mol/L Tris-HCl緩沖液中制得待用溶液；(3) DEAE-SephadexG-lOO凝膠層析用pH 7.5， 0.01mol/L Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sephadex G-100凝膠層析 柱，將步驟(2)中最后制得的待用溶液上樣，洗脫流速為0.11ml/min，將 DEAE-Sephadex G-100凝膠層析柱分離出的I峰洗脫液冷凍干燥分離物待用；(4) CM-Sephadex C-25陽離子交換層析用pH 5 ，濃度0.009mol/L的NaAc緩沖液平衡CM-Sephadex C-50層析柱， 把步驟(3)最后得到的I峰冷凍干燥分離物上樣，用上述緩沖液洗脫，洗脫流 速為0.30ml/min。收集主峰即可。
權利要求
1. 白唇竹葉青蛇毒降纖酶，其特征是從我國白唇竹葉青蛇的毒液中分離純化得到的一種金屬蛋白酶，并具有同時降解纖維蛋白原Aα鏈和Bβ鏈的活性，其在聚丙烯酰胺凝膠電泳上的表觀分子量還原和非還原條件下為66300道爾頓。
2、 一種白唇竹葉青蛇毒降纖酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 白唇竹葉青蛇毒的預處理收集的白唇竹葉青蛇毒液集中后冷凍干燥 制得粗毒凍干粉，取白唇竹葉青蛇毒粗毒凍干粉l 5g，溶于5ml pH 7.5 8.5， 0.04 0.06 mol Tris-HCl緩沖液中，用離心機以3000 5000r/min離心8 12min，取上清液待用；(2) DEAE-SephadexA-25離子交換層析用濃度0.04 0.06mol/L， pH7.0 8.0的Tris-HCl緩沖液平衡 SephadexA-25柱；將步驟(1)中制得的上清液上樣，用濃度范圍0.01 0.6 mol/L NaC1 1000ml和0.04 0.06 mol Tris-HCl緩沖液線性剃度洗脫，洗脫流速為 0.20 0.30ml/min，將SephadexA-25柱層析分離出的I峰洗脫液冷凍干燥，溶解 于3ml 0.01 0.6mol/LTris-HCl緩沖液中制得待用溶液；(3)' DEAE-Sephadex G-100凝膠層析用pH 7.5 8.5， 0.01 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sephadex G-100凝膠層析柱，將步驟(2)中最后制得的待用溶液上樣，洗脫流速為0.11 0.17ml/min，將DEAE-Sephadex G-100凝膠層析柱分離出的I峰洗脫液冷凍干 燥分離物待用；(4) CM-SephadexC-25陽離子交換層析 用pH 5 6.5 ，濃度0.009 0.011mol/L的NaAc緩沖液平衡CM-Sephadex C-50層析柱，把步驟(3)最后得到的I冷凍干燥待用分離物上樣，用上述緩沖 液洗脫，洗脫流速為0.20 0.30ml/min。
3、白唇竹葉青蛇毒降纖酶作為制備治療血栓疾病的應用。
全文摘要
本發明白唇竹葉青蛇毒降纖酶及其制備方法和在制藥中的應用，屬生物醫學領域。白唇竹葉青蛇毒降纖酶，是從我國產的白唇竹葉青蛇的毒液中分離純化得到的一種金屬蛋白酶，并具有同時降解纖維蛋白原Aα鏈和Bβ鏈的活性，其在聚丙烯酰胺凝膠電泳上的表觀分子量還原和非還原條件下為66300道爾頓。其制備方法包括以下步驟(1)白唇竹葉青蛇毒的預處理；(2)DEAE-Sephadex A-25離子交換層析；(3)DEAE-Sephadex G-100凝膠層析；(4)CM-Sephadex C-25陽離子交換層析。白唇竹葉青蛇毒降纖酶具有較強的同時降解纖維蛋白原Aα鏈和Bβ鏈的活性，作為制備治療血栓疾病的應用。
文檔編號A61P7/00GK101280296SQ200810069758
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月28日 優先權日2008年5月28日
發明者余曉東, 敏 鄧 申請人:重慶師范大學