專利名稱：一種人類同種異體細胞提取液及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人類同種異體細胞提取液，屬于細胞生物學、分子生物學、免疫學與人體保健領域。
背景技術：
人體由各個系統組成，系統由各種組織組成，組織則由各種細胞 組成。有生命的機體內各個細胞時時刻刻都在進行著新陳代謝，并保 持正常的自我穩態調節功能才能維持正常的內環境并抵抗來自外界 的各種致病因子的侵襲而不產生疾病。而細胞進行新陳代謝并保持自 我穩態需要消耗各種能源物質。如核酸、氨基酸、微量元素、酶類、 免疫蛋白、各種細胞生長因子、多型膠原成分等。
我們通過嚴格的流程選取人類同種異體組織細胞，通過嚴格的流 程選取人類同種異體組織細胞，經體外細胞培養，成為含有多種生物 學活性成分的細胞。采用超低溫萃取技術分離出細胞液，對細胞液中 的細胞進行物理破壁處理后，將細胞的胞漿和細胞核中的核酸、多種 短肽、多肽細胞因子、多種氨基酸、微量元素等釋放到細胞液中，使 細胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋白、細胞生長因子群、多型 膠原成分等。可將其制備成具有細胞生物學活性功能的制劑，作用于 人體后可提高機體細胞代謝功能、增強機體免疫力，并可改善皮膚彈
性與光澤等功效。通過各項安全性檢測未見毒副作用。
核酸、氨基酸和微量元素等合成蛋白質的基本物質，可提高細胞 質量，使酶系統保持像正常的催化功能；天然免疫蛋白可以抵御和修 復機體自身和自然界對機體細胞的損傷；具有刺激細胞生長作用的細 胞生長因子群(包括轉化生長因子-P、表皮細胞生長因子、血管內皮 細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、干細胞生長因子等)，對機體 細胞(含干細胞)的增殖與分化和新陳代謝、提高新生細胞所占比例、 替代更新原有的因衰老或病理性等因素所造成組織細胞的衰退和老 化等具有關鍵作用。由于機體細胞的新陳代謝被細胞因子群調控至最 佳狀態，機體細胞保持水分的能力也大大增強。多型膠原成分，可促 進真皮層內纖維母細胞增殖、成纖維母細胞合成和分泌更多膠原蛋 白，修復老化受損的膠原纖維與彈性纖維，還原肌膚彈性，使皮膚均 勻緊致。在細胞因子群調控下，誘導皮膚真皮組織內間充質干細胞定 向增殖分化為成纖維細胞，成纖維細胞的數量大大增加進而成源源 不斷分泌自體膠原蛋白。這種自體成纖維細胞在真皮下合成和分泌的 自體膠原蛋白能更好地與機體組織融合，使膠原蛋白重新支撐起皮 膚，真皮層厚度和密度增加，進而消除皺紋，使老化的皮膚重新恢復 彈性與光澤。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的不足，提供一種用于人體保 健和美容的人類同種異體細胞提取液。
本發明的另一個目的是提供上述細胞提取液在制備用于提高機
體細胞代謝功能或增強機體免疫力的藥物或保健品中的應用。 一種人類同種異體細胞提取液，由如下步驟制備而成
(1) 選取健康產婦新鮮胎盤、臍帶及其他同種異體組織；
(2) 將原料剪碎放置于容器中，用去熱原水將剪碎組織清洗，
瀝干；
(3) 加入注射用水，開啟勻漿機以8000 10000轉/分的轉速勻
漿；
(4) 將勻漿液分裝到血袋中，封口，將分裝得到血袋經平衡后， 置于離心機內2500 3000轉/分離心，取上清液；
(5) 將上清液經50kD的中空纖維柱超濾，濾出液用50kD的中 空纖維柱再次超濾，收獲濾液，即為原液；
(6) 除菌，滅活病毒。
本發明制得的人類同種異體細胞提取液含有核酸、氨基酸、天然 免疫蛋白、細胞生長因子群、多型膠原成分等的細胞液。該細胞液能 提高機體細胞代謝功能和增強機體免疫力。可制成注射針劑、涂劑、 膏劑、霜劑或粉劑。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果 本發明通過嚴格的流程選取人類同種異體組織細胞，經體外細 胞培養，成為含有多種生物學活性成分的細胞。采用超低溫萃取技術 分離出細胞液，對細胞液中的細胞進行物理破壁處理后，將細胞的胞 漿和細胞核中的核酸、多種短肽、多肽細胞因子、多種氨基酸、微量 元素等釋放到細胞液中，使細胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋
白、細胞生長因子群、多型膠原成分等。制得的細胞液可開發成具有
細胞生物學活性功能的制劑，作用于人體后可提高機體細胞代謝功
能、增強機體免疫力，并可改善皮膚彈性與光澤等功效。通過各項安
全性檢測未見毒副作用。
具體實施例方式
實施例1
1. 從事細胞提取液生產人員應具備醫學或生物學知識，且上崗前 手過嚴格操作培訓。
2. 生產環境分離室潔凈度要求為整體萬級，局部百級。
3. 生產設備高速勻漿機、離心機(5810R)、水浴箱、干燥箱、封蓋 機(置于車間內)、超凈臺、血液分離夾、高頻電耦封口機、澄明度
檢測臺、電子稱、PH計、冰箱、冰柜、真空泵、超凈工作臺。
4. 生產用具量筒、燒杯、鑷子(大，中，小號)，剪刀兩把、止血
鉗、不銹鋼托盤、微量移液器(1000ul， 100ul， 10ul)、 30KD超濾管、 酒精燈、封口膜、打火機、西林瓶、瓶塞、瓶蓋、酒精噴壺500ml、 廢液缸、普通天平。
5. 易耗品75%酒精、針式過濾器、無菌副壓抽濾瓶、注射器(50ml、 20ml)、去離子水、注射用水、微量移液器吸嘴(1000ul、 200 ul、 10 ul)、 45ml無菌無熱原離心管、200ml血袋、醫用紗布、鱟試劑及檢 測用水、病毒檢測試劑(HBs、抗-HCV、抗-HIVl/2、梅毒檢測試劑)、 棉簽、84消毒液、生理鹽水、無菌無熱原不銹鋼盆。生產用源符合 飲用水標準;純化水及注射用水符合現行《中國藥典》標準。
6. 原材料的購買、運輸、接收、儲存及質量控制
符合現行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔材料質控標準》的 要求。
6.1選取健康產婦新鮮胎盤、臍帶及其他同種異體組織。凡患有肝炎、 惡性腫瘤、免疫缺陷病、艾滋病、各種傳染病、人工流產、死胎、各 種畸形兒之胎盤及臍帶等組織不得使用；肉眼檢測外觀不正常或有腐 臭變質的胎盤、臍帶等組織不得使用。
6.2胎盤娩出后，立即由接生人員用無菌操作放入滅菌容器(食品級 塑料袋)內，并立即冷藏(10。C以下)，在收集運輸過程中也應冷藏。收 集的胎盤學逐支用國家藥品管理當局批準的試劑盒進行抗-HBs、抗 -HBc等項檢測。
6.3 HBV標志物陰性胎盤，再進行抗-HCV、抗-HIV-l/HIV-2和梅毒
檢測，陰性者為合格胎盤。
6.4檢出合格的胎盤應于-2(TC凍存,并在胎盤娩出后6個月內投入生產。
7. 制備流程
按中國《藥品生產質量管理規范》要求實施。 7.1將生產設備放置于車間的適當位置，檢查所有生產設備的運行情 況，填寫報告；
7.2器械和設備的清潔及無熱原處理
7.3將2000ml燒杯1個、500m 14個按清洗操作規程洗凈后用錫箔紙 封口放置于干燥箱內250°C加熱1小時，待冷卻后取出并置于超凈臺
內紫外消毒備用。
將高速勻漿機轉子、剪刀用1 %的84消毒液浸泡1小時后，用無熱原水清洗5遍并置于超凈臺內紫外消毒備用。
7.4將高速勻漿機用75°/。酒精擦拭消毒置于超凈臺內消毒。
7.5將用200倍稀釋的84消毒液浸泡12小時的超濾管(30kd)用去離子水清洗5遍，再用注射用水清洗5遍，置于超凈臺內瀝干備用。
7.6西林瓶及瓶塞、瓶蓋的處理按照相應清洗操作規程嚴格執行。
7.7將微量移液器吸嘴(1000 ul、 200 ul、 10ul)、棉簽、醫用紗布1包、鑷子(大，中，小各兩把)，剪刀兩把、止血鉗10把、不銹鋼托盤3個高壓滅菌121 °C， 30分鐘，烘干備用。
7.8開啟車間紫外燈消毒1小時。
7.9將原料放置于4 'C解凍12小時，使用無熱原錫箔紙稱取對應重 量的原料，用剪刀剪碎組織至每塊大小為2x2x2cm3，將剪碎組織 放置于500ml燒杯中。用去熱原水將剪碎組織清洗3次，每次用水量 為剪碎組織的3倍，洗后瀝干。
7.10在瀝干后的組織中加入1.5倍于組織的注射用水，開啟勻漿機以 8000 10000轉/分的轉速勻漿2分鐘。
7.11將勻漿液用50ml注射器分裝到200ml血袋中，高頻電耦封口機 封口。
(以上操作均在超凈臺內無菌操作) 7.12將分裝得到的200ml血袋經平衡后，置于離心機內2500 3000 轉/分離心30分鐘，并于血液分離夾上操作并取上清液；將上清液經
50kD的中空纖維柱超濾，濾出液用50kD的中空纖維柱再次超濾， 收獲濾液，即為原液。
7.13將超濾管置入45ml離心管內，于超凈臺內將收集的離心上清液 加入超濾管中，每管不超過5ml離心，3000轉/分離心15分鐘； 7.14取出超濾液置于45ml無熱原離心管內，經0.22|im微孔濾膜過 濾除菌2次；
(以上細胞液提取工作均置于冰袋之上進行低溫操作) 7.15進行60'C水浴加溫10小時滅活病毒10小時。 8.體外細胞培養 8.1體外培養環境
工作環境要求清潔、空氣干燥和無煙塵。 8丄1無菌培養室的空氣等徹底消毒，所有操作均要嚴格實行無菌 操作，各種物品拿入操作臺前應消毒，用灑精擦表面，用前于紫外線 照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打開培養管前須在火焰上烙燒一 下瓶口以使灰塵固定，操作時須將瓶、管斜放，吸管注入液體應避免 和瓶口接觸，操作時禁止講話。
8丄2溫度組織培養的最適溫度為35-37。C，偏離這一溫度范圍，細 胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導致死亡。培養細胞對低溫 的耐受力比高溫強。溫度增加2-3"C對細胞產生不良影響，使之在24 小時死亡，溫度在43"C以上，細胞大多被殺滅，而低溫對細胞影響 較小，細胞置于25-35'C時，細胞仍能生存和生長，但速度緩慢，放 在4'C數小時之后，再置37'C培養，細胞仍能繼續生長。
8丄3.氣體所需的氣體主要有02和C02。 02參與三羧酸循環產生能 量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。C02既是細胞代謝產物也是
細胞所需成分。它主要與維持培養液pH值有直接關系。 8丄4pH值多數細胞的適宜pH值為7.0-7.4，偏離此范圍對細胞可 產生有害的影響。培養液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽緩沖對。 8丄5.培養器皿的處理大多數細胞屬于貼壁依賴性細胞或培養物。 玻璃器皿須用清潔液浸泡1至7天，清水沖洗20次后再用蒸餾水過 洗2次，烤干備用。用前160'C高溫消毒2小時后使用。 8.2傳代細胞的靜置培養
每天要仔細觀察細胞的生長情況來決定是否要換液或傳代。用倒 置顯微鏡對活細胞形態、胞槳和胞膜進行觀察。生長狀態良好的細胞 透明度大，細胞內顆粒少，看不見空泡，胞膜清晰，折光性強。培養 上清液清晰透明，看不見懸浮的細胞和碎片。細胞機能不良時，胞質 中常出現空泡，脂滴和其它顆粒狀物，細胞之間空隙加大，細胞形態 可變得不規則，甚至失去原有的特點。只有狀態良好的細胞才能用來 做實驗。 一般在細胞接種或傳代后，每天或至多間隔l-2天，應觀察 細胞形態、細胞生長、培養液PH值和污染與否等，隨時掌握細胞動 態變化，以便于做換液或傳代處理。如發現異常情況，及時采取措施。 正常情況下，培養液呈桃紅色，用一般溫箱培養時，隨細胞生長時間 的延長，二氧化碳積累增多，由于培養基內有PH指示劑的存在，其 顏色可間接反映細胞的生長狀態。呈橙黃色時，細胞一般生長狀態較 好；呈淡黃色則可能是培養時間過長，營養不足，死亡細胞過多；呈
紫紅色則可能是細胞生長狀態不好或已死亡。
8.3培養細胞的保存和復蘇 8.3.1影響凍存細胞活性的因素
S.3丄l細胞凍存保護劑常用的有二甲基亞砜(DMSO)和甘油，常 用的濃度為5%-10% (90%小牛血清)。DMSO對二倍體細胞的毒性 較甘油小。
8.3.1.2細胞懸液的凍結速度慢凍時冰凍在細胞外形成，因此不致損 害細胞。多數細胞以每分鐘下降rC的速度，降至-2(TC凍結。均可獲
得滿意效果。
8.3丄3保存溫度液氮罐，可達到-196'C，此時所有的物理化學活動 均降至最低限度，以保證細胞長期保存。
8.3丄4復蘇急速融化復蘇可防止損害細胞。凍結細胞從液氮中取出 后，應立即放入37。C 43。C的水浴中，30秒至一分鐘內融化。 8.3.2.凍存與復蘇方法
8.3.2.1細胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用凍存液稀至2 5X106/ml。 8.3.2.2分裝于2ml凍存管中，裝量lml，封口，作好標記，用幾層紗 布扎好。
8.3.2.3凍存管進入液氮前應有一個漸降溫的過程，以rC/min的速度 降溫， 一般掛在液氮上空8小時后，投入液氮貯存罐中長期保存。 8.3.2.4為使凍存的細胞復蘇，將凍存管置于37。C 43。C水浴中，充 分搖動使其急速融化，30秒至1分鐘內完成。
8.3.2.5細胞懸液低速離心，去除上清中的保護添加劑，加入原來使用
的生長液，置37'C培養。 8.4.試劑
8.4.1將1640溶于新蒸的三次蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，過濾除 菌即可。
8.4.2小牛血清用前56°CX30分鐘滅活(破壞補體)分裝置-2(TC保存備用。
8.4.3青鏈雙抗液將100萬單位的青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素用高壓2 次后的三蒸水100ml充分溶解，分裝凍存于-20。C，使用前融化，每 100ml生長液中加lml，即使用終濃度為含RS 100pg/ml。(注P.S
不能凍融多次，應少量分裝， 一次用完)。
8.4.4使用NaHC03液調整pH值，常用濃度為5 6%，配制用三蒸 水溶解后過濾除菌或高壓滅菌，分裝4'C保存。 8.4.5胰蛋白酶:在pH 8.0，溫度37"C時作用力最強。 8.4.6 EDTA液
8.4.7細胞凍存液小牛血清90%與二甲基亞砜(DMSO) 10%混合; -2(TC冰箱保存備用。或小牛血清30%， 1640培養液60%， DMSO10c/o 混合;-2(TC冰箱保存備用。 10.檢測
按2000年版規程附錄《生物制品化學及其他檢定方法》進行. 10.1無菌實驗按2002年版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A 項進行；
10.2內毒素檢測按2002年版規程通則《生物制品細菌內毒素試驗
規程》進行。滴度應低于l: 500;細胞內毒素含量應不高于5EU/ml; 10.3病毒檢測各項指標為陰性；
10.4熱原質試驗按2002年版規程通則《生物制品熱原質試驗規程》 進行；
10.5異常毒性試驗按2002年版規程通則《生物制品異常毒性試驗 規程》進行.
10.6指紋圖譜檢測SDA-PAGE法分析應出現3條主要帶；66kd 23kd 10kd
10.7蛋白檢測應在lg/L左右；
10.8 PH:為6.7 7.3;
10.9多肽含量用BCA法測定，應不低于1.0mg/ml; 10.10核酸含量應不低于800pg/ml
10.11顏色應為無色或微黃澄明液體，不應有異物、渾濁或沉淀。
11. 分批
按2002年版規程通則《生物制品分批規程》進行。
12. 分裝
按2002年版規程通則《生物制品分裝規程》進行。 12.1將經檢測合格原液調整至相應濃度后，使用0.22um過濾器連續 過濾2次并將濾液置于45ml離心管；
12.2使用1000ul微量移液器，吸取濾液分裝至西林瓶，每瓶2.2ml， 加蓋膠塞及鋁塑；
(以上分裝過程須在超凈臺內進行)
12.3將加蓋膠塞及鋁塑蓋的西林瓶置于封蓋機上封口。
13. 規格每支裝量2ml不等。多肽含量應不少于2mg/支。
14. 入庫經澄明度檢測合格后，貼好標簽放置于2t:-8t:的條件下保
存，做好相關記錄。
15. 保存、運輸及有效期2.8'C避光保存及運輸,自胎盤投料之日起有 效期為2年.
16. 注射用針劑的使用
16.1準備好一次性塑料注射器(5ml規格，配備相應針頭)，
16.2核對好注射劑名稱、型號，核查被注射者的姓名及適用指證，用 注射器抽吸注射劑5ml。
16.3囑被注射者取臥位或坐位,囑病人靜止不動，肌肉放松。注射部 位常取一側臀部外上1/4區(在骶骨尖處引一水平線，再以髂后上棘 與脊柱距離之中點作一垂直線與水平線相交，將臀部分為4個區)。 取消毒醫用棉球蘸取適量酒精(濃度75%)，先后由該注射點為圓心 逐漸向外周旋轉擦拭，使用四根以上酒精棉球重復以上消毒過程。
16.4左手拇指與食指繃緊注射部位皮膚，右手持注射器使針頭與皮膚 垂直，迅速刺入肌層，針頭刺入深度約2-3CM(根據不同部位及病人 胖痩而定，針頭不能全部刺入)。然后左手拇指與食指固定針頭，右手 回抽注射器內栓。若回抽有一定阻力且無回血，即可將藥液緩慢推入 (為小兒注射推藥要稍迅速)；若有回血，可將針頭拔出少許再行試 抽。推藥完畢迅速拔出針頭，以無菌干棉球按壓針眼片刻，不要立即
用手按揉。
17.皮膚外用涂劑及液體的使用
17.1晨起后或晚睡前取適量溫水(37t:左右)濕潤皮膚1-2分鐘，滴 取潔面乳液適量至手心揉勻，輕輕揉搓面部或其他皮膚部位約3分鐘 后，取適量溫水(37"C左右)清洗潔面乳揉搓的部位。
17.2晨起后用潔面乳清潔面部后，分別取活膚日霜、去鈹霜、美白 霜等各適量，均勻輕輕涂抹至面部或其他皮膚部位；或單獨應用以上 皮膚外用涂劑。
17.3晚睡前用潔面乳清潔面部后，取活膚乳液適量，均勻輕輕涂抹 至面部或其他皮膚部位。
17.4晨起后或晚睡前用潔面乳清潔面部后，分別用活膚液配備的取 液管(側面撕開鋁蓋后取下密封膠塞，套上取液管)取活膚液lml 均勻涂抹面部,輕微按摩至充分吸收。2-3分鐘后再次熱敷1分鐘，取 活膚液lml均勻涂抹面部肌膚，輕微按摩3分鐘，使其充分吸收。每 支在打開瓶蓋后未一次性使用完畢，扣嚴膠塞后置4'C至8"C冷藏箱 保存，每支儲存不超過24小時。每使用14ml (7支)后，間隔3天 再次使用活膚液。取液管用后請用清水沖洗干凈放置盒內備用。
權利要求
1. 一種人類同種異體細胞提取液，其特征在于由如下步驟制備而成(1)選取健康產婦新鮮胎盤、臍帶及其他同種異體組織；(2)將原料剪碎放置于容器中，用去熱原水將剪碎組織清洗，瀝干；(3)加入注射用水，開啟勻漿機以8000～10000轉/分的轉速勻漿；(4)將勻漿液分裝到血袋中，封口，將分裝得到血袋經平衡后，置于離心機內2500～3000轉/分離心，取上清液；(5)將上清液經50kD的中空纖維柱超濾，濾出液用50kD的中空纖維柱再次超濾，收獲濾液，即為原液；(6)除菌，滅活病毒。
2. 權利要求1所述細胞提取液在制備用于提高機體細胞代謝功能 或增強機體免疫力的藥物或保健品中的應用。
3. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物的劑型為注射
全文摘要
本發明公開了一種人類同種異體細胞提取液及其應用。本發明通過嚴格的流程選取人類同種異體組織細胞，經體外細胞培養，成為含有多種生物學活性成分的細胞。采用超低溫萃取技術分離出細胞液，對細胞液中的細胞進行物理破壁處理后，將細胞的胞漿和細胞核中的核酸、多種短肽、多肽細胞因子、多種氨基酸、微量元素等釋放到細胞液中，使細胞液中富含核酸、氨基酸、天然免疫蛋白、細胞生長因子群、多型膠原成分等。制得的細胞液可開發成具有細胞生物學活性功能的制劑，作用于人體后可提高機體細胞代謝功能、增強機體免疫力，并可改善皮膚彈性與光澤等功效。通過各項安全性檢測未見毒副作用。
文檔編號A61K35/48GK101380332SQ20081021179
公開日2009年3月11日 申請日期2008年9月25日 優先權日2008年9月25日
發明者敏 陸 申請人:浙江金時代生物技術有限公司