人類子宮頸干細胞群及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于分離干細胞的方法，所述方法包括由子宮頸組織制備細胞懸 浮液，涉及由所述方法分離的干細胞，并且涉及從所述干細胞的培養物獲得的條件培養基 (條件培養液，conditioned medium)。本發明還涵蓋所述干細胞或條件培養基在用于治療 或預防癌癥、炎性疾病、自身免疫性疾病慢性病癥或感染性疾病，以及用于美容治療中的應 用。因此，本發明涉及干細胞及其治療或美容用途的領域。
【背景技術】
[0002] 干細胞的特征在于其自我更新和沿多譜系途徑分化的能力。一種特別有前景的類 型的用于治療應用的成體干細胞是所謂的間充質干細胞（MSC)。MSC，也被定義為多能間充 質基質細胞，是在體外作為塑料貼壁細胞增殖的細胞的異質群體，具有成纖維細胞樣形態， 在體外形成集落，并且可以分化成中胚層譜系的細胞，如骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，以 及其他胚胎譜系的細胞。
[0003] 干細胞被認為存在于微環境（小生境，niche)中，其調節干細胞自我更新和組織 再生之間的平衡。干細胞微環境的概念最初參照哺乳動物造血描述，其中微環境代表了容 納造血干細胞并保證其繼續存在的專門的微環境。已經提出，微環境中的具有其分泌產物 的支持細胞會與干細胞行為相互作用并控制干細胞行為。為了支持干細胞的活性，根據該 模型，微環境內的條件在沒有任何外部激活線索的情況下將有利于維持干細胞靜止，但會 促進將需要出現的祖細胞的增殖和成熟，并且還將確保干細胞池的自我更新。
[0004] 一些作者已經報道了在來源于胚胎中胚層的軟組織中存在多能成體細胞的不同 群。例如，已經報道了多能細胞可以從哺乳動物的骨骼肌和其他結締組織、從人類脂肪 (lipoaspirated)組織或從骨髓中獲得[所謂的多能成體祖細胞（MAPC)]。原則上，所有這 些分離的細胞群可以以與骨髓的MSC相似的方式用于結締組織的修復和再生。然而，除了 MAPC，到目前為止，這些群均沒有在表型水平被充分地表征。因此，盡管已經描述了在不同 的結締組織中存在多能成體細胞，但是在本領域的當前狀態，不可能識別和明確區分從軟 組織中獲得的不同的多能細胞類型，或者不可能獲得基本上純的群。目前，干細胞的表型特 征包括標記物的確定，尤其是如細胞表面受體；以及在體外培養中它們的分化能力的確定。 每種細胞類型具有表面標記物的某種組合，也就是說，它具有表達的某種分布，其表征了該 特定細胞類型，從而將其與其他區分開。
[0005] 成體干細胞的理想來源是在其中它們可以通過簡單的、非侵入性的方法獲得的來 源和允許足夠數量細胞被分離的來源。特別是，來源應提供干細胞，該干細胞在沒有重大風 險和不適的情況下可以容易地從活的受試者分離，并且該來源應該允許高產率以從其他細 胞類型以最小的污染獲得，而沒有過高的分離和培養的成本。
[0006] 雖然骨髓（BM)已經是用于多能MSC的分離的主要來源，脂肪組織是該細胞的另一 來源，但是BM和脂肪組織的收獲是高度侵入性的過程。一個可替換的來源是臍帶血，其可 以通過微創程序來獲得，而不損害母親或嬰兒。在各種其他人類成體組織（包括胎盤、頭皮 組織和腸干細胞）中識別了 MSC的其他來源。從BM、脂肪組織或臍帶血液（UCB)分離的所 有細胞表現出典型的MSC特征：成纖維細胞形態、集落形成單位-成纖維細胞（CFU-F)的形 成、多能分化能力和一組典型的表面蛋白的表達。而來自三個來源的MSC表達了經典的MSC 標記蛋白，觀察到關于⑶90、⑶105和⑶106的表達的顯著差異。因此，MSC依據其來源可 以顯示出不同的表型。
[0007] 獲得骨髓的過程是痛苦的且產量非常低，通過體外擴增使細胞的數量顯著增加是 必要的，以獲得臨床相關量。這個步驟增加了成本且使得該過程耗費時間，以及增加了材料 的污染和損失的風險。由于這些原因，非常期望能夠從除了骨髓的間充質組織中分離多能 細胞。特別是，鑒于它們的手術可及性，方便的是能夠從非骨軟骨中胚層組織中分離細胞， 如但不限于，皮膚、脂肪和肌肉組織。
[0008] 因此，在現有技術中存在通過非侵入性和無痛收獲來提供干細胞的可替代來源的 必要性。在這個意義上，子宮可以是干細胞的來源。然而，子宮是一個被分成不同部分的復 雜器官。具體地，人類子宮是一個纖維肌性器官，其可分為上肌子宮體和延伸到陰道中的下 纖維子宮頸。子宮體分為子宮底和子宮下段（或峽部），其大約在子宮動脈的過程和子宮頸 內口的水平。子宮頸是一個窄的圓柱形通道，在其下端其與陰道連接，且在其上端，子宮頸 變寬以形成子宮下段（峽部）；子宮下段進而加寬至子宮底（圖18)。在婦科檢查期間可以 從陰道內看見的子宮頸的下端被稱為外宮頸。在外宮頸中心的開口（其被稱為外口）打開 以允許子宮和陰道之間的通路。宮頸內膜環繞子宮頸內腔，其是通過子宮頸從外口進入子 宮的通道（圖19)。宮頸內膜和外宮頸之間的重疊邊界被稱為轉化區。轉化區是其中優選 收集本發明的干細胞的區域。
[0009] 著名的加拿大組織學家Arthur Worth Ham，在他的教科書"Histology"（Ham, A. W. and Cormack，D. H. Ham，s Histology, 9th ed. Philadelphia:Lippincott，1987)(由許多 從業者推崇的不可或缺的參考文獻）中描述了子宮體和子宮頸的不同的組織層。人類子宮 體由以下三個組織層組成：1)稱為子宮內膜的內層是最活躍的層，并響應于循環性卵巢激 素的變化；子宮內膜是高度專門化的并且是月經和生殖功能必不可少的（來源于這個組織 層的子宮內膜干細胞）；2)中間層，或子宮肌層，構成了子宮體積的大部分，且是肌肉層，主 要由平滑肌細胞組成（來源于這個組織層的子宮肌層干細胞）；以及3)子宮的外層，漿膜 或子宮外膜，是一薄層由包住子宮的上皮細胞制成的組織。然而，子宮頸壁和內襯管的膜均 具有與子宮體不同的特性。事實上，子宮頸壁主要由結締組織構成。子宮頸由被稱為黏膜的 內襯組成，其由薄的、平坦的、鱗片狀的被稱為鱗狀細胞的細胞和稱為漿膜（光滑覆蓋物） 的外襯組成。此外，子宮體的連接子宮頸的部分的壁，稱為子宮下段或峽部，主要由平滑肌 構成。因此，組織學并且于是子宮的這兩個部分（包括子宮下段的子宮體以及子宮頸）的 功能是不同的。
[0010] 國際申請W02011/042547公開了一種方法，用于從子宮肌層組織（特別地從子宮 頸上方的區域）提供干細胞，稱為子宮體，其包括子宮底和子宮下段。而且，作者提到子宮 肌層的外植體（explant)通過脫落而取自子宮體的子宮下段。因為如上所述，子宮下段是 子宮頸的上端和在解剖學和組織學上與子宮頸不同的子宮體的考慮部分。然而，傳統地已 知，下部子宮體的壁主要是由子宮肌層組織構成，因為子宮內膜層降低至該水平。盡管如 此，子宮頸的外壁主要由結締組織構成。因此，不可能通過淺表細胞學取樣從子宮頸獲得子 宮肌層組織。因此，通過侵入性方法（如活組織檢查、子宮肌層組織切片、子宮肌層移植體 或如子宮脫落物）獲得生物材料，這需要一個高等級的脫落物以獲得子宮肌層。因此，在用 于分離子宮肌層前體之間將子宮內膜、漿膜、脂肪和纖維組織的組織樣本進行修整。在國際 申請W02011/042547中描述的干細胞群體表達了表面標記，如⑶31、⑶34和HLA-DR，其是 來自造血譜系的表面標記。相反，間充質干細胞不表達這些造血標記。
[0011] Baege Astrid C 和合作者（Baege Astrid C 等人? Proc Amer Assoc Cancer Res Annual Meeting.Vol 47,2006:938)公開了推定的上皮干細胞的分離，其不同于間充質干 細胞。重要的是注意到，本文公開的細胞群體與在人類乳頭瘤病毒誘導的宮頸癌的潛在作 用相關聯。
[0012] 此外，Maruyama T 等人（Maruyama T 等人? Reproduction ;2010 ;140:11-22)公開 了在子宮的生理學和病理學中子宮內膜和子宮肌層干細胞/祖細胞的作用，然而，該文獻 沒有提及到間充質宮頸干細胞。正如上面已經提到的，子宮肌層是子宮體的中間層，它構成 了子宮體積的大部分且是肌層，其主要由平滑肌細胞組成。
[0013]另一方面，Lopez J 等人（L6pez J 等人? Open Virol J. 2012 ;6:232-240)和 Xiaochun S 等人（Xiaochun S 等人.Cell Biol Int. 2011;35:119 - 123)公開了從人類子 宮癌分離和識別的干細胞。這些干細胞的缺點是它們有助于腫瘤的生長。在這個意義上， 已描述了（Ramasamy R等人，Leukemia, 2007)間充質干細胞是癌癥干細胞微環境境的組成 部分，從而在支持腫瘤細胞的生長中起到至關重要的作用。因此，從癌癥組織分離的干細胞 與從正常組織分離的干細胞相比在腫瘤性能并且確實地在其他性能上顯示出差異。
【發明內容】
[0014] 本發明的作者已經發現，子宮頸組織（宮頸組織，子宮宮頸組織，uterine cervix tissue)可以被用作干細胞的來源。從該組織分離的細胞，稱為子宮頸干細胞（UCESC)，與 從其他組織分離的間充質干細胞相比顯示出了較高的抗炎活性、抗腫瘤能力、抗微生物活 性和生長速度，并且對于至少10個細胞通道能夠保持其功能性和穩定的核型（染色體組 型）。此外，干細胞的新來源允許通過非侵入性的和無痛的方法來分離間質干細胞，因為可 以只通過在一個常規的婦科檢查期間剝離所述器官來獲得所述組織。
[0015] 基于干細胞的這種新來源和從其獲得的細胞，本發明的作者已開發了以下發明方 面，其將在下面詳細地公開。
[0016] 本發明的方法
[0017] 如上所述，本發明的作者已經發現，子宮頸組織（優選地，非癌子宮頸組織）可以 被用作干細胞的來源。
[0018] 因此，在一個方面，本發明涉及一種用于分離干細胞的方法，在下文中，"本發明的 方法"，包括：
[0019] (a)由子宮頸組織制備細胞懸浮液，
[0020] (b)從所述細胞懸液回收所述細胞，
[0021] (c)在允許細胞增殖的條件下，在合適的細胞培養基中孵育所述細胞，和
[0022] (d)選擇干細胞。
[0023] 步驟（a)-(d)可以通過本領域技術人員已知的常規技術進行。干細胞的這種新的 來源的一個附加優點是，它允許從動物體以非侵入性和無痛的方式來獲得干細胞。
[0024] 在本發明的上下文中，術語"非侵入性"是指一種過程，其中使用超出了用于婦科 檢查的常用工具的工具，皮膚不被破壞且體腔不被探測。在本發明的上下文中，術語"無痛" 是指一種過程，該過程不會引起身體的疼痛。因此，本發明的方法是用于分離干細胞的非侵 入性和無痛的方法，因為所述干細胞所分離的來源是子宮頸。
[0025] 因此，在第一步驟[步驟（a)]中，本發明的方法包括由子宮頸組織制備細胞懸浮 液。
[0026] 術語"子宮頸組織"是指來自子宮頸的組織，即將子宮體和子宮腔與陰道分開的器 官。子宮頸是一個窄的圓柱形通道，在其下端其與陰道連接，且其在其上端，子宮頸變寬以 形成子宮下段（峽部）；子宮下段進而加寬至子宮底（圖18)。在婦科檢查期間可以從陰道 內可見的子宮頸的下端被稱為外宮頸。在外宮頸中心的開口（被稱為外口）打開以允許子 宮和陰道之間的通路。宮頸內膜環繞子宮頸內腔，其是通過子宮頸從外口進入子宮的通道 (圖19)。宮頸內膜和外宮頸之間的重疊邊界被稱為轉化區。轉化區是優選收集本發明的 干細胞的區域。
[0027] 為了從動物體內去除組織，可以通過本領域技術人員已知的任何常規方法來獲得 子宮頸組織，侵入性的（如活組織檢查）和非侵入性的方法（如宮頸的脫落）兩者。優選 地，在常規的婦科檢查期間通過剝落子宮頸來獲得子宮頸組織，其假定了獲得干細胞的非 侵入性和無痛的方式。子宮頸組織可以從任何合適的哺乳動物獲得，例如，牛、羊、豬、狗、 貓、馬、靈長類等，優選人類。
[0028] -旦獲得了子宮頸組織，優選地，在進行處理以從材料的其余部分分離本發明的 細胞之前洗滌該組織。在一個規程中，子宮頸組織保持在生理上相容的鹽水溶液（例如，磷 酸鹽緩沖鹽水（PBS))中或無血清培養基中。由于子宮頸組織的特殊性質，在一個具體實施 方式中，本發明的方法的步驟（a)包括酶促分解（解聚）子宮頸黏液。能夠分解子宮頸黏 液的任何酶（例如，膠原酶、分散酶、胰蛋白酶等）可以用于本發明的方法中。酶處理的量 和持續時間將根據所用的條件變化，但這樣的酶的使用在本領域中一般是已知的。可替換 地，或與這種酶處理相結合，子宮頸黏液可以使用其他處理來降解，如機械攪拌、聲波能、熱 能等。如果通過酶方法來完成降解，則期望中和在合適的時間段的酶，以最小化對細胞的有 害影響。
[0029] 降解步驟通常產生了凝集細胞的漿液或懸浮液和含有一般游離基質細胞的液體 部分（例如，紅血細胞、內皮細胞、成纖維細胞以及干細胞）。該方法中的下一階段[步驟 (b)]是從所述細胞懸浮液中回收所述細胞，這意味著從其余部分分離凝集細胞。這可以通 過離心來完成，其迫使細胞進入由上清液覆蓋的沉淀中。然后可以丟棄上清液并將沉淀懸 浮在生理上相容的流體中。此外，懸浮的細胞通常包括紅細胞，并在大多數規程中期望溶解 它們。用于選擇性地溶解紅細胞的方法在本領域中是已知的，并且可以使用任何合適的規 程（例如，在高_或低滲培養基中孵育，通過使用氯化銨溶解等）。當然，如果紅細胞被溶解， 則剩余的細胞然后應從溶解產物中分離，例如通過過濾、沉淀、離心或密度分離。可以一次 或連續多次地對懸浮的細胞進行洗滌、再次離心和再懸浮，以達到更高的純度。可替換地， 可以在細胞表面標記分布的基礎上或在細胞大小和粒度的基礎上分離細胞。
[0030] 在從細胞懸浮液中回收細胞之后，在允許細胞增殖的條件下，在適當的細胞培 養基中培養細胞[步驟（C)]。優選地，在適當的細胞密度和培養條件下使用合適的細胞 培養基，該細胞將在不分化的情況下被培養。因此，在合適的細胞培養基[例如，DMEM、 DMEM-F12、a-MEM、RPMI，通常補充有5-25% (例如20%)的適合的血清，如胎牛血清、胎 小牛血清、新生小牛血清、小牛血清、豬血清、羊血清、馬血清、人血清或人血清、因子、氨基 酸等]的存在下在固體表面上在不分化的情況下培養細胞，并在允許細胞增殖的條件下孵 育。培養條件（即，PH、溫度等）對于本領域技術人員來說是公知常識。優選地，在固體表 面上和在允許細胞粘附于所述固體表面并增殖的條件下培養細胞。
[0031] 如本文所用的，術語"固體表面"指的是允許本發明的細胞附著的任何材料。例 如，所述材料是塑料材料，如皮氏培養皿或細胞培養瓶，其被處理以促進哺乳動物細胞與其 表面的粘附性，例如商業上可獲得的可選地涂覆有明膠、纖維連接蛋白、多聚-D-賴氨酸或 其他試劑的聚苯乙烯板。孵育后，洗滌細胞以便除去非粘附的細胞和細胞片段。
[0032] -旦細胞增殖，在培養中在相同的培養基中和相同的條件下可以維持這些細胞直 至它們達到足夠的匯合，通常，約80%的細胞匯合，當必要時更換細胞培養基。在達到期望 的細胞匯合后，細胞可以通過使用分離劑（如胰蛋白酶）的連續傳代并在適當的細胞密度 (通常2, 000-10, 000個細胞/cm2)接種到更大的細胞培養表面進行擴充。因此，然后在這 種培養基中在不分化的情況下傳代細胞至少兩次，同時仍保留它們的發育表型。更優選地， 在不丟失其發育表型的情況下，可以傳代所述細胞至少10次（例如，至少15次或甚至至少 20次）。通常，以所需的密度鋪板所述細胞，如在約100個細胞/cm 2至約100, 000個細胞/ cm2之間（例如，約500個細胞/cm 2至約50, 000個細胞/cm2,或者，更具體地，約1，000個 細胞/cm2至約20, 000個細胞/cm 2之間）。如果以較低的密度（例如約300個細胞/cm 2) 鋪板，則細胞可以更容易地被克隆分離。例如，幾天后，以這樣的密度鋪板的細胞將增殖成 同源群體。
[0033] 最后，該方法包括選擇干細胞[步驟（d)]。該干細胞可以通過任何常規的方法來 選擇，如免疫細胞化學（ICC)，流式細胞術等。免疫細胞化學是一種通過使用特異性抗體用 于評估細胞（培養的細胞、細胞懸浮液）中特異性蛋白或抗原的存在的技術，其中特異性 抗體結合至特異性蛋白或抗原，從而允許在顯微鏡下的可視化和檢查。如本領域技術人員 已知的，待染色的細胞可以附著于固體支持物，以允許后續的步驟中的容易處理，其可通過 以下幾種方法來實現：貼壁細胞可以在顯微鏡載玻片、蓋玻片、光學合適的塑料載體等上生 長。另一方面，流式細胞術是一種基于激光的、生物物理學技術，其應用于細胞計數、分選、 生物標志物的檢測和蛋白質工程，通過在流體流中懸浮細胞，以及通過電子檢測裝置轉移 它們。一種特殊類型的流式細胞術是熒光激活的細胞分選或FACS。該流式細胞術提供了一 種方法，以用于基于每個細胞的特定光散射和熒光特性，將生物細胞的異質混合物分選在 兩個或更多個容器中，一次一個細胞。這些方法以及待檢測的以便識別或選擇干細胞的細 胞標記物，例如細胞表面標記物，是本領域技術人員廣泛已知的。
[0034] 如果需要的話，用于分離干細胞的任何步驟和程序可以手動執行。可替換地，分離 這些細胞的方法可以通過一個或多個合適的裝置來促進和/或自動化，其實例在本領域中 是已知的。實施例1以詳細的方式描述了來源于人類子宮頸組織的本發明的細胞的分離。 作為本發明的方法的結果，獲得了子宮頸干細胞的均質細胞群。
[0035] 因此，在【具體實施方式】中，分離的干細胞：
[0036] (a)表達細胞標記物⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、波形蛋白、細胞角蛋白 (CKAE1AE3)、Klf4, 0ct4 和 Sox-2,以及
[0037] (b)不表達選自由以下組成的組中的至少一種細胞標記物：結蛋白、肌動蛋白 HHF35、0 -連環蛋白、p63、E-鈣粘著蛋白、CD117、CD133、HLA-DR、TRA1-81、CD45、CD34 和 CD31〇
[0038] 感興趣的表型的確認可以通過使用常規的方法來進行。細胞標記物，例如，細胞表 面標記物，可以通過任何合適的常規技術來識別，通常基于陽性/陰性選擇，例如，可以使 用針對細胞表面標志物的單克隆抗體，必須確認細胞中所述細胞表面標志物的存在/不存 在，雖然其他技術也可以使用。
[0039]使用針