專利名稱：菊芋中二咖啡酰奎尼酸組分的分離提純方法
技術領域：
本發明涉及二咖啡酰奎尼酸，具體地說是菊芋中二咖啡酰奎尼酸組分的分離提純方法。
背景技術：
二咖啡酰奎尼酸(Dicaffeoylquinic acid)，為奎尼酸與二分子咖啡酸通過酯化反應縮合而成的酚酸類天然化合物，根據取代位置不同，主要可分為1，3_ 二 -0-咖啡酰奎尼酸，1，4_ 二 -0-咖啡酰奎尼酸，1，5_ 二 -0-咖啡酰奎尼酸，3，4- 二 -0-咖啡酰奎尼酸，3，5- 二 -0-咖啡酰奎尼酸，4，5- 二 -0-咖啡酰奎尼酸6種。二咖啡酰奎尼酸作為一種藥理活性成分，作用范圍廣泛，具有抗氧化、抗炎、抗肝損傷、抗微生物、抗誘變、提高免疫力等作用，在病毒感染、心血管疾病等方面有一定療效。近年來研究表明，二咖啡酰奎尼酸對乙肝病毒、愛滋病毒(CN1087608 ;EP1008344 ;US6331565)、冠狀病毒感染(CN1449751)有特殊的治療作用，是我國首個既抗艾滋病毒又抗乙肝病毒的新藥。二咖啡酰奎尼酸類化合物在多數植物中含量較低且未有成熟的提取純化方法，目前主要依靠化學方法合成制得，化學方法合成化合物藥用時存在較強的毒副作用，因此尋找二咖啡酰奎尼酸類化合物含量豐富的植物原材料并建立從天然植物中提取純化該類化合物的方法有重大的現實意義。
菊芋(Helianthus tuberosus Li皿)俗稱洋姜，鬼子姜，為菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus L.)多年生草本植物，具有耐旱、耐寒、耐鹽堿等特點，在我國西北、東北等荒漠地區及沿海灘涂廣泛種植。菊芋藥材中含有豐富的咖啡酰奎尼酸類化合物，其中二咖啡酰奎尼酸類化合物含量較高，從菊芋中提取分離二咖啡酰奎尼酸具有較高的經濟價值。
發明內容
本發明提供一種從菊芋中提取二咖啡酰奎尼酸類化合物的方法，以滿足化合物標
準品制備，藥理活性進一步研究及工業應用的需求；發明首先優化了菊芋藥材中二咖啡酰
奎尼酸類化合物的提取方法，通過樹脂及硅膠柱層析法分離純化及S印hdexLH20脫色，得
到純度較高的二咖啡酰奎尼酸類化合物。 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為 菊芋中二咖啡酰奎尼酸組分的分離提純方法，以菊芋為原料，依次經醇水提取、乙酸乙酯萃取富集、柱色譜純化及S印hdexLH20脫色，提取分離得到二咖啡酰奎尼酸組分，經HPLC檢測組分含量達85%以上；提取二咖啡酰奎尼酸類化合物結構式如下，
4OR2 Q
COOH
OH
C-
ORi
caffeoyl= ^_^ _^
OR3
OR4 其中，R" R2， R3， R4可以相同也可以不同，分別為H或咖啡酰基caffeoyl ;當R2， R4為H時，R" R3為咖啡酰基;當R3， R4為H時，&， R2為咖啡酰基;當R2， R4為H時，R" R3為咖啡酰基;當&， R4為H時，R2， R3為咖啡酰基;當Rn R3為H時，R2， R4為咖啡酰基；當R" R2為H時，R3，I^為咖啡酰基。
具體操作過程為 (1)菊芋中二咖啡酰奎尼酸類化合物的提取
A.將干燥的菊芋花、葉和/或莖稈粉碎得菊芋原料； B.按菊芋原料與乙醇水溶液為lg : 10 20ml的比例混合浸泡，乙醇水溶液的體積濃度為50 80%，超聲提取0. 5-1小時或回流提取1-2小時，過濾；
C.重復B的提取過程2 3次，合并濾液，減壓濃縮除去乙醇，得到菊芋粗提液；
(2)萃取富集菊芋葉中二咖啡酰奎尼酸類化合物將步驟(1)得到的菊芋粗提液以石油醚脫脂萃取3 4次后，再以乙酸乙酯萃取3 4次，菊芋提取物中的二咖啡酰奎尼酸類化合物主要富集于乙酸乙酯萃取部位，將乙酸乙酯萃取部位減壓濃縮至浸膏狀；
(3)樹脂或硅膠柱分離二咖啡酰奎尼酸類化合物將步驟(2)所得浸膏，以體積濃度20-30%乙醇溶解后，過濾，以大孔吸附樹脂為填料裝柱分離，依次以5 10倍柱體積的體積濃度20-30% 、60-70%乙醇溶液進行洗脫，收集60-70%部位的流份，濃縮至浸膏狀，高效液相色譜檢測二咖啡酰奎尼酸含量達70%以上； 或將步驟(2)所得浸膏以體積濃度20-30%乙醇溶解后，過濾，以聚酰胺為填料裝柱進行分離，依次以5 10倍柱體積的體積濃度30-40%、70-80%的乙醇洗脫，收集70-80%部位的流份，濃縮至浸膏狀，高效液相檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量達55%以上； 或將步驟(2)所得浸膏以乙醇溶解后，加入與浸膏相同質量的硅膠減壓濃縮至干得樣品，干法上樣，以硅膠為填料裝柱進行分離，樣品與硅膠填料的質量比為1 : 10 1 : 20，依次以不同比例5 10倍柱體積石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，不同比例的石油醚與乙酸乙酯混合溶液中石油醚的體積含量分別為80-100% 、70-50% 、30-20% ， 0% ;收集純乙酸乙酯洗脫部位；該部位減壓濃縮至浸膏狀，高效液相色譜檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量達65% ; (4) S印hdexLH20純化樣品將步驟(3)中所獲得的二咖啡酰奎尼酸組分浸膏分別以體積濃度30-40%乙醇溶解后，以S印hdexLH20進一步純化，依次以5 10倍柱體積的體積濃度30-40% 、80-95%的乙醇進行洗脫，收集80-95%乙醇洗脫部位，減壓濃縮除去乙醇后，冷凍干燥得淡黃色干粉，高效液相檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量可達85%以上，整個工藝流程見圖1。萃取操作時，菊芋粗提液與石油醚的體積比為1 : l-2，菊芋粗提液與乙酸乙酯的
5體積比為l : 1-2 ;所述大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂；所用的聚酰胺樹脂為30-60
目或60-100目聚酰胺樹脂。
本發明具有以下優點 1菊芋中二咖啡酰奎尼酸類化合物含量豐富，且組分易于富集，產率高，且容易分 離操作，工藝簡單，生產成本低。 2通過多種柱色譜均能達到對二咖啡酰奎尼酸類化合物的初步純化，S印hdexLH20
脫色后，可得純度達85%以上的二咖啡酰奎尼酸組分，產品純度高，品質好。 3使用的大孔吸附樹脂、聚酰胺樹脂及s印hedexLH20均可反復再生使用，適于工
業應用。
圖1為本發明的工藝流程圖。
具體實施例方式
現結合實例，對本發明做進一步說明。實例僅限于說明本發明，而非對本發明的限定。 實施例1 菊芋葉烘干后粉碎，稱取40g，以600ml量體積濃度70 %的乙醇浸泡12h，超聲 45min后，過濾，濾液保存備用；濾渣再加入520ml量體積濃度70%的乙醇浸泡約6h，超聲 45min，過濾；合并濾液，濾渣棄去。將濾液減壓濃縮除去乙醇，得粗提液，以與粗提液同體 積的石油醚萃取，共萃取4次，除去脂溶性成分后，以與粗提液同體積的乙酸乙酯萃取，共 萃取4次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮得浸膏，將浸膏以體積濃度20%乙醇溶解后，以聚酰胺 (30-60目)裝柱進行色譜分離，依次以IO倍柱體積的體積濃度30%、80%的乙醇洗脫，收 集體積濃度80%乙醇洗脫部位，濃縮得浸膏，高效液相色譜檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物 含量達55% 。得到的浸膏再以體積濃度40%乙醇溶解，濾過，以S印hdexLH20進一步分離 純化，分別以10倍柱體積的體積濃度40%、95%的乙醇進行洗脫，收集體積濃度95%乙醇 洗脫部位，減壓濃縮除去乙醇后，冷凍干燥得淡黃色干粉，粉末質量為O. 07923g，高效液相 色譜檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量可達93% 。
實施例2 菊芋葉烘干后粉碎，稱取40g，以600ml量體積濃度70 %的乙醇浸泡12h，超聲 45min后，過濾，濾液保存備用；濾渣再加入520ml量體積濃度70%的乙醇浸泡約6h，超聲 45min，過濾；合并濾液，濾渣棄去。將濾液減壓濃縮除去乙醇，得粗提液，以與粗提液同體積 的石油醚萃取，共萃取4次，除去脂溶性成分后，以與粗提液同體積的乙酸乙酯萃取，共萃 取4次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮得浸膏，將浸膏以體積濃度20%乙醇溶解后，以D101大 孔吸附樹脂裝柱進行分離，依次以IO倍柱體積的體積濃度20%、60%的乙醇洗脫，收集體 積濃度60 %乙醇洗脫部位，濃縮得浸膏，高效液相色譜檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量 達70% 。得到的浸膏再以體積濃度40%乙醇溶解，濾過，以S印hdexLH20進一步分離純化， 分別以10倍柱體積的體積濃度40% 、95%的乙醇進行洗脫，收集體積濃度95%乙醇洗脫部 位，減壓濃縮除去乙醇后，冷凍干燥得淡黃色干粉，粉末質量為0. 12234g，高效液相色譜檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量可達85% 。
實施例3 菊芋藥材烘干后粉碎，稱取40g，以600ml量體積濃度70%的乙醇浸泡12h，超聲 45min后，過濾，濾液保存備用；濾渣再加入520ml量體積濃度70%的乙醇浸泡約6h，超聲 45min，過濾；合并濾液，濾渣棄去。將濾液減壓濃縮除去乙醇，得粗提液，以與粗提液同體 積的石油醚萃取，共萃取4次，除去脂溶性成分后，以與粗提液同體積的乙酸乙酯萃取，共 萃取4次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮得浸膏，將浸膏以乙醇溶解后，加入與浸膏相同質量的 硅膠減壓濃縮至干得樣品，以50g硅膠干法裝柱進行分離，依次以不同比例10倍柱體積的 石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，石油醚體積濃度依次為80 % 、60 % 、20 % 、0 % ;收集純乙酸乙 酯洗脫部位；該部位減壓濃縮至浸膏狀，高效液相檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量可達 65% ;將浸膏以體積濃度40%乙醇溶解，濾過，以S印hdexLH20進一步分離純化，分別以10 倍柱體積體積濃度40 % 、95 %的乙醇進行洗脫，收集體積濃度95 %乙醇洗脫部位，減壓濃 縮除去乙醇后，冷凍干燥得淡黃色干粉，粉末質量O. 1387g，高效液相色譜檢測二咖啡酰奎 尼酸類化合物含量可達85 % 。
權利要求
菊芋中二咖啡酰奎尼酸組分的分離提純方法，其特征在于以菊芋為原料，依次經醇水提取、乙酸乙酯萃取富集、柱色譜純化及SephdexLH20脫色，提取分離得到二咖啡酰奎尼酸組分，經HPLC檢測組分含量達85％以上；提取二咖啡酰奎尼酸類化合物結構式如下，其中，R1，R2，R3，R4可以相同也可以不同，分別為H或咖啡酰基caffeoyl；當R2，R4為H時，R1，R3為咖啡酰基；當R3，R4為H時，R1，R2為咖啡酰基；當R2，R4為H時，R1，R3為咖啡酰基；當R1，R4為H時，R2，R3為咖啡酰基；當R1，R3為H時，R2，R4為咖啡酰基；當R1，R2為H時，R3，R4為咖啡酰基。F2008102298908C0000011.tif
2. 根據權利要求1所述的分離提純方法，其特征在于具體操作過程為，(1) 菊芋中二咖啡酰奎尼酸類化合物的提取A. 將干燥的菊芋花、葉或莖稈粉碎得菊芋原料；B. 按菊芋原料與乙醇水溶液為lg : 10 20ml的比例混合浸泡，乙醇水溶液的體積濃 度為50 80%，超聲提取0. 5-1小時或回流提取1-2小時，過濾；C. 重復B的提取過程2 3次，合并濾液，減壓濃縮除去乙醇，得到菊芋粗提液；(2) 萃取富集菊芋葉中二咖啡酰奎尼酸類化合物將步驟(1)得到的菊芋粗提液以石油醚脫脂萃取3 4次后，再以乙酸乙酯萃取3 4次，菊芋提取物中的二咖啡酰奎尼酸類 化合物主要富集于乙酸乙酯萃取部位，將乙酸乙酯萃取部位減壓濃縮至浸膏狀；(3) 樹脂或硅膠柱分離二咖啡酰奎尼酸類化合物將步驟(2)所得浸膏，以體積濃度 20-30%乙醇溶解后，過濾，以大孔吸附樹脂為填料裝柱分離，依次以5 10倍柱體積的體 積濃度20-30 % 、60-70%乙醇溶液進行洗脫，收集60-70%部位的流份，濃縮至浸膏狀，高 效液相色譜檢測二咖啡酰奎尼酸含量達70%以上；或將步驟(2)所得浸膏以體積濃度20-30%乙醇溶解后，過濾，以聚酰胺為填料裝柱進 行分離，依次以5 IO倍柱體積的體積濃度30-40% 、70-80%的乙醇洗脫，收集70-80 %部 位的流份，濃縮至浸膏狀，高效液相檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量達55%以上；或將步驟(2)所得浸膏以乙醇溶解后，加入與浸膏相同質量的硅膠減壓濃縮至干得樣 品，干法上樣，以硅膠為填料裝柱進行分離，樣品與硅膠填料的質量比為1 : 15 1 : 30， 依次以不同比例5 10倍柱體積石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，不同比例的石油醚與乙酸乙 酯混合溶液中石油醚的體積含量分別為80-100%、70-50%、30-20%，0% ;收集純乙酸乙酯 洗脫部位；該部位減壓濃縮至浸膏狀，高效液相色譜檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量達65% ;(4) S印hdexLH20純化樣品將步驟(3)中所獲得的二咖啡酰奎尼酸組分浸膏分別以體 積濃度30-40%乙醇溶解后，以S印hdexLH20進一步純化，依次以5 10倍柱體積的體積濃 度30-40%、80-95%的乙醇進行洗脫，收集80-95%乙醇洗脫部位，減壓濃縮除去乙醇后， 冷凍干燥得淡黃色干粉，高效液相檢測二咖啡酰奎尼酸類化合物含量可達85%以上。
3. 根據權利要求2所述的分離提純方法，其特征在于萃取操作時，菊芋粗提液與石油醚的體積比為i : l-2，菊芋粗提液與乙酸乙酯的體積比為i : 1-2。
4. 根據權利要求2所述的分離提純方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂為非極性大 孔吸附樹脂。
5. 根據權利要求2所述的分離提純方法，其特征在于所用的聚酰胺樹脂為30-60目 或60-100目聚酰胺樹脂。
全文摘要
本發明公開了一種菊芋中二咖啡酰奎尼酸組分的提取純化方法，屬于有效成分開發利用領域。菊芋中該類化合物提取分離的主要工藝步驟為將干燥菊芋藥材粉碎后，以10～20倍量50～80％乙醇超聲或回流提取，石油醚脫脂后，以乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮至浸膏狀。所得浸膏通過樹脂或者硅膠柱層析初步純化，再以SephdexLH20進一步純化，即可得含量85％以上的二咖啡酰奎尼酸組分。本發明采用多種柱色譜分離純化菊芋中二咖啡酰奎尼酸類化合物，工藝簡單，易操作，制成品中二咖啡酰奎尼酸類含量高且原藥材來源豐富，所用樹脂及SephdexLH20可回收利用，易于工業化。
文檔編號A61K36/28GK101747195SQ200810229890
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者杜昱光, 程受衍, 肖紅斌, 袁曉艷, 高明哲 申請人:中國科學院大連化學物理研究所