一種預防和治療骨質疏松的中藥組合物及其制備方法

專利名稱：：一種預防和治療骨質疏松的中藥組合物及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種藥物，是一種預防和治療骨質疏松癥的中藥組合物，本發明還涉及該中藥組合物的制備方法，屬于醫藥
技術領域：
。
背景技術：
：骨質疏松癥(osteoporosis，簡稱OP)，是由于全身骨質及骨組織的微細結構的改變，致使骨強度減弱、骨脆性增加，極易發生骨折的系統性多病因骨骼疾病，屬于中醫"骨痿"、"骨痹"、"腰痛"、"骨枯"、"骨極"、"骨折"、"絕經前后諸癥"、"虛勞"等范疇。研究表明，美國、歐洲和日本大約有7500萬人不同程度地患有骨質疏松癥，我國也有數千萬的患者，尤其是絕經后婦女發病率更高，所以現代中醫學家常將此癥歸為"絕經前后諸癥"。隨著社會人口老齡化，骨質疏松的發病率在繼續增加，由此給家庭和社會帶來沉重的負擔。因此，骨質疏松癥的有效預防與治療已引起世界醫學界的廣泛重視。近年來，國內外對骨質疏松癥的研究均非常重視，中醫藥防治骨質疏松癥的研究也取得了不少成果，其著重于整體調節，調動內因，作用于多個環節，最終達到糾正機體激素失衡和負鈣平tf的功效，療效得到了充分肯定。檢索發現，申請號為02135700.5和200310112783.4的中國專利申請分別公開了兩種治療骨質疏松癥的中藥及其制備方法，前者主要由一定配比的玄駒、骨碎補、淫羊藿、續斷、人參、川芎、生牡蠣、懷牛膝配制而成，后者主要由淫羊藿、骨碎補、炒杜仲、首烏、懷牛膝、土豎蟲配制而成。其配藥成分均較為復雜，有一定副作用，藥效有待進一步提高。
發明內容本發明目的是提供一種預防和治療骨質疏松癥的中藥，其副作用小，對原發性骨質疏松癥具有較好的預防和治療效果。本發明的另一個目的是提供該中藥的制備方法。本發明的目的通過以下技術方案實現一種預防和治療骨質疏松的中藥組合物，每份中藥組合物主要由下列重量比的原藥材制成骨碎補(25~40)%、淫羊藿(20~35)%、懷牛膝(10~25)%、杜仲(10~25)%和鹿角片(5~15)%。優選用量為骨碎補(25~35)%、淫羊藿(20~30)%、懷牛膝(15~25)%、杜仲(15-25)%和鹿角片(5~10)%。最佳用量為骨碎補31%、淫羊藿21%、懷牛膝21%、杜仲21%和鹿角片6%。本發明中各原藥材來源如下骨碎補為水龍骨科植物槲蕨Drynariafort彥i(K匿e)J.Sm.的干燥才艮莖，^立丁名為RhizomaDrynariae，產i也四川。淫羊藿為小薜科植物箭葉淫羊藿Epimediumsegittatum(Sitb.etZucc.)Maxim.的i也上部分，4立丁名為HerbaEpimedii,產地陜西。懷牛膝為莧科多年生藥用草本植物。別名對節草、山莧菜等，以干燥根入藥，拉丁名為RadixAchyranthisBidentatae,產地河南。杜仲為杜仲科植物杜仲的樹皮，拉丁名為CortexEucommiae原植物杜仲CortexEucommiaulmoidesOliv,產地湖北。鹿角別名斑龍角(《本草綱目》)，為鹿科動物;f每花鹿或馬鹿已骨化的老角。處方名鹿角片，拉丁名為CorunCervi，產地吉林。本發明的另一個目的通過以下技術方案實現一種預防和治療骨質疏松的中藥組合物的制備方法，包括以下步驟(1)稱取各原藥材骨碎補25~40%、淫羊藿20~35%、懷牛膝10~25%、杜仲10~25%和鹿角片5~15%備用；(2)將所述重量配比的懷牛膝加乙醇回流提取2次，每次0.5~3小時，過濾得濾液I和藥渣，備用；(3)將所述重量配比的骨碎補、淫羊藿、杜仲和鹿角片與步驟(2)中得到的藥渣加水煎煮兩次，第一次加水量為所述骨碎補、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步驟(2)中得到的藥渣總重量的9~11倍量，第二次加水量為所述骨碎補、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步驟(2)中得到的藥渣總重量的7~9倍量，每次煎煮0.5~3小時，過濾得濾液II,備用；(4)合并濾液I和濾液II，濃縮制成藥液。還可以根據需要添加以下步驟(5)所述濾液濃縮后，在809(TC下干燥，制成粉末狀的中藥組合物。(6)將所述活性組分與常用輔料混合，制成固體制劑。以上中藥組合物還可以根據需要利用制藥常規方法制成臨床上適用的劑型，如液體制劑等。本發明原藥材選用骨碎補和淫羊藿組合，其中骨碎補補腎活血，主治腎虛腰痛，《本草從新》云其療"骨痿"效佳，為君藥；淫羊藿補腎陽、堅筋骨，《本草備要》載其能"補命門，益精氣，堅筋骨"，為臣藥；懷牛膝"走而能補"，《別錄》認為"牛膝益精、填骨髓，除腰脊痛。"既活血化瘀，又能補肝腎、強筋骨，善治腰膝酸痛、下肢無力等癥。杜仲補肝腎、強筋骨，《本經》記載杜仲"主腰脊痛，補中，益精氣，堅筋骨"。鹿角片入肝、腎經，溫補肝腎、強筋骨、兼有活血之效，《本草綱目》記載鹿角"生用則散熱行血，消腫辟邪；熟用則益腎補虛，強精活血"。現代藥理研究表明應用"Ca同位素示蹤法證明，骨碎補有促進骨對鈣的吸收作用，提高血4丐與血磷水平，有利于骨鈣化和骨鹽形成，骨碎補提取物對小雞骨發育生長有顯著促進作用，對組織培養中的雞胚骨原基的Ca、P沉積有明顯促進作用。淫羊藿不但具有補陽藥的激素樣作用，而且可促進成骨細胞的生長，抑制破骨細胞的功能。懷牛膝與淫羊藿配伍，有提高維曱酸致骨質疏爭>才莫型動物骨密度作用。杜仲有促進成骨細胞增殖、調節成骨細胞代謝的作用(參考文獻[i])。值得一提的是，實-險研究表明，鹿角可明顯增加正常小鼠血清鉀含量濃度(參考文獻[ii])。將鹿角片與懷牛膝、杜仲共為佐藥，可以具有顯著的補益肝腎、兼有活血之效。因此本發明提供的中藥組方副作用小，對原發性骨質疏松癥具有更好的預防和治療效果。具體實施方式實施例一按本發明技術方案所制得的中藥組合物對去卵巢大鼠骨質疏松模型促骨形成的作用本實驗擬通過建立大鼠絕經后骨質疏松癥模型，借助現代病理組織學檢查、雙能X線骨密度測定儀、生物化學、分子生物學等方法與手段，系統觀察中藥組合物對絕經后骨質疏松癥的作用途徑及作用機理，初步探索該藥防治絕經后骨質疏松癥的機理(如促進骨形成等I為臨床防治絕經后骨質疏松癥提供科學、合理的實驗依據。1.主要實驗材料1.1實驗動物清潔級SD大鼠，雌性，3月齡，150~200g,購于上海斯萊克實-瞼動物有限責任公司，合格證號SCXK(滬)200卜0005;實驗環境合才各證號SYXK(蘇)2007-0026。1.2主要試劑苯甲酸雌二醇天津金耀氨基酸有限公司提供，批號0609131;血清雌二醇放射免疫分析藥盒北京市福瑞生物工程公司提供，批號070920;血清骨4丐素放免藥盒北京市福瑞生物工程公司提供，批號070915;》威性磷酸酶纟企測試劑盒南京建成生物工程研究所提供，批號071007;血清鉤試劑盒南京建成生物工程研究所提供，批號071008;大鼠胰島素樣生長因子(IGF-I)定量酶聯檢測試劑盒上海森雄科技實業有限公司提供，批號0804121;其他試劑均為市售分析純產品。1.3主要儀器DPX-NT型雙能x射線骨密度儀(LUNAR,美國)；METTLERPB303-N電子天平，上海產；SN-695B型智能放免y測量儀，上海原子核研究所日環儀器一廠；752s型紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；三洋MDF-382E超低溫冰箱，日本產；隔水式電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；Axioskope2生物熒光顯微圖像分析系統，德國ZEISS產；XHF-1高速分散器，上海金達生化儀器廠；臺式高速離心機，上海醫用分析儀器廠；HH-60型快速恒溫數顯水箱，常州國華電器有限公司。2.實驗方法2.1中藥組合物的制備原料藥選取如下骨碎補片產地四川，購自江蘇省盱眙縣中藥飲片廠，批號060801;淫羊藿產地陜西，購自南京康怡中藥飲片有限公司，批號070310;懷牛膝產地河南，購自南京藥業股份有限公司中藥飲片廠，批號070106;鹽炒杜仲產地湖北，購自南京康怡中藥々欠片有限^^司，批號070310;鹿角片產地吉林，購自江蘇省盱眙縣中藥飲片廠，批號061002。按最佳的原藥材配比值的制備步驟如下(1)按每份中骨碎補31%、淫羊藿21%、懷牛膝21%、杜仲21%和鹿角片6%的比例稱取各原藥材，備用；(2)將所述重量配比的懷牛膝加70%的乙醇回流提取2次，每次1.5小時，過濾得濾液I和藥渣，備用；(3)將所述重量配比的骨碎補、淫羊藿、杜仲和鹿角片與步驟(2)中藥渣加水煎煮兩次，第一次加水量為IO倍量，第二次加水量為8倍量，每次煎煮1.5小時，過濾得濾液II,備用；(4)合并濾液I和濾液II,濃縮制成藥液。2.2絕經期大鼠模型的建立參照文獻方法[謝雁鳴，趙晉寧，丁會，等.強骨膠嚢抗去勢大鼠骨質疏松癥的實驗研究[J].中國醫藥科技，2000，7(3):151-152.1],取體重150~200g的清潔級雌性SD大鼠50只，禁食12h(不禁水)，于腹部剪毛，形成約3x5cm的去毛區，以碘酒消毒后，用10%的水合氯醛按0.3ml/100g的劑量腹腔注射麻醉。其后沿腹中線向下做縱4亍切口，長約23cm，切開皮膚后，即可見位于兩側腎臟外下方呈粉紅色的卵巢及緊密相連的子宮角，結扎并切斷子9宮角，將卵巢摘除。縫合腰肌及皮膚。另取10只SD大鼠，僅從兩側卵巢旁邊切除少許脂肪組織，不作卵巢摘除，作為偽手術組。術后連續肌注青霉素(40萬單位/只)3d以預防感染，正常飼養3個月后，造成大鼠骨質疏松模型。2.3分組及給藥方法將上述模型大鼠隨機分為5組，即模型組(Model),陽性藥組(EB),中藥組合物高、中、低劑量組(H-JGP,M-JGP，L-JGP),每組10只。另設偽手術組(Control)10只。陽性藥組采用苯曱酸雌二醇(EB)注射液，月幾注給藥，3日l次，每次0.276mg/kg;高、中、低劑量組均灌胃給藥，劑量分別為17.6、8.8、4.4g生藥/kg.d-l。模型組及偽手術組灌胃給予等量消毒飲用水，連續給藥3個月。3.指標;險測3.1骨密度測定給藥結束后，每組取8只大鼠，以10%水合氯醛腹腔麻醉后，用雙能x射線骨密度儀測量大鼠股骨和腰推的骨密度(bonemineraldensity,BMD)。3.2生化指標測定3.2.1樣品采集方法上述大鼠，最后一次灌胃給藥后1小時，以10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈采血，室溫下靜置lh后離心，3000r/m,離心10分鐘，取血清，-2(TC下保存。3,2.2血清骨鈣素(s-BGP)的測定本試劑盒利用放射免疫分析法進行測t用濃度分別為1、2、4、8、16ng/mL的BGP標準品作出標準曲線。取100pL樣品血清，依次加入100jaL抗血清，100juL1251-BGP,搖勻，4。C下放置24h,力口10入500juL的分離劑，混勻，室溫;故置15-20min,4。C3500rpm離心20min,吸棄上清液，y計數器上測定沉淀的放射性計數(cpm),由標準曲線計算樣品濃度。3.2.3血清雌二醇(s-E2)的測定本試劑盒利用放射免疫分析法進行測定。在均相竟爭抑制反應中采用平纟軒法，對血清樣品進行直接測定。測定中，標準品、樣品等中的E2與1251-E2竟爭限量抗體的結合位。當^^皮測物中的E2的濃度高時，剩余的抗體結合位就少，從而與抗體結合的1251-E2就少，反之結合就多。利用免疫分離劑分離出抗原-抗體復合物，并測定復合物中的放射性技術。1251-E2的結合量與樣品中E2的濃度呈函數關系，通過數據處理可求出樣品中E2的含量。用濃度分別為0、5、20、50、100、250、500pg/mL的E2標準品作出標準曲線。取100luL樣品血清，依次加入100|uL125I-E2,IOOiuL抗體，混勻，37。C下溫育加入500jaL的分離劑，混勻，室溫放置15min3500rpm離心15min,吸棄上清'氣y計數器上測定沉淀的放射性計數(cpm)，由標準曲線計算樣品濃度。3.2.4血清總^喊性磷酸酶(s-ALP)的測定對硝基苯磷酸二鈉法檢測血清總堿性磷酸酶的含量。堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產生游離酚和磷S吏，酚在^咸性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據紅色深淺可以測定酶活力的高低。標準管加入50iaL的0.lmg/mL酚標準液，樣品管加入50jaL樣品血清，空白管加入50jaL去離子水，各管依次加入500juL緩沖液500juL基質液充分混勻，37。C水浴中放置15min加入l.5mL的顯色劑，立刻混勻，采用紫外分光光度計測量，檢測波長520nm，lcm光徑比色，空白管調零，測定各管的吸光度值，并根據公式a計算酶含量(100mL血清在37。C與基質作用15min產生lmg酚為l個金氏單位)。測定管標準管含酚lOOmL吸光度的量_ALP^f直標準管0.005mg0.05mL(金氏單位/100mL)吸光度公式a3.2.5血清4丐(s-Ca)的測定血清中鈣離子在堿性溶液中與曱基百里香酚藍(MTB)結合，生成藍色絡合物。通過比色與同樣出里的鈣標準進行標準，可計算出鈣的含量。標準管加入50]iL的2.5mol/L鈣標準液，樣品管加入50jaL樣品血清，空白管加入50iaL去離子水，各管依次加入lmLMTB試劑，2mL堿性溶液，充分混勻，靜置15min，采用紫外分光光度計測量，蒸餾水調零，檢測波長610nm，lcm光徑比色，測各管的吸光度值，根據計算公式b得出結果。血清釣測定管吸光度-空白標準品濃度(nmol/L)管吸光度標準管吸光度-空白2.5mmol/L管吸光度公式b3.2.6血清胰島素樣生長因子-I(s-IGF-I)的測定采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清中胰島素樣生長因子-1的含量。按照試劑盒操作說明書的方法，用抗大鼠IGF-I單抗包被于酶標板上，標準品中的大鼠IGF-I與單抗結合，加入生物素化的抗大鼠IGF-I抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的12Streptavidin與生物素結合，力口入酶底物OPD，出現黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在酶標儀492nm處測0D值，大鼠IGF-I濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中大鼠IGF-1濃度。3.2.7骨組織形態計量學的觀察取尾推以上5、6節處腰推骨，放入10。/。曱醛溶液中固定24h以上，EDTA脫4丐，H-E染色，切片。在顯微鏡下觀察骨組織形態結構的變化并測量骨小梁面機采用Image-ProPhis6.0(MediaCybernetics公司)圖象分析軟件計算平均骨小梁面積百分比(TS%)、平均骨小梁寬度(WAT)和單位面積(36180(^m)骨小窩數量。4.結果4.1對骨密度的影響骨密度測定結果表明與正常對照組比較，模型組腰推骨和股骨密度明顯降低，表明骨質疏松模型形成。與模型組比較，苯曱酸雌二醇組腰推骨和股骨密度有顯著升高(P<0.01),中藥組合物高、中、低劑量組的骨密度也均有顯著性升高(P〈0.05~0.01)。見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表l中藥組合物對去勢大鼠骨密度的影響(無±&/=8)注與才莫型組比舉交，*:代O.05，**:代O.01。4.2對血清學指標的影響與正常組比較模型組的血清E2顯著降低血清ALP(金氏單位/ml)顯著性升高(P〈0.05~0.01)。與模型組比較，苯曱酸雌二醇組的血清E2顯著升高(P<0.01),苯甲酸雌二醇組血清ALP有顯著性降低(P<0.01);中藥組合物各劑量組的血清E2水平比模型組明顯升高(P<0.05~0.01),接近正常動物水平；而血清ALP有顯著性降低。見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2中藥組合物對去勢大鼠血清E2、ALP含量的影響(元±&/2=10)注與才莫型纟且比4交，*:代O.05，**:代O.01。與偽手術組比較，模型組的血清BGP顯著性升高(P<0.05~0.01)，血清Ca2+有升高趨勢，血清中IGF-I含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，苯曱酸雌二醇組的血清Ca2+有所降低，但無統計學顯著性差異(P〉0.05);血清BGP有顯著性降低(P〈0.01)，IGF-I含量則顯著升高(P<0.05);而中藥組合物中、低劑量組的血清Ca2十、BGP有顯著性降低,IGF-I含量也顯著升高(P〈0.05)。見表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3中藥組合物對去勢大鼠血清Ca、BGP和IGF-I含量的影響(元±&/7=10)注與才莫型組比4交，*:代O.05,**:代O.01。4.3骨組織形態計量學觀察骨形態計量學指標表明，與偽手術組相比，模型組大鼠股骨骨小梁面積百分比(TS。/。)，骨小梁平均寬度(WAT)和骨小窩數量明顯降低(P<0.01);中藥組合物各劑量組骨小梁面積百分比和骨小梁平均寬度較模型組大鼠均有明顯提高(P<0.05~0.01)。中藥組合物各劑量組的骨小窩數與模型組比較，沒有統計學差異，見表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表4中藥組合物對去勢大鼠骨形態學計量指標的影響(5±s，/2=10)注與才莫型組比4交，*:代O.05,**:戶<0.01。5.結論中藥組合物對骨質疏松模型大鼠有明顯的治療作用，而調節雌激素平衡、抑制骨鈣流失或增加骨對鈣的吸收、抑制ALP的活性和BGP水平，增加血清中IGF-I的含量，是其主要的作用機理，反映了中醫復方多靶點、綜合調理作用的優勢和特色。以下為中藥組合物含藥血清對成骨細胞的作用研究本研究從體外培養成骨細胞觀察中藥組合物含藥血清對成骨細胞增殖、分化和礦化能力的影響，并初步探討了對成骨細胞細胞凋亡的保護作用。為中藥組合物防治骨質疏松的機制研究提供實驗依據。1.主要實驗材料1.1實驗動物出生3日內的清潔級SD大鼠乳鼠12只，購自江蘇省中醫藥研究院動物中心。1.2藥物與試劑噻唑藍(MTT)，Sigma產品；DMEM培養基，Gibco產品；新生牛血清，Gibco產品；胰蛋白酶，Amresco，南京博全科技有限公司分裝；II型膠原酶，Gibico分裝，Lot200905;堿性磷酸酶檢測試劑盒南京建成生物工程研究所提供，批號071007;Tris(三羥曱基氨基曱烷)，購自南京博全科技有限公司，Lot013BE504;TritonX-100,Amresco分裝，Lot010T0405;(3-甘油磷酸鈉，購自南京博全科技有限公司，批號200908;茜素紅，購自廣東光華化學廠有限公司，批號20050808;抗壞血酸，購自上海試四赫維化工有限公司，批號0611101;苯曱酸雌二醇，天津金耀氨基酸有限公司提供，批號0609131;Vybrant凋亡分析試劑盒，購自聯科生物技術有限公司，Lot52398A;腫瘤壞死因子-oc，購自聯科生物技術有限公司，Lot0704731.3主要儀器SW-CJ-2FD醫用型凈化工作臺，蘇凈集團安泰公司生產；HJ-3數顯恒溫磁力攪拌器，常州國華電器有限公司生產；BB6220三氣培養箱，德國Heraeus公司生產；Axiovert200倒置顯微鏡，德國ZEISS公司生產;TecanSunrise酶標儀，奧地利生產；FACSCantoTMFlowCytometer(流式細胞儀)，美國BD公司生產；400R型高速冷凍離心機，Heraeus公司生產；固-1微量振蕩儀，江蘇泰州醫療器械廠生產；2.含藥血清的制備取SD大鼠15只，隨機分成5組，即空白血清組sControl(給予同體積消毒飲用水)i苯曱酸雌二醇血清組sEB和中藥組合物高劑量血清組H-sJGP(32g生藥/kg)、中藥組合物中劑量血清組M-sJGP(16g生藥/kg)、中藥組合物低劑量血清組L-sJGP(8g生藥/kg)，每組3只。每日兩次間隔12小時，連續給藥3天。末次給藥后于O.5h、lh、2h眼眶后靜脈叢取血，3000rpm離心10min，分離血清，將同組的血清混合，經56。C滅活30min，0.22jam濾膜過濾滅菌，-20。C保存備用[雷曉明，田松.壯骨止痛膠嚢含藥血清對大鼠成骨樣細胞增殖分化影響的實驗研究.天津中醫藥，2004,21(3):237-239i]。3.觀察指標3.1細胞增殖率的測定(MTT比色法)取第3代的成骨細胞，以2x105個/ml接種于96孔培養板，24h后更換不含血清的DMEM培養基每孔分別加入不同濃度的含藥血清IOUl，分別繼續培養48h后，每孔加入5mg/mL的MTT10jiL,于37。C、含5%C02、飽和濕度的培養箱內孵育4h后，棄去孵育液，每孔加入IOOjLiLDMSO終止反應，室溫(22。C)15min，振蕩混勻。待沉淀完全溶解后，在微孔振蕩器震蕩15min,待沉淀完全溶解后，在波長490mn處，于酶標儀上測定光密度OD值。3.2堿性磷酸酶活力的測定取第3代的成骨細胞，以4x105個/mL接種于96孔培養板，2卩h后更換不含血清的DMEM培養基，每孔分別加入不同濃度的含藥血清IO繼續培養48h后，去除培養液，PBS洗三次，加入O.1。/。的TritonX-100裂解液200iaL,裂解12h,輕輕吹打細胞lmin,取50nL細胞裂解液轉移至另一96孔板，用PBS做空白調零。各孔加入^咸性磷酸酶試劑盒中新鮮配置的底物100iaL在三氣培養箱孵育。酶標儀檢測，波長18為405咖。根據公式c計算ALP值定管吸光度標準管含酚的量ALP值(金氏單位/100mL)準管吸光度公式C3.3礦化結節計數將培養第3代的成骨細胞以1x105個/mL的密度接種于6孔板上次日換液，并分別加入10。/。的不同濃度的含藥血清，每2日換液1次，并加藥和礦化誘導劑，每孔加入礦化誘導劑，培養20日后，形成礦化結節，倒去培養基，用PBS洗2次，然后用95。/。乙醇固定10min,0.1%茜素紅染色，37。C下放置30min,水沖洗。以橘紅色結節邊界清晰，直徑>200jam為礦化結節的計數標準。在低倍鏡下對各孔作礦化結節計數(礦化結節數/視野)。3.4成骨細胞凋亡實驗將培養第3代的成骨細胞以1x105個/mL的密度接種于6孔板上。次日后換液，并加入不同濃度的藥液。培養3日后，加入細胞凋亡誘導劑TNF-ct，劑量為20ng/mL,誘導24h。棄去培養液，用PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化，輕輕吹打，將細胞懸液移至離心管離心。把得到的細胞用冷PBS洗滌二次并在恰當的染色緩沖液(bindingbuffer)中以lx106細胞/mL的濃度重懸、吸取100yL的細胞(1x105)至試管中。加入適量的熒光標記的annexinV試劑和PI。混勻后避光室溫下孵育15分鐘。孵育后加入400)nL染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析(實驗必須在一小時內完成)。4.實—險結果4.l中藥組合物含藥血清對成骨細胞增殖的影響與對照組比較，不同采血時間的中藥組合物含藥血清對成骨細胞的增殖均沒有明顯的作用，說明中藥組合物含藥血清不能夠促進成骨細胞的增殖作用。結果見表5。組別0.5hlh2h空白血清組0.237±0.0190.237±0.0190.237±0.019雌二醇血清組0.228±0.0170.213±0.0210.209±0.014中藥組合物高劑量組0.253±0.0290.249±0.0230.241±0.038中藥組合物中劑量組0.262±0.0240.253±0.0250.237±0.013中藥組合物低劑量組0.231±0.0100.247±0.0250.219±0.021表5不同采血時間的中藥組合物含藥血清對成骨細胞增殖的影響注與只于照纟且比4交，*:尸<0.05，**:尸<0.01。與對照組比較，不同給藥濃度的中藥組合物含藥血清對成骨細胞的增殖均沒有促進作用。給藥濃度為5%時，因血清濃度較低，得到的OD值偏低。給藥濃度為10%時，對成骨細胞的增殖也沒有明顯的作用。給藥濃度為15%時，中低劑量組對成骨細胞不僅沒有增殖作用，反而有明顯的抑制作用(P〈0.05)。給藥濃度為20%時，各劑量組對成骨細胞都沒有增殖作用，而都有明顯的抑制作用(P〈0.05)。結果表明，給藥濃度為15%以上時，對成骨細胞有抑制作用，給藥濃度以10%為宜。結果見表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表6中藥組合物含藥血清不同給藥濃度對成骨細胞增殖的影(5±s，/=6)注與對照組比4交，*:代O.05，**:代O.01。4.2中藥組合物含藥血清對成骨細胞ALP活力的影響中藥組合物含藥血清各劑量組對成骨細胞ALP活力均有增強的作用，在各時間點，隨著劑量的增加，堿性磷酸酶的含量逐漸升高；中藥組合物中、低刑量組明顯高于空白對照組及高劑量組(P〈0.05~0.01)。在中藥組合物高、中、低劑量組中，給藥后lh血清組達到藥效頂點，比各劑量給藥后O.5h、2h得到的含藥血清，對促進ALP活力的作用更強。表明給藥后lh采血比較適宜。根據實驗結果，低劑量給藥lh后得到的含藥血清對成骨細胞ALP活力的增強作用最強(P復01)。結果見表7。組別0.5hlh2h空白血清組6.062±0.5946.062±0.5946.062±0.594雌二醇血清組6.277±0.8546.373±0.6126.134±0.946中藥組合物高劑量組6.642±0.5967.014±0.9656.849±0.722中藥組合物中劑量組7.174±0.974*7.344±0.843*7.179±0.996*中藥組合物低劑量組7.119±0.627*7.671±0.516**7.071±0.775*表7中藥組合物含藥血清對成骨細胞ALP活力的影響(天±&/=6)注與只于照纟且比4交，*:代O.05,**:代O.01。4.3中藥組合物含藥血清對成骨細胞形成礦化結節的影響中藥組合物含藥血清各劑量組對成骨細胞形成礦化結節均有促進作用，但中低劑量組的促進作用與對照組比較有顯著的差異(P<0.05)，說明中藥組合物含藥血清具有促進成骨細胞礦化結節形成的作用。結果見表8。組別結節數空白血清組2.000±0.577雌二醇血清組1.857±0.690中藥組合物高劑量組2.571±0.53522<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表8中藥組合物含藥血清對成骨細胞形成礦化結節的影響(5±s，")注與對照纟且比4交，*:P<0.05，**:戶O.Ol。4.4細胞凋亡實驗在流式細胞儀上機測定的結果表明，陽性藥組能稍微降低TNF-oc誘導的成骨細胞凋亡的凋亡率，但沒有統計學差異。中藥組合物中、低劑量對成骨細胞的凋亡率均有降低，以低劑量降低的作用比較明顯(P復05)。結果見表9。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表9中藥組合物含藥血清對TNF-a誘導的成骨細胞凋亡的影響(元±s，/2=4)注與對照組比4交，*:PO.05,**:戶O.Ol。5.上述實施例三結果表明通過對成骨細胞礦化及成骨細胞增殖分化的研究，發現中藥組合物含藥血清加入成骨細胞培養體系后，不能促進成骨細胞增值，但可以刺激成骨細胞4丐化和石威性磷酸酶活性，具有^f足進成骨細胞礦化和分化功能的作用。中藥組合物含藥血清還可部分保護TNF-cc誘導的成骨細胞凋亡，是中藥組合物防治骨質疏松的機制之一。說明中藥組合物含藥血清促進骨形成的作用。實施例二原藥材的選取與實施例一相同，按優選的原藥材配比值的制備步驟如下(1)按每份中骨碎補29%、淫羊藿25%、懷牛膝19%、杜仲20°/。和鹿角片7%的比例稱取各原藥材，備用；(2)將所述重量配比的懷牛膝加70%的乙醇回流提取2次，每次l小時，過濾得濾液I和藥渣，備用；(3)將所述重量配比的骨碎補、淫羊藿、杜仲和鹿角片與步驟(2)中藥渣加水煎煮兩次，第一次加水量為9倍量，第二次加水量為7倍量，每次煎煮l小時，過濾得濾液II,備用；(4)合并濾液I和濾液II，濃縮制成藥液。(5)將步驟(4)中含生藥的藥液在809(TC下干燥，制成粉末狀的中藥組合物。動物實驗與實施例一類似，此處不再贅述。實施例三原藥材的選取與實施例一相同，按可選的原藥材配比值的制備步驟如下(1)按每份中骨碎補37°/。、淫羊蓑30%、懷牛膝13%、杜仲12%和鹿角片8°/。的比例稱取各原藥材，備用；(2)將所述重量配比的懷牛膝加70%的乙醇回流提取2次，每次2.5小時，過濾得濾液I和藥渣，備用；(3)將所述重量配比的骨碎補、淫羊藿、杜仲和鹿角片與步驟(2)24中藥渣加水煎煮兩次，第一次加水量為11倍量，第二次加水量為9倍量，每次煎煮2.4小時，過濾得濾液II,備用；(4)合并濾液I和濾液II，濃縮制成藥液。(5)根據需要將步驟(4)中的中藥組合物與固體制劑中常規輔料混合，制成固體制劑，如片劑、膠嚢劑等。動物實驗與實施例一類似，此處不再贅述。參考文獻'饒華，胡金家，高書亮。成骨樣細胞體外培養法篩選杜仲葉防治骨質疏松癥的藥效成份，解剖學研究，2004,26(2):115-117."^向上，趙文靜，旺建偉。鹿角的藥理作用及臨床應用研究進展，中醫藥信息，2008,25(2):23-25.除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。權利要求1.一種預防和治療骨質疏松的中藥組合物，其特征在于主要由下列重量比的原藥材制成骨碎補25～40％、淫羊藿20～35％、懷牛膝10～25％、杜仲10～25％和鹿角片5～15％。2.根據權利要求1所述預防和治療骨質疏松的中藥組合物，其特征在于各原藥材采用優選用量骨碎補25~35%、淫羊藿20~30%、懷牛膝15~25%、杜仲15~25%和鹿角片5~10°/。。3.根據權利要求1所述預防和治療骨質疏松的中藥組合物，其特征在于各原藥材采用最佳用量骨碎補31%、淫羊藿21%、懷牛膝21%、杜仲21%和鹿角片6%。4.一種預防和治療骨質疏松的中藥組合物的制備方法，包括以下步驟(l)稱取各原藥材骨碎補25~40°/。、淫羊藿20~35%、懷牛膝10~25%、杜仲10~25%和鹿角片5~15%備用；(2)將所述重量配比的懷牛膝加乙醇回流提取2次，每次0.5~3小時，過濾得濾液I和藥渣，備用；(3)將所述重量配比的骨碎補、淫羊藿、杜仲和鹿角片與步驟(2)中得到的藥渣加水煎煮兩次，第一次加水量為所述骨碎補、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步驟(2)中得到的藥渣總重量的9~11倍量，第二次加水量為所述骨碎補、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步驟(2)中得到的藥渣總重量的7~9倍量，每次煎煮0.5~3小時，過濾得濾液II,備用；(4)合并濾液I和濾液II，濃縮制成藥液。5.根據權利要求4所述的一種預防和治療骨質疏松的中藥的制備方法，其特征在于還包括以下步驟(5)所述濾液濃縮后，在809(TC下干燥，制成粉末狀的中藥組合物。6.根據權利要求5所述預防和治療骨質疏松的中藥組合物的制備方法，其特征在于還包括以下步驟(6)將所述活性組分與常用輔料混合，制成固體制劑。7.根據權利要求6所述的預防和治療骨質疏松的中藥的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中乙醇回流提取的時間是1.5小時；所述步驟(3)中第一次加水量為10倍量，第二次加水量為8倍量，每次煎煮1.5小時。8.根據權利要求7所述預防和治療骨質疏松的中藥組合物的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的乙醇濃度為70%。全文摘要本發明涉及一種藥物，是一種預防和治療骨質疏松癥的中藥組合物，本發明還涉及該中藥組合物的制備方法，屬于醫藥
技術領域：
。本發明主要由骨碎補(25～40)％、淫羊藿(20～35)％、懷牛膝(10～25)％、杜仲(10～25)％和鹿角片(5～15)％制成。其制備工藝為按配方稱取各原藥材骨碎補、淫羊藿、懷牛膝、杜仲和鹿角片，懷牛膝醇提、過濾得濾液I和藥渣，將藥渣與骨碎補、淫羊藿、杜仲和鹿角片用水煎煮，過濾得濾液II，合并濾液，濃縮制成含有活性組分的藥液。本發明提供的中藥組方副作用小，對原發性骨質疏松癥具有較好的預防和治療效果。文檔編號A61K36/185GK101455704SQ20081024324公開日2009年6月17日申請日期2008年12月31日優先權日2008年12月31日發明者林謝申請人:林謝