專利名稱：用銅氧還蛋白預防癌癥的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及包含銅氧還蛋白(cupredoxin)的變體、衍生物和結構等價 物的組合物，其抑制哺乳動物細胞、組織和動物中癌前病變的發作。本申 請還涉及銅氧還蛋白、其變體、衍生物和結構等價物作為化學預防劑在哺 乳動物中抑制癌前損傷乃至癌癥的發作中的應用。
背景
癌癥的化學預防是使用天然、合成或生物的化學試劑來逆轉、抑制或 預防侵襲性癌癥的致癌進展。最近在高風險群體中進行的癌癥預防臨床試
7驗表明，化學預防性治療對于高風險患者來說是一種現實的治療方式。化 學預防性治療是基于多病灶區域性致癌和多級致癌的內容。在區域性致癌 中，整個組織區域的致癌物暴露導致組織中上皮細胞普遍損傷和突變細胞 的克隆樣增生。整個區域中的這些遺傳突變增加了所述區域中一種或多種 癌前或癌病變發展的可能。這些基因和表型改變的分級累積多級致癌作用 中，多級致癌中的一個或多個步驟受阻可能阻止或預防癌癥的發展。通常
參見Tsao等，CA Cancer J Clin 54: 150-180 (2004)。
天青蛋白(azurin)和其他銅氧還蛋白對癌細胞具有特異的毒性。天青 蛋白誘導J774肺癌細胞的凋亡，Yamada等，PNAS 99(22): 14098-14103 (2002)。進入J774肺癌細胞后，天青蛋白位于胞質和核片段中，與腫瘤抑 制蛋白p53形成復合物，從而穩定并提高其胞內水平。天青蛋白介導凋亡 作用的誘導并不限于J774細胞。天青蛋白還可進入諸如人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7細胞的癌細胞中，Yamada等，Infect Immun. 70:7054-7062 (2002); Punj等，Oncogene, 23:2367-2378 (2004)。在兩種情況 下，天青蛋白使得胞內p53水平升高，導致Bax形成增加，并誘導所述細 胞的凋亡。更有趣的是，向異種移植Mel-2或MCF-7人腫瘤的裸鼠腹膜內 注射天青蛋白后，導致所述癌癥統計學意義上的顯著退行。
小鼠乳腺器官培養(MMOC)試驗可用于評價潛在的化學預防劑對激 素誘導的乳腺結構分化和DMBA誘導的腺內腫瘤發生前增生肺泡節樣病變
的抑制效果。來自年輕的未交配動物的乳腺在胰島素(1)+催乳素(P)+醛固 酮(A)存在下孵育6天后可分化成完全成熟的乳腺。這些乳腺在形態學上 類似于來自妊娠小鼠的乳腺。醛固酮可以用雌激素(E)+孕酮(Pg)代替， 向培養物中加入氫化可的松(H)剌激了乳腺的功能性分化Mehta和 Banerjee, Acta Endocrinol. 80:501 (1975); Mehta禾口 Moon. Breast Cancer-: Treatment and Prognosis 300， 300 (Basil A Stoll ed., Blackweil Press 1986)。這
樣，在該培養系統中觀察到的激素誘導的結構和功能分化模擬了動物不同 生理學階段中對激素的反應。
在MMOC中，小鼠在癌癥形成前具有顯著的腫瘤前階段。C3H小鼠中
的這種腫瘤前病變由鼠乳腺腫瘤病毒誘導，或在BALB/c小鼠中由DMBA
誘導。在生長期的第3和第4天之間將腺體暴露在2 pg/ml DMBA下，隨后
使所述腺體在僅含胰島素的培養基中復原2-3周即導致乳房肺泡病變
8(MAL)的形成。Hawthorne等，Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002); Mehta等，Methods in Cell Science 19:19-24 (1997)。此外，由含有DMBA誘
導的乳房病變的乳腺制備的上皮細胞移植到同源宿主中導致了乳腺癌的發 生。Telang等，PNAS 76:5886-5890 (1979)。這些腫瘤在病理學上類似于在 給予DMBA的同株小鼠體內觀察到的那些。
MMOC中DMBA誘導的乳房病變形成可通過多種化學預防試劑諸如 維生素A酸類抑制。這些試劑包括衍生自天然產物的化學預防劑，例如 brassinin、 resveretrol、硫醇類、抗氧化劑、鳥氨酸脫羧酶抑制劑諸如OFMO 和魚藤素、前列腺素合成抑制劑、鈣調節劑等等，Jang等，Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eur. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Metha等，J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997)。這些研究清楚的表明該器官培養系統提 供了測定針對乳房致癌作用化合物效果的獨特模型。可以預期，其結果與 體內施用所述化合物獲得的抑制緊密相關。
MMOC也可經誘導形成乳房導管病變(MDL)。若用雌激素和孕酮代替 醛固酮，并在培養基中加入氫化可的松，即可誘導MDL。卵巢甾類存在下 的肺泡結構很小，但在組織病理學切片中可觀察到導管內損傷。Mehta等，J Natl. Cancer Inst. 93: 1 103-1 106 (2001)。選擇性作用于卵巢激素依賴的ER+ 乳腺癌的雌激素拮抗劑諸如他莫昔芬抑制MDL而非MAL形成。這樣，該 經過改良的培養物模型除了常規的MAL誘導外現可用于評價化學治療劑 對MAL和MOL的效果。
所需要的是能抑制癌前病變進展的化學預防劑，所述化學預防劑應當 能預防癌前病變的起始發展，誘導所形成的癌前病變的細胞死亡和/或預防 癌前病變發展成惡性病變。這種化學預防劑在治療尤其是高風險癌癥患者 (由于高風險因素的存在、癌前病變的存在或先前患有癌癥或癌前病變)中 是特別有用的。
蛋白進入哺乳動物細胞的過程通常由所述蛋白的一個小片段所指導， 其通常稱為"蛋白轉導結構域"或PTD。該片段可用作信號連接于外來蛋白 上，以利于所述蛋白轉運至哺乳動物細胞中。例如，兩親肽被用于幫助DNA-解離金屬卟啉類的吸收，可作為潛在的人成纖維細胞HS68或鼠淋巴細胞白 血病L1210細胞中的抗腫瘤藥物(Chaloin, L.等.Bioconjugate Chem. 12:691-700， (2001))。肽類，稱為細胞滲透性肽類，例如penetratin、transportan、Tat (氨基酸47-57或48-60)和模型兩親肽MAP已被用作轉運藥理學重要物 質例如反義寡核苷酸類、蛋白類和多肽類的遞送載體(Hallbrink， M.等， Biochim. Biophys. Acta 1515:101-109 (2001); Lindgren. M.,等，Trends Pharmacol. Sci. 21 :99-103 (2000))。
在37QC或4QC下，這些肽類，尤其是觸角蛋白(Antennapedia)的DNA 結合同源結構域、果蠅轉錄因子或21殘基肽載體Pep-1被多種培養物中的 細胞內化，例如人HS68或鼠NIH-3T3成纖維細胞。溫度變化效應的缺失 暗示了一種不同于經典胞吞作用(Morris. M. C.等，Nature Biotechnol. 19:1173- 1176(2001)，其需要手性受體蛋白質)的穿透機制。哺乳動物細胞中 最廣泛用于轉運藥物活性化合物的肽類是人免疫缺陷病毒1型(HIV-I)反 式作用蛋白Tat的11個氨基酸的精氨酸富集蛋白轉導結構域(PTD) (Seimarze, S. R，等，Science 285:1569-1572(1999), Schwarze, S.R.等，Trends Cell Biol. 10:290-295 (2000))。腹膜內注射120 kDa f3-半乳糖苷酶-Tat融合蛋 白使得所述融合蛋白跨細胞轉導進入事實上所有的小鼠組織中，包括通過 血腦屏障。已顯示HIV-1 Tat的該短肽結構域介導大分子或顆粒的細胞內 化，包括磁性納米顆粒、噬菌體載體、脂質體和質粒DNA。與上述討論的 其他細胞穿透肽類不同，通過全長Tat或其11個氨基酸轉導區域的貨物蛋 白內化在4Y下受到嚴重影響(Liu. Y.等，Nat.Med. 6: 1380-1387(2000)。 Suzuki, T.等，J. Biol. Chem. 277:2437-2443 (2002))，需要與受體例如細胞 膜硫酸類肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素鏈相互作用。
目前大部分已鑒定的PTD衍生自病毒和哺乳動物來源。其他來源的 PTD對于設計多種試驗序列以及動物和人治療和預防措施也是需要的。一 種可選擇的PTD來源是細菌細胞。盡管已知細菌蛋白例如霍亂毒素能進入 哺乳動物細胞質(Sofer， A.和Futerman, A,H. J. Biol. Chem.270: 12117-12122 (1995))，這些蛋白的細胞毒性限制了細菌蛋白或衍生自它們的PTD在哺乳 動物細胞中轉運藥理學重要的載體中的應用。
實施方案概述
本發明涉及包含肽類的組合物，所述肽類可以是銅氧還蛋白的變體、 衍生物和結構等價物，其在哺乳動物細胞、組織和動物中抑制癌前病變的 發展。特別的，這些組合物可包含來自銅綠假單胞菌(i^ez^omo"^am^wosa)的天青蛋白，天青蛋白50-77殘基區域(p28) SEQ ID NO:2，以 及天青蛋白50-67殘基區域(pl8) SEQ ID NO:25。本發明還涉及包含銅氧 還蛋白類和/或銅氧還蛋白類變體、衍生物或結構等價物的組合物，其保留 了在哺乳動物細胞、組織或動物中抑制癌前病變發展的能力。這些組合物 可以是互相分離的肽類或藥物組合物。本發明的組合物可用于預防哺乳動 物患者中癌癥發展的方法中。
本發明的一方面是分離肽，其可以是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結 構等價物；可在哺乳動物組織中抑制癌前病變的發展。所述銅氧還蛋白可 以是天青蛋白、假天青蛋白、質體藍素、鐵硫菌藍蛋白、Laz、橙綠屈撓素、 漆樹藍蛋白和黃瓜堿性蛋白，尤其是天青蛋白。銅氧還蛋白可來自生物體 例如銅綠假單胞菌、糞產堿菌G4/ca/^ew" /aecafe)、木糖氧化無色桿菌 (y4c/zramo6(3c^ ;jqy/oscoa.^3w)、支氣管炎博德特菌(jBoniefe〃af 6rowc/z/邵"ca)、 甲基單胞菌(Afe^y/omowos 5p.)、腦膜炎奈瑟球菌(A^&seWa mem'"g/"cfo)、、淋 病奈瑟球菌(7Ve/5^eWa go"orW2eo)、熒光假單胞菌(尸5^"(iowo"asyZworesce"力、 綠針假單胞菌(尸seMc/o附o"os c/z/orara;7/^)、苛養木桿菌(々/eZ/a々幼Wora)禾口 副溶血性弧菌(ra^'o;^ra/2a謡o/^c"力，特別是銅綠假單胞菌。在某些實施 方案中，所述肽可以是SEQIDNO:l、 3-19的一部分，或與SEQIDNO:l、 3-19具有至少80%的氨基酸序列相同性。
在某些實施方案中，分離肽可以是銅氧還蛋白的截短體。所述分離肽 可以是大于約10個殘基，但不超過大約100個殘基。所述分離肽可包括或 由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77 SEQ ID NO:2、銅綠假單胞菌天青蛋白 殘基50-67 SEQ IDNO:25、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基36-88 SEQIDNO:26 或SEQ ID NO:20-24組成。
本發明的另一方面是一種藥物組合物，其包含藥學上可接受載體內的 至少一種或兩種銅氧還蛋白或本發明的分離的肽。所述藥物組合物可制成 靜脈內施用的形式。在某些實施方案中，所述藥物組合物中的銅氧還蛋白 可來自生物體例如銅綠假單胞菌、C/Zva/^W,&、糞產堿菌、木糖氧化無色 桿菌、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、 熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養木桿菌和副溶血性弧菌，特別是來自 銅綠假單胞菌。所述銅氧還蛋白可以是SEQIDNO:l、 3-19。
本發明的另一方面是治療哺乳動物患者的方法，其通過給患者施用治
ii療有效量的本發明藥物組合物。所述患者可以是人，可以比一般人群具有 更高的癌癥風險。在某些實施方案中，所述癌癥可以是黑色素瘤、乳腺癌、 胰腺癌、成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、肺癌、結直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、 前列腺癌、皮膚癌或宮頸癌。在某些實施方案中，所述患者可具有至少一 種高風險特征、癌前病變或已被治愈癌癥或癌前病變。
所述藥物組合物通過靜脈注射、肌內注射、皮下注射、吸入、局部施 用、透皮貼劑、栓劑、玻璃體注射或口服進行施用，特別是通過靜脈注射 施用。所述藥物組合物可與至少一種其他化學預防藥物共同施用，特別是 在幾乎同時與另一種化學預防藥物共同施用。
本發明的另一方面是包含于小瓶中的本發明藥物組合物的試劑盒。所 述試劑盒可設計用于靜脈施用。
本發明的另一方面是研究癌癥發展的方法，包括使哺乳動物細胞與本 發明的銅氧還蛋白或肽接觸，測定惡化前和惡性細胞的生長。在某些實施 方案中，所述細胞可以是人和/或哺乳動物細胞。在某些實施方案中，所述 細胞被誘導以產生癌前病變。
本發明的另一方面是編碼本發明肽的表達載體。
本發明的另一方面是包含貨物化合物和氨基酸序列的復合物，其中所
述氨基酸序列具有與銅氧還蛋白或其片段至少約90%序列相同性，該氨基 酸序列或其片段與所述貨物化合物連接，并且所述氨基酸序列利于貨物化 合物進入哺乳動物癌細胞。在某些實施方案中，該復合物的氨基酸序列具 有與少于全長野生型銅氧還蛋白或H.8外膜蛋白至少約90%的氨基酸序列
相同性。在其他實施方案中，所述貨物化合物是蛋白、脂蛋白、多糖、核 酸、染料、微粒、納米顆粒、毒素和藥物。在特別的實施方案中，所述貨 物物是蛋白或多肽，其與氨基酸序列連接形成融合蛋白。在其他特別的實 施方案中，所述貨物化合物是毒素，更特別的為銅綠假單胞菌外毒素A。 在其他實施方案中，所述貨物物是可檢測的物質，更特別是可通過熒光、 顯微、X射線CT、 MRI或超聲檢測的物質。最后，本發明還包括位于藥學 上適當載體中的所述復合物。
本發明的另一方面涉及將貨物化合物遞送至細胞內的方法。在一個實 施方案中，該方法包括使一個或多個細胞與上述復合物接觸。在其他實施 方案中，所述細胞來自患有癌癥的患者，并且被回輸至患者體內。在其他實施方案中，所述細胞是癌細胞，更特別是骨肉瘤細胞、肺癌細胞、結腸 癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞、軟組織肉瘤細胞、乳腺癌細胞、肝癌 細胞、膀胱癌細胞或前列腺癌細胞。在其他實施方案中，所述復合物以治 療有效量給患者施用。在其他實施方案中，所述復合物通過靜脈、局部、 皮下、肌內施用或向腫瘤內施用。在其他實施方案中，所述復合物與其他
癌癥治療共同施用。在其他實施方案中，使用DNA和/或RNA作為本發明 復合物的貨物化合物時，RNAi方法、藥物抗性、造血基因轉移、同源重 組、核酶技術、反義技術、腫瘤免疫治療和腫瘤抑制、翻譯研究、癌癥治 療、基因遞送系統(病毒和非病毒的)、抗基因治療(反義，siRNA和核酶)、 凋亡、機制和治療、疫苗開發、免疫學和免疫治療以及DNA合成和修復均 作為其背景技術。在一個特別的實施方案中，所述貨物化合物是反義分子。
本發明的另一方面是癌癥的診斷方法。在某些實施方案中，所述貨物 化合物的復合物是可檢測的物質，施用于患有癌癥的患者后檢測貨物化合 物的位置。在特別的實施方案中，所述貨物化合物是X射線造影劑，通過 X射線CT檢測；所述貨物化合物是磁共振造影劑，通過MRI檢測；所述 貨物化合物是超聲造影劑，通過超聲檢測。在其他實施方案中，所述細胞 與具有可檢測物質的復合物接觸，檢測貨物的位置。
本發明的另一方面是含有任何上述復合物的試劑盒。在某些實施方案 中，所述試劑盒還包括可藥用的佐劑或賦形劑。在其他實施方案中，所述 試劑盒還包括用于施用所述試劑的載體。
本發明的這些和其他方面、優點和特征根據下列附圖和特定實施例的 詳細描述將是顯而易見的。
序列簡述
SEQ ID NO:l.來自銅綠假單胞菌的天青蛋白氨基酸序列(Ala Glu Cys Ser Val Asp Be Gin Gly Asn Asp Gin Met Gin Phe Asn Thr Asn Ala He Tlir Val Asp Lys Ser Cys Lys Gin Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Tip Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gin Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu He Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gin Tyr Met Phe Phe CyssXi dsy PA FA 0H s人i iq丄usv叫d iqo J巧dsy usy々{) "I J9S PA dsv sX3 biv) 「^*邈耷黨曰蜜暴￥明嵐微:^泰目吝'9:OMCIlb3S °(usy人id t\3i可v可v nsi biv可v dsy nsi Siy uid sXi s^i ojj usy s人i可v AO "It pa biv q￡) n3] usy可v ojj biv dsv AD f八wo f八I它a 々d fa兩人id順々9 m丄s舊Jin sX3 s人i iba々d "工伊a人io ojj 可v w丄叫d JMl ib八s人i j;c丄usv nio usv 3ii "1sXi叫d b!v ni￡) biv々{) dsv 3H顯s人i qi jq工伊八usv s!h A{) s人i dsy jqx ojj sqd 叫丄FA Jqi dsV 0Jd BIV FA sXi nsi J" biv 0Jd niD叫j p八可v 々d dsV s人i usv nsi s識I它八WO 9qd dsv可V)「《^誕奪冀日蜜
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SEQIDNO:7.來自木糖氧化無色桿菌亞種反硝化亞種I的天青蛋白 氨基酸序列(Ala Gin Cys Glu Ala Thr He Glu Ser Asn Asp Ala Met Gin Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gin Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr
Gin Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val He Ala His Thr Lys Val He Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn)。
SEQ ID NO:8.來自支氣管炎博德特菌的天青蛋白氨基酸序列(Ala Glu Cys Ser Val Asp He Ala Gly Thr Asp Gin Met Gin Phe Asp Lys Lys Ala He Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gin Phe Thr Val Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gin Ala Val Glu Lys Asp Gly He Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gin Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val Asp)。
SEQ ID NO:9.來自甲基單胞菌J的天青蛋白氨基酸序列(Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser He Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val He Ala Phe Thr Pro He He Gly Gh Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys Ser lyr
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SEQIDNO:14,來自黃瓜的漆樹藍蛋白的氨基酸序列(Met Gin Ser Thr Val His He Val Gly Asp 4sn Thr GSy Trp Ser Val Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gin Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Gly Asp Ser Leu Gin Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn Val His Glu Met Glu Thr Lys Gin Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val He Glu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys Ser Asn Gly Gin Lys Leu Ser lie Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser)。
SEQIDNO:15.來自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素A的氨基酸序列(Met
Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr He Glu He Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala Gly Gin Thr Val Thr He Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gin Gin His Asn Trp He Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn He Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala Asp Lys Ser Asn He He Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr lie Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gin Gly Lys Leu Val Val Asn)。
SEQ ID NO:16.來自橙色綠屈撓菌的橙綠屈撓素B的氨基酸序列(Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu 丁hr Pro Ala Gin 丁hr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gin Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gin Asn Asn Leu Gly Val Gin His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gin Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr He Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr Leuib八sty nsq可v dsy可V usy usy 1119 biv usy I它a 可V可v pa dsy dsV々9々O usy fa nsi pa dj丄usv s!H)fi《^/顏奪葛明 魏愛葛觀68-AS明a峯^齒磐凝明雖^敏香r^凝目來'0乙:ON dl 。3S
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6 'T2960008800SSEQ ID NO:21. 丁香假單胞菌天青蛋白的51-77位氨基酸的氨基酸序 歹U(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala He Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly He Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp》
SEQ ID NO:22.腦膜炎奈瑟球菌Laz的89-115位氨基酸的氨基酸序列 (lie Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly He Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
SEQ ID NO:23.副溶血性弧菌天青蛋白的52-78位氨基酸的氨基酸序 歹U(Ala Asp Thr Ala Asn He Gin Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。
SEQ ID NO:24.支氣管炎博德特菌天青蛋白的51-77位氨基酸的氨基 酸序列(Thr Lys Thr Ala Asp Met Gin Ala Val Glu Lys Asp Gly He Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gin Tyr Leu Lys Ala Gly Asp)。
SEQ ID NO:25.銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-67 P18的氨基酸序列
SEQ ID NO:26.銅綠假單胞菌天青蛋白36-88位氨基酸的氨基酸序列 (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Tip Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gin Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val He Ala His Thr Lys Leu lie Gly)。
SEQ ID NO:27.銅綠假單胞菌天青蛋白36-77位氨基酸的氨基酸序列 (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Tip Val Leu Ser Thr Ala
Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。
SEQ ID NO:28.銅綠假單胞菌天青蛋白36-89位氨基酸的氨基酸序列 (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Tip Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gin Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly Ser)。
SEQ ID NO:29.銅綠假單胞菌天青蛋白36-128位氨基酸的氨基酸序列 (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Tip Val Leu Ser Thr Ala
Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu He Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gin Tyr
,eu Asp Lys Asp
,eu Asp Lys AspMet Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。
SEQ ID NO:30.銅綠假單胞菌天青蛋白53-70位氨基酸的氨基酸序列 (Ala Ala Asp Met Gin Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys)。
SEQ ID NO:31.銅綠假單胞菌天青蛋白53-64位氨基酸的氨基酸序列 (Ala Ala Asp Met Gin Gly Val Val Thr Asp Gly Met)。
SEQ ID NO:32.氨基酸序列DGXXXXXDXXYXKXXD。 SEQIDNO:33.氨基酸序列DGXXXXDXXYXKXXD。
附圖簡述
圖l.圖l描述了用于評價p28和天青蛋白效果的所有腺體的圖像。圖 1A顯示了 DMBA處理的腺體中肺泡病變的代表性圖像，其與用DMBA與 化學預防劑處理的腺體進行對比。
圖1B-1F顯示了 p28對肺泡病變發展效 果的代表性圖譜。
圖2.圖2描述了 p28針對DMBA誘導的哺乳動物肺泡病變效果的圖像。
圖3.圖3描述了導管病變代表性切片和p28的效果。 圖4.圖4描述了p28針對DMBA誘導的導管病變效果的圖像。 圖5.顯示wt-天青蛋白以及wt天青蛋白50-77蛋白轉導結構域中a螺 旋位置的圖像。標出了在天青蛋白50-77區域內3個氨基酸被脯氨酸的替換。 圖6(A)、 (B)和(C)。 (A)圖顯示了 GST-GFP-azu 50-77融合蛋白的結構。 g^D基因在gst基因的3'端引入(形成GST-GFP)， azu 50-77片段隨后在框 架內連接到基因的3'端，產生GST-GFP-azu 50-77融合蛋白。 GST-GFP-azu 50-77從細胞裂解液中作為單獨的蛋白得以純化。純化的蛋白 經SDS-PAGE用考馬氏亮藍染色檢測(6(B))，同樣通過抗天青蛋白抗體用蛋 白印跡檢測(6(C))。
圖7(A)、 (B)和(C)。顯示GST-綠色熒光蛋白(GFP)和GST-GFP-天青 蛋白融合蛋白內化的動態研究的圖像。綠色熒光在J774細胞中測定，其用 不同濃度的GST-GFP (10(a))或GST-GFP-azu 50-77 (10(b))在37°C下處理1 hr。采用流式細胞儀分析了 10000個細胞。(c)時間依賴的GST-GFP-azu 50-77
20內化。J774細胞在37°C下與200 pg/ml GST-GFP-azu 50-77孵育預定的時 間，用流式細胞儀分析。
圖8(A)、 (B)和(C)。 (A)圖顯示了外毒素區域III (氨基酸405-613)，以 及部分區域lb(氨基酸381-404)，其融合至GST(GST-PEDIII)，如早先描述 的GST-GFP融合物那樣。Azu 50-77片段隨后使用PCR連接至GST-PEDIII 的羧基端(GST-PEDIII-azu 50-77)。 (B)所述融合蛋白通過谷胱甘肽Sepharose 4B柱進行凝膠過濾柱色譜純化，SDS-PAGE鑒定大小。(C)圖顯示了 GST-PEDIII-azu 50-77融合蛋白在UISO-Md-2癌細胞和正常成纖維細胞 (FBT)中的作用，通過PEDIII介導的細胞毒性測定。預定的不同濃度的 GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu 50-77與UISO-Md-2和FBT細胞孵育24 h， 隨后通過MTT方法測定細胞存活性。
圖9. GST-PEDIII-鐵硫菌藍蛋白融合蛋白針對UISO-Mel-2癌細胞和 FBT細胞的由PEDIII-介導的細胞毒性圖像。預定的不同濃度的GST-PEDIII 和GST-PEDIII-azu 50-77與UISO-Mel-2和FBT細胞孵育24 h，隨后通過 MTT方法測定細胞存活性。
發明詳述 定義
如本文中所使用的，如果沒有特別描述為"單個細胞"，術語"細胞"包括 該術語的單數或復數形式。
如本文中所使用的，術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"可互換的用于指氨基 酸殘基的聚合物。該術語應用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘 基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物。該術語同樣應用于天然 存在的氨基酸聚合物。術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"也包括修飾，所述修飾 包括但不限于糖基化、脂質連接、硫酸酯化作用、谷氨酸殘基的Y羧化作 用、羥基化作用和ADP核糖基化作用。應當理解，多肽并不總是全部是直 鏈的。例如，作為泛素化的結果，多肽可以是支鏈的， 一般作為翻譯后事 件(包括天然加工作用與非天然發生的人為操作引起的事件)的結果，多肽 可以是環形的(具有或沒有支鏈)。環狀、支鏈和支鏈環狀的多肽可通過非 翻譯天然方法合成，也可通過完全人工合成方法合成。
如本文中所使用的，術語"藥理學活性"表示藥物或其他化學物質對生物系統的作用，化學物質的效果可以是有利的(治療性的)或有害的(毒性 的)。純的化學物質或混合物可以是天然來源的(植物、動物或礦物)，或可 以是合成的化合物。
如本文中所使用的，術語"癌前"表示癌變前的，或不受控制的異常細胞 分裂前。
如本文中所使用的，術語"病變"表示異常組織區域。
如本文中所使用的，術語"病理狀況"包括解剖和生理偏離正常，其構成 活體動物或其一部分正常狀態的損害，妨礙或改變身體機能的表現，是對 各種因素(如營養不良、工業危害或氣候)、對特定傳染物(如蟲、寄生原 生動物、細菌或病毒)、對生物體內在缺陷(如遺傳異常)、或對這些因素組 合的反應。
如本文中所使用的，術語"疾病"包括解剖和生理偏離正常，其造成活體 動物或其一部分正常狀態的損害，妨礙或改變身體機能的能力。
如本文中所使用的，術語"患有"包括目前顯示病理狀況的癥狀，盡管 沒有可觀察到的癥狀但具有病理狀況，在從無病理狀況中恢復或已從病理 狀況中恢復。
如本文中所使用的，術語"化學預防"是指藥物、維生素或其他試劑的使 用，試圖減少癌癥的風險或延遲癌癥發作或復發。
如本文中所使用的，術語"治療"包括預防、降低、停止或逆轉與正在治 療疾病相關的疾病或癥狀的進展或嚴重程度。因此，術語"治療"包括視情況 的藥物、治療和/或預防施用。治療也可包括防止或減輕疾病例如癌癥的發 作。
如本文中所使用的，術語"抑制細胞生長"表示減緩、停止細胞分裂和/ 或細胞膨脹。該術語同樣包括抑制細胞發育和增加細胞死亡。
"治療有效量"是指有效防止、減緩、停止或逆轉正在治療對象的特定疾 病的發展、或部分或總體減輕特定疾病的現有癥狀的量。治療有效量的確 定在本領域技術人員能力范圍之內。
如本文中所使用的，術語"基本上純的"，當用于修飾本發明的蛋白或其 他細胞產物時，指的是例如從培養基或細胞內容物分離的蛋白形式為基本 沒有或基本上未摻雜其他蛋白質和/或其他化合物。術語"基本上純的"指的
是一種因子的量是分離部分干重的至少約75%，或至少"75%基本上純的"。
22更具體而言，術語"基本上純的"是指一種化合物是分離部分干重的至少約
85%,或至少"85%基本上純的"。最具體而言，術語"基本上純的"是指一種 化合物是分離部分干重的至少約95%，或至少"95%基本上純的"。術語"基 本上純的"也可用于修飾本發明的人工合成蛋白質或化合物，其中，例如合 成的蛋白質從合成反應的試劑和副產物分離。
如本文中所使用的，術語"藥物級"，當指本發明的肽或化合物時，是基 本上或主要從組分分離的肽或化合物，該組分通常伴隨在天然狀態發現的 該物質，包括合成試劑和副產物，以及基本上或主要從可能損壞其藥用的 成分分離。例如，"藥物級"肽可與任何致癌物分離。在某些情況下，"藥物 級"可以通過意欲施用的方法修飾，例如"靜脈藥物級"，從而指定肽或化合 物基本上或主要從任何可能使組合物不適于給患者靜脈施用的物質分離。 例如，"靜脈藥物級"肽可以從去垢劑(例如SDS)和抗菌劑(例如疊氮化物) 分離。
術語"分離的"、"純化的"或"生物純的"指的是物質基本上沒有或主要沒 有通常伴隨以其天然狀態發現的物質的組分。因此，根據本發明的分離的 肽優選不含有通常與它們原環境有關的物質。"分離的"多肽區域指的是所述 區域不包括所述區域來源的多肽整個序列。"分離"的核酸、蛋白或各自片段 基本上從其體內環境移出，因此可以由技術人員操作，例如但不限于核苷
酸測序、限制酶切消化、定點誘變、亞克隆到用于核酸片段表達載體中以 及獲得基本上純的量的蛋白質或蛋白質片段。
這里相對于肽使用的術語"變體"，指的是與野生型的多肽相比，具有替 換、缺失或插入的氨基酸的氨基酸序列變體。變體可以是野生型肽的截短 體。因此，變體肽可以通過操作編碼所述多肽的基因而制得。"缺失"是從所 述多肽內部除去一個或多個氨基酸，而"截短體"指從所述多肽的一端或兩端 除去一個或多個氨基酸。這樣，變體可以通過改變多肽的基本組成或特征 但不改變至少其某些藥理學活性而制得。例如天青蛋白的"變體"可以是突變 的天青蛋白，其保持天青蛋白抑制哺乳動物癌細胞生長的能力。在某些情 況下，變體肽是用非天然氨基酸(例如"3， 5-二硝基苯甲酰)-Lys殘基)合成 的。Ghadiri&Fernholz， J.Am.Chem.Soc.， 112: 9633-9635(1990)。在某些 實施方案中，與野生型肽相比，變體中被替換、缺失或插入的氨基酸不超 過20個。在某些實施方案中，與野生型肽相比，變體中被替換、缺失或插
23入的氨基酸不超過15個。在某些實施方案中，與野生型肽相比，變體中被替換、缺失或插入的氨基酸不超過10個。在某些實施方案中，與野生型肽相比，變體中被替換、缺失或插入的氨基酸不超過6個。在某些實施方案中，與野生型肽相比，變體中被替換、缺失或插入的氨基酸不超過5個。在某些實施方案中，與野生型肽相比，變體中被替換、缺失或插入的氨基酸不超過3個。
如本文中使用的，術語"氨基酸"指的是含有任何天然存在或非天然存在或人工合成的氨基酸殘基的氨基酸部分，也就是任何包含至少一個羧基和直接連接一個、二個、三個或更多碳原子、 一般為一個(a)碳原子的至少一個氨基的部分。
在這里相對于肽使用術語"衍生物"指的是衍生自目標肽的肽。衍生包括化學修飾肽，使得肽仍保留其某些基本功能。例如，天青蛋白的"衍生物"可以，例如是化學修飾的天青蛋白，仍保留其抑制哺乳動物細胞血管發生的能力。感興趣的化學修飾包括但不限于肽的酰胺化、乙酰化、硫酸酯化、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化或糖基化。此外，衍生肽可以是多肽或其片段與化合物的融合物，所述化合物例如但不限于另一肽、藥物分子或其它治療劑或藥劑或可檢測探針。
術語"氨基酸序列相同性百分比(％)"被定義為當比對兩個序列時在多肽中與候選序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為了確定氨基酸相同性％，比對序列，如果有必要，引入缺口來實現最大的序列相同性％;保守性替換不被認為是序列相同性的部分。確定相同性百分比的氨基酸序列比對方法是本領域技術人員公知的。通常，公眾可獲得的計算機軟件，例如BLAST、 BLAST2、 ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件被用于比對肽序列。在特定的實施方案中，使用長復雜性過濾器、預期IO、字大小3、存在性11和延伸1的缺省參數來使用Blastp(可從國家生物技術信息中心，BethesdaMD獲得)。
當進行氨基酸序列比對時，給定的氨基酸序列A同、與或相對給定的氨基酸序列B的氨基酸序列相同性％(其換句話說可表達為給定氨基酸序列A具有或包含同、與或相對給定氨基酸序列B的一定％氨基酸序列相同性)
可計算為
c/。氨基酸序列相同性-X/Y"00，其中
X是氨基酸殘基數，其通過A和B的序列比對程序比對或序列比對算法比對評分為相同匹配；
Y是B中氨基酸殘基的總數。
如果氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，A對B的％氨基酸序列相同性不等于B對A的％氨基酸序列相同性。當用長序列與短序列相比時，短序列為"B"序列。例如當截短肽與相應的野生型多肽相比時，截短肽為"B"序列。
概述
本發明提供了包含銅氧還蛋白、銅氧還蛋白變體、衍生物以及結構等價物的組合物，以及預防哺乳動物癌癥發展的方法。本發明還提供了銅氧還蛋白變體、衍生物以及結構等價物，其保留了預防哺乳動物癌癥發展或癌癥復發的能力。更特別的，本發明提供了包含銅綠假單胞菌天青蛋白、天青蛋白變體、衍生物和結構等價物的組合物，以及其治療患者、尤其是比普通群體發展成癌癥風險更高的患者的用途，最后，本發明提供了研究哺乳動物細胞、組織和動物癌癥發展的方法，其在誘導癌前病變之前或之后，使細胞與銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結構等價物接觸，并觀察癌前和/或癌細胞的發展。
先前，已知銅綠假單胞菌加工的氧化還原蛋白銅氧還蛋白天青蛋白，選擇性地進入J774肺癌細胞而非進入正常細胞，并且誘導凋亡。Zaborina等人，Microbiology 146:2521-2530 (2000)。天青蛋白同樣能選擇性地進入并殺死人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7細胞。Yamada等，PNAS99:14098-14103 (2002); Punj等，Oncogene 23:2367-2378 (2004)。來自銅綠假單胞菌的天青蛋白優先進入J774鼠網狀細胞肉瘤細胞，與腫瘤抑制蛋白p53形成復合物并將其穩定。提高p53的胞內濃度，并誘導細胞凋亡。Yamada等，Infection and Immunity 70:7054-7062 (2002)。對于天青蛋白分子的各種結構域進行詳細研究表明50-77位氨基酸(p28) (SEQIDNO:2)顯示對內化和隨后的細胞凋亡活動重要的蛋白轉導結構域(PTD)。 Yamada等，CellMicrobial. 7: 1418-1431 (2005)。
現在已知天青蛋白以及衍生自天青蛋白的肽類，例如p28和p18，具有
25化學預防性質。現在已知天青蛋白p28預防小鼠乳腺器官培養物中癌前腫瘤前病變的形成。在小鼠乳腺器官培養物模型中，發現50 pg/ml的天青蛋白能抑制67%的肺泡病變形成。類似的，25 pg/ml的p28被發現能抑制67%的肺泡病變形成，參見實施例l。此外，發現50 pig/ml的天青蛋白能抑制79%的導管病變，而25 pg/ml的p28能抑制71%的導管病變，參見實施例1 。共焦顯微鏡檢查和FAC顯示天青蛋白和p28進入正常小鼠乳上皮細胞(MM3MG)和乳腺癌細胞(4T1)。 P28還以溫度、時間和濃度依賴的方式進入人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，并以劑量依賴的方式抑制鋪于Matrigel⑧上的HUVEC形成毛細管。共焦顯微鏡檢査和FAC還顯示p18選擇性地進入人黑色素瘤(Mel-2,7,29)、乳腺(MCF-7)、卵巢(SK-0V3)、胰腺(CAPAN-2)、膠質母細胞瘤(LN-229)、星形細胞瘤(CCF-STTG1)、前列腺(LN-CAP)和腎臟(ACHN-CRL1611)細胞系。此外，在具有異種移植黑色素瘤的無胸腺小鼠中用紅外染料( iein800nm)標記的pl8成像清楚的顯示，其在原初皮下腫瘤和遠端器官轉移灶中選擇性地吸收，而不在正常器官和組織中積聚。因此現在已知天青蛋白和天青蛋白的變體可用于在哺乳動物患者中抑制癌前腫瘤前病變的形成，進而抑制癌癥尤其是乳腺癌的發展。
包括放療和化療的標準癌癥治療方法包括損傷癌細胞的DNA。對正常DNA損傷的細胞應答包括DNA修復的激活、細胞周期停滯和致死性(Hall，Radiobiology for the Radiologist, Harper和Row, 1988)。例如，DNA雙鏈斷裂的誘導導致了致死性的染色體畸變，其包括缺失、雙中心粒、成環和后期橋(Hall， Radiobiology for the Radiologist, Harper和Row, 1994)。
由于本發明的肽類被腫瘤和各種癌細胞選擇性地吸收，現在已知這些肽類(包括在一個實施方案中為p18)可用作非病毒載體以將物質引入腫瘤和癌細胞中。例如，本發明的肽類可用于將DNA或RNA片段導入癌細胞中，進而對腫瘤或癌細胞提供治療性DNA或RNA片段處理。
以下描述了非限制性的示范性技術和/或可通過本發明的肽類導入的特定DNA或RNA片段，并且，在一個實施方案中，pl8促進連接分子進入哺乳動物癌細胞。例如，本發明可與基因治療、RNAi方法、造血基因轉移、同源重組、核酶技術、反義技術、腫瘤免疫治療和腫瘤抑制基因、翻譯研究、抗基因治療(反義、siRNA和核酶)、細胞凋亡、免疫學和免疫治療、DNA合成和修復一起使用。基因治療包括將外源基因，例如腫瘤抑制基因或細胞凋亡誘導物在適于所述基因表達的條件下轉移至癌細胞內。 一旦表達，所述基因產物通過減緩腫瘤細胞生長、抑制其轉移能力或完全殺死腫瘤細胞產生對腫瘤細胞的有益效果。歷史上，癌癥基因治療的臨床效果受到以下因素限制l)對腫瘤內的治療性基因表達缺乏控制，以及2)載體到腫瘤的選擇性靶向。本發明的化合物解決了腫瘤細胞的選擇性靶向問題。此外，應用了某些策略以控制基因的表達。
一種策略是轉錄靶向作用，其中調控治療性基因的啟動
子被腫瘤選擇性的轉錄因子激活。實例包括MUC-1啟動子在乳腺癌中的應用和CEA啟動子在結腸癌中的應用(Kurihara等，"Selectivity of a replication-component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUClantigen," J. Clin. Invest. 106(6): 763-771， 2000; Konishi等，"Transcriptionallytargeted in vivo gene therapy for carcinoembrionic antigen-producingadenocarcinoma," J. Med. ScL， 48(3): 79-89, 1999)。
反義引物技術依賴于核酸分子向細胞的導入，其通常與所選擇基因表達的mRNA互補。反義引物分子通常抑制mRNA分子的翻譯，防止了所述基因編碼的多肽的表達。反義引物技術的修飾可預防所選擇基因的轉錄，其通過使所述基因的DNA與反義引物分子結合形成三鏈體進行。根據本發明可使用的一種特別的反義藥物是G3139 (同樣稱為oblimersen;由Genta.Inc., Lexington, MA制備)。另一種可使用的特定的反義引物分子是G4460(也稱為c-myb反義引物；由Genta， Berkeley Heights, NJ制備)。
本發明的肽類也可連接基于RNA干擾(RNAi)的分子。RNAi通常由雙鏈RNA ("dsRNA")、短發夾RNA ("shRNA")或其他具有類似性質的核酸分子介導。這些核酸分子通過細胞酶類(包括Dicer和Drosha)被加工或切割成更小的片段。所述核酸分子的更小片段隨后被介導mRNA降解的蛋白質復合物(RISC復合物)吸收。所述RISC復合物將降解與其吸收的核酸分子具有互補堿基對的mRNA。通過這種方式，mRNA被特異的破壞，從而防止了蛋白質的編碼。
核酶技術依賴于核酸分子向細胞的導入，其表達與靶RNA分子結合并催化其選擇性切割的RNA分子。所述靶RNA分子通常為mRNA分子，但其可以是，例如逆轉錄病毒RNA分子。
通過同源重組的靶基因的缺失也是本發明可用的一種策略，其需要兩個基因失活事件(每個等位基因一個)。
與本發明化合物有關的特定治療也可針對癌癥特異性的轉錄復合物
(CSTC)進行，其能控制對癌癥發展重要的蛋白質的表達。例如，美國專利 申請號2008/0027002，其直接針對CSTC的腫瘤治療引入本文作為參考。
由于銅氧還蛋白之間的高度結構相似性，很可能除天青蛋白外的其他 銅氧還蛋白也會抑制哺乳動物中的癌前病變的形成。可以在例如細菌或植 物中發現所述的銅氧還蛋白。 一些銅氧還蛋白已知具有與來自銅綠假單胞 菌的天青蛋白類似的藥代動力學性質。例如，來自氧化亞鐵硫桿菌的鐵硫 菌藍蛋白也可進入巨噬細胞并誘導細胞凋亡。Yaraada等，Cell Cycle 3: i 182-1 18 (2004); Yamada等，Cell. Micro. 7:1418-1431 (2005)。來自層理席 藻的質體藍素和來自裂環無色桿菌的假天青蛋白對巨噬細胞也是細胞毒性 的。美國專利公開號20060040269， 2006年2月23日公開。因此認為其他 銅氧還蛋白也可用于本發明的組合物和方法中。此外，保留了其抑制哺乳 動物癌癥形成功能的銅氧還蛋白的變體、衍生物和結構等價物也可用于本 發明的組合物和方法中。這些變體和衍生物可包括但不限于銅氧還蛋白 的截短物，氨基酸的保守性取代和蛋白修飾，諸如聚乙二醇化和a-螺旋的 全烴化穩定。
本發明的組合物
本發明提供了作為銅氧還蛋白變體、衍生物或結構等價物的肽類，其 抑制哺乳動物細胞、組織和動物中癌前病變的發展。本發明還提供了作為 銅氧還蛋白變體、衍生物或結構等價物的肽類，其抑制哺乳動物細胞、組 織和動物中癌癥的發展。在某些實施方案中，所述肽是分離的。在某些實 施方案中，所述肽是基本上純的或藥物級的。在其他實施方案中，所述肽 在組合物中，所述組合物包含或基本上由所述肽組成。在另一個特定的實 施方案中，所述肽是無抗原性的，并且不能在哺乳動物、更具體為人中引 起免疫應答。在某些實施方案中，所述肽小于全長的銅氧還蛋白，并保留 了銅氧還蛋白的某些藥理學活性。具體而言，在某些實施方案中，所述肽 可保留在鼠乳腺器官培養物中抑制癌前病變發展的能力。
本發明還提供包括至少一種肽的組合物，所述^s:為銅氧還蛋白，或銅 氧還蛋白的變體、衍生物或結構等價物。特別是在藥物組合物中。在特定的實施方案中，所述藥物組合物被設計成特定的給藥模式，例如但不限于， 口服、腹膜內或靜脈施用。所述組合物可以在水中水合，或可以被干燥(例 如通過凍干)以用于以后的水合。所述組合物可以在除水以外的溶劑中，例 如但不限于醇。
本發明還提供了包含肽類的組合物，所述肽為銅氧還蛋白的變體、衍 生物或結構等價物，其選擇性地進入哺乳動物細胞、組織和動物內的癌細
胞和/或腫瘤中。在某些實施方案中，所述肽是具有SEQIDNO:25的p18。 在某些實施方案中，所述組合物是pl8與DNA或RNA的偶聯物，在某些 實施方案中，所述DNA或RNA是基因或基因的一部分。在某些實施方案 中，所述DNA或RNA—旦在遞送后具有治療效果。
由于銅氧還蛋白之間高度的結構同源性，考慮銅氧還蛋白具有和天青 蛋白與p28同樣的化學預防性質。在某些實施方案中，所述銅氧還蛋白為 但不限于天青蛋白、假天青蛋白、質體藍素、鐵硫菌藍蛋白、橙綠屈撓素、 漆樹藍蛋白、黃瓜堿性蛋白或Laz。在特定的實施方案中，所述天青蛋白衍 生自銅綠假單胞菌、糞產堿菌、木糖氧化無色桿菌反硝化亞種L (Achromobacter xylosoxidans denitrificans 1)、支氣管炎博德特菌、甲基單胞 菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛 養木桿菌、百日咳石蓴菌和副溶血性弧菌，在一個非常特定的實施方案種， 所述天青蛋白來自銅綠假單胞菌。在其他特定的實施方案中，所述銅氧還 蛋白包含SEQIDNO:l、 3-19的氨基酸序列。
本發明提供了作為氨基酸序列變體的肽類，其與野生型銅氧還蛋白相 比具有替換、缺失或插入的氨基酸。本發明的變體可以是野生型銅氧還蛋 白的截短體。在某些實施方案中，本發明的肽包含小于全長野生型多肽的 銅氧還蛋白的區域。在某些實施方案中，本發明的肽包含截短銅氧還蛋白 的超過約10個殘基、超過約I5個殘基或超過約20個殘基。在某些實施方 案中，本發明的肽包含截短銅氧還蛋白的不超過大約100個殘基、不超過 約50個殘基、不超過約40個殘基、不超過約30個殘基或不超過約20個 殘基。在某些實施方案中，銅氧還蛋白具有所述肽，更具體為與本發明的 SEQ ID NO:l、 3-19至少約70%的氨基酸序列相同性、至少約80%的氨基 酸序列相同性、至少約90%的氨基酸序列相同性、至少約95%的氨基酸序 列相同性或至少99%的氨基酸序列相同性。在特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白的變體包含銅綠假單胞菌天青
蛋白的殘基50-77 (p28, SEQ ID NO:2)、天青蛋白殘基50-67 (pl8, SEQ ID NO:25)，或天青蛋白殘基36-88 (SEQ IDNO:26)。在其他實施方案中，所述 銅氧還蛋白的變體由銅綠假單胞菌天青蛋白的殘基50-77 (P28， SEQ ID NO:2)、天青蛋白殘基50-67 (pl8, SEQ ID NO:25)，或天青蛋白殘基36-88 (SEQIDNO:26)組成。在其他特定的實施方案中，所述變體由天青蛋白以外 的銅氧還蛋白的等價殘基組成。也可考慮可以設計其他銅氧還蛋白變體， 其具有和天青蛋白殘基50-77 (SEQ ID NO:2)或天青蛋白殘基36-88 (SEQ ID NO:26)類似的藥理學活性。為了達到此目的，采用BLAST、 BLAST2、 ALIGN2或Megalign (DNASTAR)將目標銅氧還蛋白氨基酸序列與銅綠假 單胞菌天青蛋白序列進行比對，相關殘基位于銅綠假單胞菌天青蛋白氨基 酸序列上，在目標銅氧還蛋白序列上發現等價殘基，從而設計等價肽。
在本發明的一個實施方案中，所述銅氧還蛋白變體包含橙色綠屈撓菌 的橙綠屈撓素B的至少57-89位氨基酸(SEQ ID NO:20)。在另一個實施方 案中，所述銅氧還蛋白變體包含銅綠假單胞菌天青蛋白的至少50-67位氨基 酸(SEQIDN0 25)。在本發明的另一個實施方案中，所述銅氧還蛋白變體 包含丁香假單胞菌天青單胞的至少51-77位氨基酸(SEQ ID NO:21)。在本 發明的另一個實施方案中，所述銅氧還蛋白變體包含腦膜炎奈瑟氏球菌Laz 的至少89-115位氨基酸(SEQIDNO:22)。在本發明的另一個實施方案中， 所述銅氧還蛋白變體包含副溶血性弧菌天青蛋白的至少52-78位氨基酸 (SEQIDNO:23)。在本發明的另一個實施方案中，所述銅氧還蛋白變體包含 支氣管炎博德特菌天青蛋白的至少51-77位氨基酸(SEQIDNO:24)。
所述變體也包括由合成的而非天然存在的氨基酸形成的肽。例如，非 天然存在的氨基酸可以整合到所述變體肽中，從而延長或優化所述組合物 在血流中的半衰期。所述變體包括但不限于D、 L-肽類(非對映異構體) (例如Futaki等，J. Biol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo等，Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller等，Biochem. Pharmacol. 36(1): 169-76， (1987);含有非天然氨基酸的肽類(例如Lee等，J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004));接有烴類環鉤的含烯烴的非天然氨基酸(例如Schafmeister等，J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski等，Science 305:1466-1470 (2004));以及包含e-(3,5-二硝基苯甲酰基)-Lys殘基的肽。
30在其他實施方案中，本發明的肽是銅氧還蛋白的衍生物。銅氧還蛋白 的衍生物是所述肽的化學修飾，以使得所述肽仍保留其某些基本活性。例 如，天青蛋白的"衍生物"可以是化學修飾的天青蛋白，其保留了在哺乳動物 細胞、組織或動物中抑制癌前病變發展的能力。感興趣的化學修飾包括但
不限于所述肽的烴穩定、酰胺化、乙酰化、硫酸酯化、聚乙二醇(PEG)修飾、 磷酸化和糖基化。此外，衍生的肽可以是銅氧還蛋白或其變體、衍生物或 結構等價物與化學化合物的融合物，所述化合物例如但不限于另一肽、藥 物分子或其他治療劑或藥劑或可檢測的探針。感興趣的衍生物包括例如通 過本領域技術人員公知的方法進行化學修飾，通過所述修飾本發明的肽和 組合物在血流中的半衰期可以被延長或優化，所述方法包括但不限于環化 肽(例如Monk等，BioDrugs 19(4):261誦78， (2005); DeFreest等，J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004))、N-末端和C-末端修飾(例如Labrie等，Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990))和接有烴類環鉤的含烯烴的非天然氨基酸(例如 Schafineister等，J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski等， Science 305:1466-1470 (2004》。
在另一個實施方案中，所述肽是銅氧還蛋白的結構等價物。確定銅氧 還蛋白和其他蛋白質之間顯著的結構同源性的研究實例包括Toth等 (Developmental Cell 1 :82-92(2001 ))。特別的，銅氧還蛋白和所述結構等價 物之間的顯著結構同源性通過使用VAST算法確定。Gibmt等，Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej等，Proteins 23:356-3690 (1995)。在特定 的實施方案中，來自銅氧還蛋白與所述結構等價物之間結構比較的VASTp 值小于大約10—3，小于大約10'5，或小于大約10—7。在其他實施方案中，可 利用DALI算法測定銅氧還蛋白與所述結構等價物之間的顯著結構同源性。 Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)。在特定的實施方案中，配 對結構比較的DALIZ分值至少為約3.5，至少為約7.0，或至少為約10.0。
預期本發明的組合物的肽可以是超過一種銅氧還蛋白的變體、衍生物 和/或結構等價物。例如，所述肽可以是經過PEG化的天青蛋白的截短體， 因此使其既是變體又是衍生物。在一個實施方案中，使用接有通過釕催化 的烯烴置換的全烴類"環鉤(staple)"的含攜帶烯烴的鏈(tether)的a， a-二取代 的非天然氨基酸來合成本發明的肽。Scharmeister等，J. Am， Chem. Soc. 122:5891 -5892(2000); Walensky等，Science 305:1466-1470 (2004)。此夕卜，天青蛋白結構等價物的肽可以與其他肽融合，因此可形成既是結構等價物 又是衍生物的肽。這些實例僅是示范性的，并不限制本發明。銅氧還蛋白 的變體、衍生物或結構等價物可以結合或不結合銅。
在某些實施方案中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物具有
銅綠假單胞菌天青蛋白、特別是p28的某些藥理學性質。在一個特定的實 施方案中，銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結構等價物可以預 防哺乳動物細胞、組織或動物、特別但不限于乳腺細胞中癌前病變的發展。 本發明同樣提供了銅氧還蛋白和銅氧還蛋白的變體、衍生物和結構等價物， 其具有抑制哺乳動物癌前病變發展的能力，特別但不限于黑色素瘤、乳腺 癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、肺癌、結直腸癌、頭頸癌、膀 胱癌、前列腺癌、皮膚癌和宮頸癌細胞。抑制癌細胞的發展是癌前病變的 任何減少或增加率變小，與對照治療相比具有統計學顯著性。
由于現在已知銅氧還蛋白能夠抑制哺乳動物細胞、組織或動物、特別 是乳腺細胞中癌前病變的發展，最終抑制癌癥，現在可以設計保留該化學 預防活性的銅氧還蛋白的變體和衍生物。例如形成銅氧還蛋白的各種變體、 衍生物和結構等價物的"庫"，隨后利用本領域抑制的多種方法之一，例如實 施例1中的示范性方法測試每一個的化學預防活性、特別是在小鼠乳腺器 官培養物中的化學預防活性，從而產生此類變體、衍生物和結構等價物。 考慮代替或除天青蛋白或p28夕卜，得到的具有化學預防活性的銅氧還蛋白 變體、衍生物和結構等價物可用于本發明的方法。
在某些特定的實施方案中，銅氧還蛋白的變體、衍生物或結構等價物 可抑制小鼠乳腺器官培養物(MMOC)中7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)誘導的 癌前病變發展至統計學上不同于未處理的對照的程度，利用實施例1中或 Mehta等，(JNatl Cancer Inst93: 1 103-1106 (2001 ))和Mehta等，(MethCell Sci 19:19-24 (1997))描述的MMOC模型系統，可檢測肽的這種活性。其他 用于確定癌癥發展是否被抑制的方法也是本領域公知的，也可以使用。
在某些特定的實施方案中，銅氧還蛋白的衍生物或結構等價物在 MMOC模型中抑制哺乳動物肺泡病變(MAL)的發展至統計學上不同于未 處理的對照的程度。在某些特定的實施方案中，銅氧還蛋白的變體、衍生 物或結構等價物在MMOC模型中抑制哺乳動物導管病變(MDL)的發展至 統計學上不同于未處理的對照的程度。利用如實施例1中所描述的DMBA
32誘導形成癌前病變的MMOC模型系統，可以檢測肽的所述活性。對MMOC 模型系統中癌前病變的發展評價可通過如實施例1中提供的形態學分析或 組織病理學分析確定。
在某些特定的實施方案中，所述變體、衍生物或結構等價物可選擇性 地進入哺乳動物細胞中的癌細胞和/或腫瘤中。在某些實施方案中，所述變 體是plS的衍生物或結構等價物。至基些實施方案中，所述變體、衍生物 或結構等價物可選擇性地進入哺乳動物細胞、組織和動物中的癌細胞和/或 腫瘤中，并且遞送DNA或RNA。在某些實施方案中，所述DNA或RNA 是基因或基因的一部分。在某些實施方案中，所述DNA或RNA—旦遞送 后具有治療效應。
銅氧還蛋白
這些小的藍銅蛋白(銅氧還蛋白)是電子傳遞蛋白(10-20kDa)，其參與細 菌電子傳遞鏈或具有未知功能。銅離子單獨被蛋白基質結合。兩個組氨酸 和一個半胱氨酸配體圍繞銅的特殊的歪三角形平面排列產生金屬位點很奇 特的電子特性和強烈的藍顏色。很多銅氧還蛋白均已經以中到高的分辨力 在結晶上得到表征。
通常銅氧還蛋白具有低序列相同性但具有高的結構同源性。Gcmgh& Clothia， Structure 12: 917-925(2004); DeRienzo等人，Protein Science 9: 1439-1454(2000)。例如，天青蛋白的氨基酸序列與橙綠屈撓素B的氨基酸 序列的相同性為31%，與鐵硫菌藍蛋白為16.3。/。，與質體藍素為20.3%，與 假天青蛋白為17.3%。參見表l。但是，這些蛋白質的結構相似性更明顯。 比較天青蛋白與橙綠屈撓素B的結構的VASTp值為100 _7'4，天青蛋白與 鐵硫菌藍蛋白為1(T5，天青蛋白與質體藍素為10—5，6，天青蛋白與假天青蛋 白為IO"41。
所有的銅氧還蛋白具有八-鏈回形拓撲結構(Greekkey) p-桶或P-夾層折 疊，并具有高度保守的位點結構。DeRienzo等人，Protein Science 9: 1439-1454 (2000)。由于很多長鏈脂肪族殘基例如蛋氨酸和亮氨酸的存在， 一顯著的疏水區存在于天青蛋白、花青苷、藍細菌質體藍素、黃瓜堿性蛋 白的銅位點周圍，在假天青蛋白和真核質體藍素的小范圍內。同上。也發 現疏水區在漆樹花青苷和鐵硫菌藍蛋白銅位點的小范圍內，但是具有不同的特征。同上。
表1.采用VAST算法將來自銅綠假單胞菌的天青蛋白(1JZG)與其它蛋 白質進行序列和結構比對。
PDB比對長度1氨基酸相同性°/。P值2評分3均方根偏差4說明
1AOZA28218.310-712.21.9抗壞血酸氧化酶
1QHQA113310-7.412.11.9橙綠屈撓素B
1V54B17920.310-6.011.22.1細胞色素c氧化酶
1GY2A9216.310-5.011.11.8鐵硫菌藍蛋白
3MSPA748.110-6.710.92.5可動主要精子蛋白5
1IUZ7420.310-5.610.32.3質體藍素
1KGYE905.610-4.610.13.4Ephrinb2
1PMY7517.310-4.19.82.3假天青蛋白
^匕對長度疊加在兩個結構之間的相同C-a原子對的數量，即多少殘 基用于計算3D重疊。
2p值VASTp值是所述對較的顯著性的度量，表示為概率。例如， 如果p值為0.001，那么純隨機性地看見性質相符的幾率為1/1000。運用 MMDB數據庫中有500個獨立和不相關的域的假定，調整VAST的p值是 為了多重比較。因而被500除后，所述p值符合每個域對成對比較的p值。
3評分VAST結構相似性分值。這一數字與二級結構重疊元素的數字 以及重疊的質量相關。高的VAST分值意味著高的相似性。
4RMSD:以埃為單位的均方根重疊殘基。在兩個結構最佳重疊之后這 一數字被計算出來，作為等價a碳原子之間均方距離的方根。注意RMSD 值隨著結構比對的范圍而標定，當使用RMSD描述整個結構相似性時，必 須考慮所述大小。
5線蟲主要精子蛋白被證明在卵母細胞成熟中是一種ephrin拮抗物。 Kuwabara， Genes和Development 17: 155-161(2003)。
天青蛋白
天青蛋白是具有128個氨基酸殘基的含銅蛋白質，其屬于銅氧還蛋白 家族，參與某些細菌的電子傳遞。天青蛋白包括來自銅綠假單胞菌(PA) (SEQ IDNO:l)、木糖氧化產堿菌(A.xylosoxidans)和反硝化產堿菌的那些。
34Murphy等人，J.Mol.Biol.315: 859-871(2002)。天青蛋白之間的氨基酸序列 相同性在60-90%之間變化，這些蛋白顯示高的結構同源性。所有天青蛋白 具有獨特的具有回形拓撲結構基序的P-夾層，并且單個銅原子總是位于該 蛋白質的同一區域。此外，天青蛋白在銅位點周圍具有基本中性的疏水區。 同上。
質體藍素
質體藍素是真核細菌、藻類和植物的可溶性蛋白，其在每個分子中含 有一分子的銅，并且它們的氧化型為藍色。它們出現在葉綠體中，作為電 子載體發揮作用。自從在1978年測定了白楊質體藍素的結構，藻類(柵藻， 稱苔，衣藻)和植物(法國菜豆)質體藍素的結果也用晶體學或NMR方法進行 測定，并且白楊結構已經精確到1.33 A的分辨率。SEQ ID NO:3顯示來自 層理席藻， 一種喜溫藍藻類細菌的質體藍素的氨基酸序列。另一種感興趣 的質體藍素來自Wva戸加&。
盡管藻類和維管植物之間的質體藍素序列趨異(例如衣藻蛋白和白楊蛋 白之間的序列相同性為62%)，但三維結構是保守的(例如在衣藻蛋白和白楊 蛋白之間Ca位置的0.76Arms偏差)。結構特征包括位于八鏈反平行j3-桶一 個末端的扭曲四面體型銅結合位點、顯著的負電區和平坦的疏水表面。銅 位點對于其電子傳遞功能是優化的，負電和疏水區被設想參與生理反應配
偶體的識別。化學修飾、交聯和定位誘變試驗已經證實負電和疏水區在與 細胞色素f的結合相互作用中的重要性，并證實在質體藍素中有兩個功能重 要的電子傳遞路徑模型的正確。 一條假定的電子傳遞路徑是相對短的(約 4A)，并包括疏水區中暴露于溶劑的銅配體His-87，而另一條更長(約 12-15A)，包括負電區中幾乎保守的殘基Tyr-83。 Redinbo等人， J.Bioenerg.Biomem br.26: 49-66( 1994)。
鐵硫菌藍蛋白
鐵硫菌藍蛋白是藍色含銅單鏈多肽，其得自硫桿菌屬(現在被稱作酸硫 桿狀菌屬)。利用多波長不規則衍射對來自氧化亞鐵硫桿菌的極其穩定和高 氧化性的銅氧還蛋白鐵硫菌藍蛋白(SEQ ID NO:4)的氧化型進行X-射線晶 體結構測定，分辨率精確到1.9 A。鐵硫菌藍蛋白是由核心(3-夾層折疊構成，所述P-夾層折疊由六鏈和七鏈b-片層構成。與其它銅氧還蛋白類似，銅離子同分布于扭曲四面體的四個保守殘基(His 85， Cys 138， His 143， Met 148) 組成的簇相配位。Walter, R丄等人，J.Mol.Biol.263: 730-51(1996)。假天青蛋白假天青蛋白是藍色含銅單鏈多肽家族。得自裂環無色桿菌的假天青蛋 白的序列顯示于SEQ ID NO:5。假天青蛋白的X射線結構分析顯示它與天 青蛋白具有相似的結構，盡管這些蛋白質之間具有低序列同源性。假天青 蛋白和天青蛋白的整體結構之間存在兩個主要區別。相對于天青蛋白，假 天青蛋白具有由兩個a-螺旋組成的羧基末端延伸。在中部肽區域，天青蛋 白包含伸長的環，而在假天青蛋白中具有縮短的環。其形成含有短(x-螺旋 的瓣(flap)。在銅原子位點上唯一的主要不同是，MET側鏈構象和Met-S銅 鍵長度，其在假天青蛋白中明顯短于在天青蛋白中。植物花青苷(phytocyanin)可鑒定為植物花青苷的蛋白質包括但不限于黃瓜堿性蛋白、漆樹花青 苷、mavicyanin、香辣根花青素、黃瓜剝皮銅氧還蛋白、推定的豌豆莢中的 藍色銅蛋白，以及一種來自擬南芥的藍色銅蛋白。除了黃瓜堿性蛋白和豌 豆莢蛋白以外，在其它的蛋白中通常位于軸向藍色銅位點的甲硫氨酸配體 被谷氨酰胺替換。橙綠屈撓素從嗜熱綠色滑動光合細菌橙色綠屈撓菌分離得到三種小型藍色銅蛋 白，名為橙綠屈撓素A、橙綠屈撓素B-1和橙綠屈撓素B-2。兩種B型是糖 蛋白，并且性質幾乎彼此相同，但與A型不同。十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰 胺凝膠電泳顯示其表觀單體分子量分別為14(A)、 18(B-2)和22(B-l)KDa。橙綠屈撓素A的氨基酸序列測定表明其為一個具有139個殘基的多肽。 VanDreissche等人，Protein Science 8: 947-957(1999)。如果在已知的小銅 蛋白質體藍素和天青蛋白中均為進化上保守的金屬配體的話，那么在一定 程度上His58、 Cysl23、 Hisl28和Metl32都預期某種程度上被分隔。二級 結構預測也指出橙綠屈撓素具有與銅綠假單胞菌天青蛋白和白楊葉質體藍36素相似的普通P桶狀結構。但是，橙綠屈撓素看起來具有小銅蛋白質序列 分類的序列特征。與天青蛋白共同序列的總體相似性與大體上與質體藍素
相同，即30.5%。橙綠屈撓素N端序列區域1-18富含甘氨酸和羥基氨基酸。 同樣，參見橙色綠屈撓菌橙綠屈撓素A鏈典型的氨基酸序列SEQIDNO:15 (NCBI蛋白質數據庫登錄號AAM12874)。
橙綠屈撓素B分子具有標準的銅氧還蛋白折疊。人們已經研究了橙色 綠屈撓菌橙綠屈撓素B的晶體結構。Bond等人，J.Mol.Biol.306: 47-67 (2001)。除了一個額外的N-端鏈以外，其分子與細菌銅氧還蛋白天青蛋白 非常相似。如同在其它銅氧還蛋白中一樣，其中一個銅配基位于多肽的鏈4 上，其它三個沿著鏈7和鏈8之間的大環。參照后面三個配基之間的氨基 酸間隔討論銅位點的幾何學。橙綠屈撓素B晶體學特征的銅結合域可能被 一 N端尾部限于細胞質膜的外周胞質側，該N端尾部與其它幾個膜相關電 子傳遞蛋白中的鏈顯示出顯著的序列相同性。在McManus等人 J.Biol.Chem.267: 6531-6540(1992)有B型氨基酸序列的報道。橙色綠屈撓 菌橙綠屈撓素鏈B典型的氨基酸序列參見SEQ ID NO: 16 (NCBI蛋白質數據 庫登錄號1QHQA)。
漆樹花青苷
漆樹花青苷是植物花青苷的一個亞類，是植物銅氧還蛋白普遍存在的 一個家族。這里漆樹花青苷典型的序列包括在SEQIDNO:14中。香辣根花 青素是來自山葵根的一種漆樹花青苷(Koch等，J.Am.Chem.Soc. 127-158-166(2005)，其與黃瓜漆樹花青苷(Hart等，Protein Science 5: 2175-21 S3(1996))的晶體結構也是已知的。此蛋白有著與其它植物花青苷相 似的總折疊。EphrinB2蛋白外部域三級結構具有與漆樹花青苷的顯著相似 性。Toth等，Developmental Cell 1: 83-92(2001)。典型的漆樹花青苷氨基 酸序列可以在國立生物技術信息中心蛋白數據庫登錄號1JER， SEQ ID NO:14中找到。
黃瓜堿性蛋白
典型的黃瓜堿性蛋白氨基酸序列包含在本文SEQIDNO:17中。黃瓜堿 性蛋白(CBP)， 一種I型藍色銅蛋白的晶體結構分辨率的精確度已被精確到1.8 A。該分子類似其它藍色銅蛋白，具有一種回形拓撲p桶狀結構，但桶 狀結構在一側開口，最好描述為"卩三明治"或"卩玉米面豆巻"。Guss等人， J.Mol.Biol.262: 686-705(1996)。 EphrinB2蛋白外部域三級結構與黃瓜堿性 蛋白具有高度相似性(50個a碳rms偏差1.5A)。Toth等，Developmental Cell 1: 83-92(2001)。
銅原子具有通常的藍色銅NNSS'配位，其鍵長為Cu-N(His39)=1.93A， Cu-S(Cys79)=2.16A， Cu-N(His84)=1.95A， Cu-S(Met89)=2.61A。 二硫化 物連接，(Cys52)-S-S-(Cys85)，在穩定分子結構中扮演著重要角色。在藍色 銅蛋白的一個亞家族(植物花青苷)，以及一種非金屬蛋白豚草過敏原Ra3 中，多肽折疊是典型的，CBP與其具有高度的序列相同性。目前可鑒定為 植物花青苷的蛋白質是CBP、漆樹花青苷、mavicyanin、香辣根花青素、黃 瓜剝皮銅氧還蛋白、推定的豌豆莢中的藍色銅蛋白、以及擬南芥中一種藍 色銅蛋白。除了CBP和豌豆莢蛋白以外，在其它的蛋白中通常位于軸向藍 色銅位點的甲硫氨酸配體被谷氨酰胺替換。黃瓜堿性蛋白的典型序列可以 在NCBI蛋白數據庫登錄號2CBP， SEQ IDNO:17中找到。
使用方法
技術領域：
本發明提供了在其他方面健康的患者中預防新惡性腫瘤的方法，包括 給患者施用如上所述的至少一種肽，所述肽為銅氧還蛋白或其變體、衍生 物或結構等價物。化學預防治療基于阻斷癌發生相關的進程可預防癌癥的 發展這一假設。銅氧還蛋白銅綠假單胞菌天青蛋白和截短的天青蛋白p28 已知能通過抑制癌前病變的最初形成或殺死或抑制已有癌前病變的生長從 而抑制癌前病變的發展。因此考慮如上所述的具有抑制癌前病變發展能力 的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物可用于其他方面健康患者的 化學預防治療中。這些其他方面健康的患者在某些實施方案中為比普通群 體具有更高癌癥發病風險的患者。可以用本發明的組合物治療預防的癌癥 包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、 肺癌、結直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和宮頸癌。在某些 實施方案中，患者可以是人。在其他實施方案中，患者不為人。
本發明還提供了研究癌癥發展的方法，包括在用致癌物誘導之前或之 后將哺乳動物細胞與包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的組合物接觸，并觀察所述細胞的發展。在某些實施方案中，所述細胞是小鼠 乳腺細胞。在其他情況下，所述細胞是可變成惡性的哺乳動物其他細胞。
比普通群體具有更高癌癥發病風險的患者可以是具有高風險特征的患 者、具有癌前病變的患者以及其最初癌癥己治愈或其癌前病變最后得到治
療的患者。 一般性參見Tsao等，CA Cancer JClin 54: 150-180(2004)。高風
險特征可以是患者的行為、遺傳、環境或生理因素。易使患者患有多種形 式的癌癥的行為因素包括但不限于抽煙、飲食、飲酒、激素替換治療、更 高的體重指數、未經產、檳榔使用、頻繁漱口水的使用、暴露于人乳頭瘤 病毒、兒童和慢性日光照射、早期性交、多個性伙伴以及口服避孕藥的使 用。易使患者患有多種形式的癌癥的遺傳因素包括但不限于癌癥的家族史、 BRCA1和BRCA2的基因載體狀態、乳腺瘤的病史、家族性腺瘤性息肉病 (FAP)、遺傳性非息肉性結腸直腸癌(HNPCC)、紅色或金黃色頭發和淺膚色 表型、著色性干皮病以及種族性。易使患者患有多種形式的癌癥的環境因 素包括但不限于暴露于氡、多環芳香烴類、鎳、鉻酸鹽、砒霜、石棉、氯 甲基醚、苯并[a]芘、輻射以及來自橡膠或涂料的職業性暴露的芳香胺類。 其他易使患者患有多種形式的癌癥的多方面因素包括但不限于帶氣流阻塞 的慢性阻塞性肺疾病、慢性膀胱感染、血吸蟲病、老年和免疫受損的狀態。
此外，具有癌癥發病更高風險的患者可通過使用己開發的用于某些種 類癌癥的不同風險模型確定。例如，可通過Gail風險模型或Claus模型確 定易患有乳腺癌的患者。參見Gail等，J Natl Cancer Inst 81 :1879- 1886 (1989); Cuzick， Breast 12:405-411 (2003); Huang等，Am J Epidemiol 151:703-714(2000)。
具有癌前病變的患者癌癥發病的風險比普通群體更高。本領域公知有 許多方法可確定患者中癌前病變的存在。可測定患者中源于癌前病變的中 間標記物或生物標記物，以確定該患者是否隱藏了癌前病變。在大多數癌 癥患者的腫瘤細胞和鄰近組織學正常組織中發生染色體異常。染色體異常 的發展伴隨著從癌前病變到侵襲性癌癥的表型發展。Thiberville等，Cancer Res. 55:5133-5139(1995)。因此，與癌癥相關的染色體異常可用于中間標記 物以在患者中檢測癌前病變。與癌癥相關的染色體異常包括但不限于腫瘤 抑制基因例如3p(FfflT和其他)、9p(pl611^4、 pl5皿4B和pl9，為9p21)、 17p(對于p53基因為17pl3，以及其他)和13q(對于視網膜母細胞瘤基因Rb為13ql4，以及其他)的等位缺失或雜合性丟失(LOH)。 3p和9p的缺失與 吸煙和早期肺癌有關，Mao等，J. Natl. Cancer Inst. 89:857-862(1997)。影響 3p、 5q、 8p和17p的缺失是上皮樣癌中的通常變化。 一般性參見Tsao等， CA Clin. Cancer J. Clin. 54:153 (2004)。其他與癌癥相關的染色體突變包括活 化癌基因的那些。其存在可用于中間標記物的癌基因包括但不限于Ras、 c-myc、表皮生長因子、erb-B2和細胞周期蛋白類E、 D1和B1。 一般性參 見同上154。
其他中間標記物可以是癌前細胞和癌細胞中基因上調的產物。在癌前 細胞中可能上調的基因包括但不限于環加氧酶類COX-l和COX-2、端粒 末端轉移酶。癌細胞和某些癌前細胞的其他生物標記物包括但不限于，p53、 表皮生長因子受體(GFR)、增殖細胞核抗原(PCNA)、 RAS、 COX-2、 Ki-67、 DNA非整倍性(aneuploidy)、 DNA聚合酶-a、 ER、 Her2neu、 E-鈣粘聯蛋白、 RAR卩、hTERT、 pl6^^4a、 FHIT (3pl4)、 Bcl畫2、 VEGF誦R、 HPV感染、LOH 9p21、 LOH17p、 p-AKT、 hnRNPA2/Bl、 RAF、 Myc、 c-KIT、細胞周期蛋 白D1、 E和B1、 IGF1、 bcl-2、 p16、 LOH3p21.3、 LOH3p25、 LOH9p21、 LOH 17pl3、 LOH13q、 LOH8p、 hMSH2、 APC、 DCC、 DPC4、 JV18、 BAX、 PSA、 GSTP1、 NF-kB、 API、 D3S2、 HPV感染、LOH3pl4、 LOH4q、 LOH 5p、膀胱腫瘤抗原(BTA)、 BTKTRAK(Alidex. Inc., Redmond WA)、泌尿道 基質蛋白22、纖維蛋白降解產物、自分泌運動因子受體、BCLA-4、細胞角 蛋白20、透明質酸、CYFRA 21 -1、 BCA、 beta-人絨毛膜促性腺激素以及 組織多肽抗原(TPA)。 一般性參見同上"5-157。
最初癌癥已治愈或其癌前病變最后得到治療的患者同樣具有比普通群 體更高的癌癥發病風險。第二原發性腫瘤指有癌癥病史的患者體內新的原 發性腫瘤。第二原發性腫瘤是頭頸癌死亡的主要原因。同上150。第二原發 性腫瘤不同于轉移瘤，前者是新生的，而后者來源于己存在的腫瘤。已治 愈癌癥或乳腺癌、頭頸癌、肺癌和皮膚癌的癌前病變的患者形成第二原發 性腫瘤的風險尤其要高。
包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的組合物可通過本領 域技術人員公知的許多途徑和許多方案施用給患者。在特定的實施方案中， 所述銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物可通過靜脈內、肌內、皮 下、腹膜內、局部、口服或吸入施用。所述組合物可通過任何遞送肽類至
40具有癌癥發病風險患者體內位點的方法施用給患者。在特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物通過靜脈內施用。
在一個實施方案中，所述方法可包含將一單位劑量的包含銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結構等價物的組合物和一單位劑量的包含另一化學預防藥物的組合物給患者共施用。它們以任意順序在大約相同的
時間施用，或在給定的時間內接著另一次施用。例如大約1分鐘到大約60分鐘，接著另一藥物的施用，或大約1小時到大約12小時接著另一藥物的施用。感興趣的化學預防性藥物包括但不限于他莫西芬、芳香酶抑制劑例如來曲唑和阿那曲唑(Arimidex⑧)、維生素A酸類例如N-[4-羥苯基]維胺(4-HPR，芬維A胺)、非甾體抗炎藥(NSAIDs)例如阿司匹林和舒林酸、塞來昔布(COX-2抑制劑)、二氟甲基鳥氨酸(DFMO)、熊去氧膽酸、3-羥基-3-甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑、EKI-785 (EGFR抑制劑)、貝伐單抗(VEGF-受體的抗體)、西妥昔單抗(EGFR抗體)、維生素例如維生素A、 |3胡蘿卜素、13-順式維A酸、異維A酸和棕櫚酸視黃酯(retinyl palmitate)、 a-生育酚、干擾素、溶瘤腺病毒dll520(ONYX-015)、吉非替尼、阿維a酯、非那雄胺、吲哚-3-原醇、白藜蘆醇、綠原酸、雷洛昔芬和奧替普拉。
促進化合物選擇性進入癌細胞和腫瘤中的組合物
本發明涉及遞送貨物化合物進入細胞的方法和材料。根據本發明，貨物化合物的遞送通過使用合適的轉運多肽完成。在本發明的一個實施方案中，所述貨物化合物與轉運多肽連接。合適的轉運多肽包括銅氧還蛋白，或含有"銅氧還蛋白入胞結構域"的銅氧還蛋白片段。術語"銅氧還蛋白入胞結構域"指包含銅氧還蛋白進入哺乳動物癌細胞所需要的氨基酸序列的銅氧還蛋白片段。通過本發明遞送的貨物化合物包括但不限于蛋白質、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸(包括RNA、 DNA和反義核酸、染料、熒光和放射性標記、微粒或納米粒子、毒素、無機和有機分子、小分子和藥物(例如化學預防藥物)。在某些實施方案中，所述藥物和毒素殺死腫瘤細胞。
在本發明的一個實施方案中，所述銅氧還蛋白是天青蛋白，例如來自銅綠假單胞菌的天青蛋白(SEQIDNO:l)。在本發明的其他實施方案中，所述銅氧還蛋白尤其是質體藍素、鐵硫菌藍蛋白或假天青蛋白。在特定的實施方案中，所述天青蛋白尤其來自銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌 腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、副溶血性弧菌或支氣管炎博德特菌。
在一個實施方案中，遞送貨物化合物以阻止或延緩細胞中、例如癌細胞的細胞周期進程。這樣的癌細胞可以是，例如尤其是骨肉瘤細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、淋巴瘤細胞、淋巴細胞、軟組織肉瘤細胞或乳腺、肝、膀胱或前列腺肉瘤細胞。例如，所述貨物化合物可以尤其是細胞周期調控
蛋白，例如p53;細胞周期依賴激酶抑制劑，例如pl6、 p21或p27;自殺蛋白例如胸苷激酶或硝基還原酶；細胞因子或其他免疫調節蛋白例如白介素l、白介素2或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);或毒素，例如銅綠假單胞菌外毒素A。在其他實施方案中，可遞送上述化合物種類之一的生物活性片段。在另一個實施方案中，遞送貨物化合物以產生靶組織圖像。例如，所述靶組織可以是癌癥，貨物化合物可以是通常用于產生供X射線計算機斷層攝影(CT)、磁共振成像(MRI)和超聲檢測影像的化合物。在這些實施方案中，所述貨物化合物伽馬射線或正電子發射放射同位素、磁共振成像造影劑、X射線造影劑或超聲造影劑。
本發明還包括將DNA或RNA選擇性導入哺乳動物癌細胞的方法。在這樣的實施方案中，所述DNA或RNA是貨物化合物。在某些實施方案中，該方法包括提供與DNA或RNA偶聯的p18，并將所述化合物導入哺乳動物體內。在某些實施方案中，所述DNA或RNA是基因或基因片段。在某些實施方案中，所述DNA或RNA —旦導入哺乳動物細胞后具有治療效果。
銅氧還蛋白入胞結構域(Cupredoxin Entry Domain)
本發明提供了一種蛋白轉導結構域，其可將相連的貨物轉運入哺乳動物癌細胞而不是非癌細胞。已發現銅氧還蛋白包含蛋白轉導結構域，銅氧還蛋白入胞結構域，其可促進相連的貨物進入哺乳動物癌細胞。在某些實施方案中，可使用整個銅氧還蛋白以促進轉運相連的貨物選擇性地進入癌細胞。在其他實施方案中，可使用銅氧還蛋白的一部分轉運相連的貨物進入癌細胞。在某些實施方案中，所述銅氧還蛋白入胞結構域由銅氧還蛋白區域組成，該區域長度小于全長野生型蛋白質。在某些實施方案中，所述銅氧還蛋白入胞結構域由銅氧還蛋白的超過約10個殘基、約15個殘基或者約20個殘基組成。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域由銅氧還蛋白的不超過約50個殘基、約40個殘基或者約30個殘基組成。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域與銅氧還蛋白具有至少約90%的氨基酸序列相同性、至少約95%的氨基酸序列相同性或者至少約99%的氨基酸序列相同性。
在某些實施方案中，所述銅氧還蛋白入胞結構域是天青蛋白入胞結構域。在本發明的一個實施方案中，天青單胞入胞結構域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸50-77 (SEQIDNO:2)。在本發明另一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸36-77(SEQIDNO:27)。在本發明另一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸36-89 (SEQIDNO:28)。在本發明另一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸36-128 (SEQ ID NO:29)。在本發明又一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸50-67 (SEQ IDNO:25)。在本發明另一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸53-70 (SEQ ID NO:30)。在本發明又一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域至少含有銅綠假單胞菌天青蛋白的氨基酸53-64 (SEQIDNO:31)。
在本發明另一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域是來自銅綠假單胞菌天青蛋白以外銅氧還蛋白的入胞結構域。在不同的實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域可以是藍細菌層理席藻的質體藍素(SEQIDNO:3)、氧化亞鐵硫桿菌鐵硫菌藍蛋白(SEQIDNO:4);裂環無色桿菌假天青蛋白(SEQIDNO:5)、 丁香假單胞菌天青蛋白(SEQ ID NO:21)、腦膜炎奈瑟氏球菌天青蛋白(SEQIDNO:10)、副溶血弧菌天青蛋白(SEQ ID NO:8)或橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素(SEQIDNO:15和16)的片段。
在本發明另一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素B的氨基酸57-89 (SEQ ID NO:20)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少丁香假單胞菌天青蛋白的氨基酸51-77 (SEQ ID NO:21)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少腦膜炎奈瑟氏球菌Laz的氨基酸89-115 (SEQ ID NO:22)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少副溶血弧菌天青蛋白的氨基酸52-78 (SEQ IDNO:23)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少支氣管炎博德特菌天青蛋白的氨基酸51-77 (SEQ IDNO:24)。
銅氧還蛋白入胞結構域的修飾
在本發明的另一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域被化學修飾或遺傳改變以產生保留了轉運貨物化合物進入細胞能力的變體。例如，實施例14顯示在54、 61、 70位導入脯氨酸殘基的銅綠假單胞菌天青蛋白保留了進入UISO-Mel-2細胞的能力。
在另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域包含保守的氨基酸序列DGXXXXXDXXYXKXXD (SEQ ID NO:32)或DGXXXXDXXYXKXXD(SEQ ID NO:33)，其中D是天冬氨酸、G是甘氨酸、Y是酪氨酸、K是賴氨酸、X是任意氨基酸。見實施例17。
銅氧還蛋白入胞結構域的變體可通過標準技術合成。衍生物是直接形成自天然化合物或經修飾或部分取代形成的氨基酸序列。類似物是與天然化合物結構相似但不相同、在某些組分或側鏈有所不同的氨基酸序列。類似物可以是合成的，也可以來自不同的進化起源。
如果衍生物或類似物含有修飾的氨基酸，則變體可以是全長的或不是全長的。銅氧還蛋白入胞結構域的變體包括但不限于包含某些區域的分子，所述區域與銅氧還蛋白入胞結構域基本上同源，在相同大小的氨基酸序列上或者通過同源性算法進行比對與一比對序列進行比較時，具有至少約65%、 70%、 75%、 85%、 90%、 95%、 98%或99%的相同性。
在另一個實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域的變體與銅綠假單胞菌的天青蛋白殘基50-77 (SEQ ID NO:2)具有顯著的結構相似性。在其他實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域的變體與銅綠假單胞菌的天青蛋白殘基50-67 (SEQ IDNO:25)具有顯著的結構相似性。測定銅氧還蛋白和其他蛋白顯著結構同源性的研究例子包括Toth等(Developmental Cell 1:82-92(2001))。具體的，銅氧還蛋白入胞結構域的變體與銅綠假單胞菌的天青蛋白殘基50-77 (SEQ ID NO:2)之間的顯著結構同源性是通過VAST算法確定的(Gibrat等，Curr Opin Struct Biol 6:3~7-385 (1996): Madej等，Proteins23:356-3690 (1995))。在特定的實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域變體與銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77 (SEQ ID NO:2)結構對比的VASTp值小于約l(T3、小于約10—s或者小于約l(T7。在其它實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域變體與銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77 (SEQ ID NO:2)之間的顯著結構同源性可通過DALI算法測定(Holm & Sander， J Mol.Biol.233 :123-138(1993))。在具體實施方案中，配對結構對比的DALIZ分值至少約3.5、至少約7.0或者至少約10.0。
可使用本領域中己知的方法對銅氧還蛋白入胞結構域進行修飾，例如寡核苷酸介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描與PCR誘變。可對克隆的DNA進行定點誘變(Carter ， Biochem J.237 : 1-7 (1986); Zollerand Smith,Methods EnzymoL 154: 329-50(1987))、盒式誘變(cassette mutagenesis),限制選擇誘變(Wells等，Gene 34: 315-23(1985))或其它已知技術以產生銅氧還蛋白入胞結構域變體核酸。此外，編碼與銅氧還蛋白入胞結構域具有結構相似性的入胞結構域的核苷酸可通過本領域中所熟知的方法合成。另外，野生型蛋白質分子或變體銅氧還蛋白入胞結構域可通過本領域中所熟知的方法合成。
編碼銅氧還蛋白入胞結構域及與貨物化合物連接的銅氧還蛋白入胞結構域復合物的核酸
另一方面，本發明提供了編碼融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含與貨物化合物相連的銅氧還蛋白入胞結構域，其中所述貨物化合物為蛋白質或肽。本發明的核酸分子可通過組合本領域中已知技術進行制備。例如，可通過化學合成或克隆分別制備編碼銅氧還蛋白入胞結構域和貨物化合物的核酸序列。然后用連接酶將核酸序列順序相連形成感興趣的核酸分子。
使用銅氧還蛋白入胞結構域遞送貨物化合物的方法
已知許多富精氨酸肽能轉位通過哺乳動物細胞膜并攜帶蛋白質貨物化合物進入此類細胞。Suzuki. T.,等.J. Biol. Chcm. 277:2437-43 (2002)。例如，HIVTat蛋白的富精氨酸的11個氨基酸短片段(氨基酸47-57)能夠使貨物蛋白質轉運進入哺乳動物細胞。Schwarze， SR.，等.Trends Cell Biol. 10:290-95(2000)。已經示出增加a-螺旋含量并優化精氨酸殘基位置的合成入胞結構域增強了其作為蛋白轉導結構域的潛力。Ho， A.，等CancerRes.6h474-77(2001)。相比之下，銅氧還蛋白天青蛋白只有一個精氨酸殘基。因此
45在本發明中有理由相信但不能確保其進入模式與Tat蛋白的不同。
本發明涵蓋了促進貨物化合物進入細胞的那些銅氧還蛋白片段的應 用。可通過任一鑒別那些入胞所需片段的方法確定這些片段。在一種此類 方法中，銅氧還蛋白片段與標記物質相連并進行測試以確定銅氧還蛋白片 段是否進入細胞。這種方法可用于鑒定上述銅氧還蛋白的適當片段。
在本發明的不同實施方案中，所述貨物化合物附著于銅氧還蛋白，例 如銅綠假單胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO:l);藍細菌層理席藻的質體藍素 (SEQIDNO:3);氧化亞鐵硫桿菌的鐵硫菌藍蛋白(SEQ ID NO:4);或裂環 無色桿菌的假天青蛋白(SEQIDNO:5)、 丁香假單胞菌的天青蛋白片段 (SEQ ID NO:21)、腦膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白(SEQ ID NO:10)、副溶血 弧菌的天青蛋白(SEQIDNO:19)、支氣管炎博德特菌的天青蛋白(SEQ ID NO:8)、橙色綠屈撓菌的橙綠曲撓素A和B蛋白(SEQ IDNO:15和16)，以 及其它天青蛋白和天青蛋白樣蛋白。在其它實施方案中，所述貨物與銅氧 還蛋白入胞結構域例如p28 (SEQ ID NO:2)或p18 (SEQ ID NO:25)相連。
在本發明的不同實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域可在體外、離體 (exvivo)或體內將貨物化合物輸送進入細胞。例如，可通過將銅氧還蛋白入 胞結構域與貨物化合物的復合物加入細胞培養物中如巴氏涂片(pap smear) 實現體外輸送。或者，將復合物加入取自患者的樣品如血液、組織或骨髓 并將處理后的樣品返回患者體內實現離體輸送。還可通過將所述復合物直 接施用給患者實現輸送。本發明的方法可用于治療、預防、診斷或研究目 的。本發明所輸送的貨物化合物包括但不限于蛋白質、脂蛋白、多肽、肽、 多糖、核酸(包括反義核酸)、染料、微粒和納米粒子、毒素、有機和無機分 子、小分子及藥物。
在一個實施方案中，可檢測的物質，例如熒光物質，如綠色熒光蛋白； 發光物質；酶，如p-半乳糖苷酶；或者是放射標記或生物素化的蛋白質被 輸送進入細胞，從而賦予細胞可檢測的表型。與此相似，還可輸送用可檢 測物質例如熒光物質標記的微粒或納米粒子。適當納米粒子的一個例子可 見于2002年5月7日授權的美國專利6，383，500，其內容并入本文作參考。 許多這種可檢測物質為本領域技術人員所已知。
在某些實施方案中，所述貨物化合物是適合X射線計算機斷層攝影術 (CT)、磁共振成像(MRI)、超聲成像或放射性核素閃爍成像術的可檢測物質。在這些實施方案中，所述貨物化合物施用給患者用于診斷目的。造影劑可
作為貨物化合物施用以增強通過X射線CT、 MRI和超聲獲得的圖像。通過 銅氧還蛋白入胞結構域施用靶向腫瘤組織的放射性核素貨物化合物可用于 放射性核素閃爍成像術。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域可含 有具有貨物化合物或不具有貨物化合物的放射性核素。在其它實施方案中， 所述貨物化合物是發出伽馬射線或正電子的放射性同位素、磁共振成像造 影劑、X射線造影劑或超聲造影劑。
適用于貨物化合物的超聲造影劑包括但不限于生物相容性氣體微氣 泡、液體載體以及表面活性劑微球，在靶部分與微氣泡之間可進一步包含 任選的連接部分Ln。在本文中，術語液體載體是指水溶液，術語表面活性 劑是指可降低溶液界面張力的任何兩性物質。EP0727225A2揭示了適合于 形成表面活性劑微球的表面活性劑列表，其內容并入本文參考。術語表面 活性劑微球包括納米球、脂質體、囊泡等。生物相容性氣體可以是空氣或 碳氟化合物，例如在超聲成像中產生回聲差別進而形成造影的C3-C5全氟 垸。所述氣體包囊或含在銅氧還蛋白入胞結構域任選通過連接基團附著其 上的微球中。附著可以是共價的、離子的或者通過范德華力。此類造影劑 的具體例子包括脂質包囊的全氟碳，其具有多種腫瘤新生血管受體結合肽、 多肽或肽模擬物。
適用作貨物化合物的X射線造影劑包括但不限于一或多種原子序號20 或以上的、可吸收X射線的原子或"重"原子，在銅氧還蛋白入胞結構域和 X射線吸收原子之間可進一步包含任選的連接部分Ln。 X線造影劑中經常 使用的重原子是碘。最近揭示了包含金屬螯合物的X射線造影劑(例如美國 專利5，417,959)以及包含多個金屬離子的多螯合物(polychdate)的X射線造 影劑(例如美國專利5,679,810)。更近一些時候還揭示了用作X射線造影劑 的多核簇狀復合物(multinuclear cluster complex)(例如美國專利5,804,161、 PCT WO91/14460及W092/17215)。
適用作貨物化合物的MRI造影劑包括但不限于一或多種順磁性金屬離 子，在銅氧還蛋白入胞結構域和順磁性金屬離子之間可進一步包含任選的 連接部分Ln。順磁性金屬離子以金屬復合物或金屬氧化微粒的形式存在。 美國專利5,412,148和5,760,191描述了用于MRI造影劑中順磁性金屬離子 螯合劑的例子。美國專利5,801,228、 5,567,411及5,281,704描述了用于MRI造影劑的復合一個以上順磁性金屬離子的多螯合劑的例子。美國專利
5,520,904描述了包含用于MRI造影劑的順磁性金屬離子的微粒組合物的例 子。
在另一實施方案中，貨物化合物被遞送來殺傷細胞或阻礙細胞周期進 展，所述細胞例如是癌細胞。這種癌細胞可以是例如骨肉瘤細胞、肺癌細 胞、結腸癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞、軟組織肉瘤細胞、乳腺癌細 胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞或前列腺癌細胞。例如，所述貨物化合物可以 是細胞周期調控蛋白，如p53;細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物，如pl6、 p21或p27;自殺蛋白，如胸苷激酶或硝基還原酶；細胞因子或其它免疫調 節蛋白，如白介素l、白介素2或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF); 或者是毒素，如銅綠假單胞菌外毒素A。在其它實施方案中，遞送上述種 類化合物之一的生物學活性片段。
在另一實施方案中，所述貨物化合物是核酸。在某些實施方案中所述 核酸編碼上述種類化合物之一。在又一個實施方案中，所述貨物化合物是 用于治療癌癥的藥物。所述藥物包括，例如5-氟尿嘧啶；干擾素(X;甲氨蝶 呤；他莫昔芬；以及長春新堿。上述例子僅用于說明目的，許多其它此類 化合物為本領域技術人員所熟知。在其他實施方案中，所述核酸用于基因 治療。
適用于治療癌癥的貨物化合物包括但不限于垸化劑，如氮芥、烷基磺 酸鹽、亞硝脲、氮丙啶及三氮烯(triazene);抗代謝物，例如葉酸拮抗劑、嘌 呤類似物及嘧啶類似物；抗生素，例如蒽環類、博來霉素、絲裂霉素、放 線菌素D及普卡霉素(plicamycin);酶，例如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白轉 移酶抑制劑；5a-還原酶抑制劑；3型17|3-羥基類固醇脫氫酶抑制劑；激素 類藥物，例如糖皮質激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、黃體酮及 促黃體生成素釋放激素拮抗劑、醋酸奧曲肽(octreotide acetate);微管破壞劑， 例如ecteinascidins或者其類似物與衍生物；微管穩定劑，例如紫杉烷類 (taxane)，例如紫杉醇(Taxol TM )、多西紫杉醇(Taxotere TM )及其類似物， 以及埃坡霉素(epothilone)例如埃坡霉素A-F及其類似物；植物衍生制品， 例如長春花生物堿、表鬼臼毒素、紫杉烷類；及拓撲異構酶抑制劑；異戊 二烯基轉移酶抑制劑；及混合制劑，例如羥基脲、普魯芐肼、米托坦(mitotan)、 六甲蜜胺(hexamethylmdamine)、鉑配位復合物，例如順鉑和卡鉑；以及其它用于抗癌和細胞毒性藥物的制劑，例如生物反應修飾劑、生長因子；免 疫調節劑和單克隆抗體。
這些種類抗癌和細胞毒性藥物的代表性例子包括但不限于鹽酸氮芥、 環磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、異環磷酰胺(ifosfamide)、白消安、卡莫 司汀、洛莫司汀、司莫司汀、鏈脲霉素、塞替派、達卡巴嗪、甲氨蝶呤、 硫鳥嘌呤、巰嘌呤、氟達拉濱、pentastatin、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿嘧 啶、鹽酸阿霉素、柔紅霉素、伊達比星、硫酸博來霉素、絲裂霉素C、放 線菌素 D 、 番紅(safracins)、 沙力口霉素(saframycins) 、 quinocarcins 、 discodermolides、長春新堿、長春花堿、酒石酸脫水長春花堿、鬼臼亞乙苷、 磷酸鬼臼亞乙苷、替尼泊苷、紫杉醇、他莫昔芬、雌莫司汀、雌二醇氮芥 磷酸鈉、氟他胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、蝶啶、diyneses、左旋咪唑、aflacon、 干擾素、白介素、阿地白介素、非格司亭、沙格司亭、利妥昔單抗(rituximab)、 BCG、維甲酸、鹽酸依立替康、betamethosone、鹽酸吉西他濱、六甲蜜胺 以及托泊替康(topoteca)及其任意類似物或衍生物。
以上這些種類的優選成員包括但不限于紫杉醇、順鉑、卡鉑、多柔比 星、洋紅霉素、柔紅霉素、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基葉酸、絲裂霉素C、 ecteinascidin 743或pofiromycin、 5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、吉西他濱、阿 糖胞苷、鬼臼脂素或者鬼臼脂素衍生物例如鬼臼亞乙苷、磷酸鬼臼亞乙苷 或替尼泊苷、美法侖、長春花堿、長春新堿、白諾西丁、長春地辛及長春 素。
用作貨物化合物的抗癌和其它細胞毒性藥物的例子包括如下德國專 利4138042.8; WO 97/19086、 WO 98/22461、 WO 98/25929、 W098/38192、 WO 99/01124、 WO 99/02224、 WO 99/02514、 WO 99/03848、 WO 99/07692、 WO 99/27890、 WO 99/28324、 WO 99/43653、 WO99/54330、 WO 99/54318、 WO 99/54319、 WO 99/65913、 WO 99/67252、 WO 99/67253和WO 00/00485 發現的埃坡霉素衍生物；WO 99/24416發現的細胞周期蛋白依賴性激酶抑 制物(也見美國專利6,040,321);及WO 97/30992和WO 98/54966發現的異 戊二烯基蛋白轉移酶抑制劑；以及美國專利6，011，029 —般和具體描述的藥 物(此美國專利的所述化合物可與任意NHR調節劑(包括但不限于本發明中 所述)例如AR調節劑、ER調節劑以及LHRH調節劑或者手術去勢聯用， 特別是在治療癌癥中)。
49當上述其它治療藥物與本發明的化合物用作貨物化合物時，可按照例
如Physician's Desk Reference(PDR)指出的量或本領域技術人員決定的量使 用。
含有銅氧還蛋白入胞結構域的藥物組合物
含有與貨物化合物相連的銅氧還蛋白入胞結構域的復合物的藥物組合 物可通過任何常規方法制備，例如常規混合、溶解、粒化、包被糖衣、乳 化、包囊化、封入(entrapping)或凍干方法。所述復合物可以容易地組合本 領域中熟知的藥學上可接受的載體。這種載體使制劑能夠以片劑、丸劑、 糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸液等形式配制。適當的賦形 劑還包括例如充填劑和纖維素制劑。其它賦形劑包括例如調味劑、著色劑、 防粘劑、增稠劑以及其它可接受的添加劑、佐劑或粘合劑。
這種組合物可用于例如細胞類型的檢測或成像或用于與細胞死亡有關 的病癥的治療或預防。所述組合物以足以預防或治療與細胞死亡抗性有關 的病癥的量施用。此處使用的術語"與細胞死亡抗性有關的病癥"指疾病、狀 態或不適，其特征由適當的、熟練的醫師或臨床醫師判定的、與同種健康 細胞相比至少表現出了細胞壽命延長的趨勢。宿主生物體典型的是哺乳動 物，如人或動物。
含有銅氧還蛋白入胞結構域組合物的施用
含有銅氧還蛋白入胞結構域的組合物可通過任意適當的途徑例如口 服、口腔、吸入、舌下、直腸、陰道、經尿道、鼻腔、局部、經皮(即透皮) 或胃腸外(包括靜脈內、肌內、皮下及冠狀動脈內施用)施用。組合物及其藥 物制劑可以有效達到其目的的任意量施用。當施用用于治療與細胞死亡抗 性有關的病癥時，所述組合物應以治療有效量施用。"治療有效量"是指能夠 有效預防被治療患者的現有癥狀的發展或緩解現有癥狀的量。治療有效量 的確定在本領域技術人員的能力范圍內。
適宜的劑量當然根據例如所用的含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合 物、宿主、施用方式以及被治療或診斷的病癥的性質和嚴重性而有所不同。 但在本發明方法的一個實施方案中，在每日劑量為約0.001到約20mg/kg 體重的含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物時獲得了令人滿意的人體療效。在一個實施方案中，用于治療人體的指明的每曰劑量的范圍為從約
0.7mg至lJ約1400mg的含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物，其可方便地施 用，例如以每日劑量、每周劑量、每月劑量和/或連續給藥。每日劑量每天 可以是1到12次的不連續劑量。或者，所述劑量可以每兩天、每三天、每 四天、每五天、每六天、每周及類似遞增至每31天施用。可使用任意適當 的給藥形式包括片劑、敷貼、iv施用等等進行連續、間歇或單次給藥。更 具體地，組合物以治療有效量施用。在具體實施方案中，治療有效量為約 0.01-20mg/kg體重。在具體實施方案中，劑量水平為約10mg/kg/日、約 15mg/kg/日、約20mg/kg/日、約25mg/kg/日、約30mg/kg/日、約35mg/kg/ 日、約40mg/kg/日、約45mg/kg/日或者約50mg/kg/日。
在某些實施方案中，將含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物導入患者 的方法與其它治療癌癥的已知藥物共同施用。這種方法為本領域所熟知。
在具體實施方案中，含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物為混合劑的一部 分，或與含有或具有其它治療癌癥的藥物共同給藥。這種藥物包括例如本 文所列出的藥物，具體為5-氟尿嘧啶、干擾素cu甲氨蝶呤、他莫昔芬及長 春新堿。上述例子僅用于說明，還有許多其它此類化合物為本領域技術人 員所知。
編碼銅氧還蛋白入胞結構域或組合入胞結構域與貨物化合物的融合蛋 白的核酸分子可插入載體，用作基因治療載體。基因治療載體可通過例如 靜脈內注射、局部施用(Nabel等，U.S.PatentNo.5，328， 470 1994.USA)或立 j本注射(stereotactic injection)(Chen等，Proc Natl Acad Sci USA vol.91 ， pp 3054-57 (1994))輸送給患者。基因治療載體的藥物制品可包括可接受的稀 釋劑或可包含基因遞送載體嵌入其中的緩釋基質。或者，當完整的基因遞 送載體例如逆轉錄病毒載體可由重組細胞完整產生時，藥物制品可包括一 或多種產生基因遞送系統的細胞。
在一個方面，組合物以DNA被輸送，因此復合物是在原位產生的。在 一個實施方案中，DNA是"裸露的"，如Ulmer等，Science259: 1745-49(1993) 和Cohen， Science 259 1691-92(1993)中所述。將DNA包被在載體上(例如 可被有效轉運入細胞的生物降解珠)可提高裸露DNA的攝取。在此類方法 中，DNA可存在于本領域技術人員熟知的多種輸送系統中的任意一種，所 述系統包括核酸表達系統、細菌與病毒表達系統。將DNA整合入這些表達系統的技術為本領域技術人員所熟知。見例如WO 90/11092、 WO 93/24640、 WO 93/17706及美國專利5，736，524。
用于在從生物體到生物體穿梭遺傳物質的載體可分為兩大類克隆載
體是復制質粒或噬菌體，并具有在適當宿主細胞中繁殖所非必需的且外源
DNA插入其中的區域；外源DNA像載體成分一樣可復制與傳代。表達載 體(如質粒、酵母或動物病毒基因組)用來將外源遺傳物質導入宿主細胞或組 織，從而轉錄和翻譯外源DNA，例如組合物的DNA。在表達載體中，導入 的DNA被可操縱地連接于可向宿主細胞發出信號以轉錄插入DNA的元件 例如啟動子。某些啟動子尤其有用，例如控制應答特殊因素的基因轉錄的 誘導型啟動子。將組合物多核苷酸可操縱地連接于誘導型啟動子可控制wt-天青蛋白入胞結構域組合物多肽或者片段的表達。典型誘導型啟動子的例 子包括對a-干擾素、熱休克、重金屬離子和類固醇例如糖皮質激素 (Kaufman, MethodsEnzymol. 185: 487-511(1990))及四環素應答的啟動子。 其它所需的誘導型啟動子包括對于構建體所導入的細胞是內源性的啟動 子，但在外源提供誘導劑時它們在細胞中是應答的。 一般來說，有用的表 達載體常為質粒。但其它形式的表達載體例如病毒載體(如復制缺陷型逆轉 錄病毒、腺病毒與腺相關病毒)也可考慮。
載體的選擇取決于使用的生物體或細胞，以及載體的所需命運。 一般 來說，載體包含信號序列、復制起點、標記基因、增強子元件、啟動子以 及轉錄終止序列。
包含銅氧還蛋白入胞結構域-貨物化合物復合物的試劑盒 本發明另一方面提供了試劑盒，其在包裝或容器內含有一種或多種下
列材料(l)包含與貨物化合物相連的銅氧還蛋白入胞結構域的復合物的試 齊!J; (2)含有藥學上可接受的佐劑或賦形劑的試劑；(3)施用器材，例如注射 器；(4)施用說明書。在某些實施方案中，在同一容器內也可含有兩份或更 多的成分(1H4)。
包含銅氧還蛋白銅氧還蛋白入胞結構域、銅氧還蛋白入胞結構域-貨物 化合物復合物或其變體、衍生物或結構等價物的藥物組合物
包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的藥物組合物可通過任何常規方法生產，例如通過常規混合、溶解、粒化、包被糖衣、乳化、
包囊化、封入(entrapping)或凍干方法。基本上純的或藥物級的銅氧還蛋白 或其變體、衍生物和結構等價物可方便的與本領域公知的可藥用載體組合。 這種載體使制劑能夠以片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、 膏劑、懸液等形式配制。適當的載體或賦形劑還包括例如充填劑和纖維素 制劑。其它賦形劑包括例如調味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑以及其它可 接受的添加劑、佐劑或粘合劑。在某些實施方案中，所述藥物制劑基本上 不含防腐劑。在其他實施方案中，所述藥物制劑可含有至少一種防腐劑。 藥物劑型的一般方法參見Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins. Baltimore MD (1999》。
用于本發明中含有銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的組合 物可通過多種途徑施用，包括注射(例如皮內、皮下、肌內、腹膜內等)，吸 入，局部施用，栓劑，施用透皮貼劑或經口施用。有關藥物遞送系統的一 般信息可以在Andel等人，出處同上中找到。在某些實施方式中，包含銅 氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的組合物可以被配制并直接作為 可注射劑(injectible)用于皮下注射和靜脈注射。特別地，可注射劑型可以有 利地用于治療存在與不當的血管發生相關的疾病的風險、可能具有或具有 與不當的血管發生相關的疾病的患者。包有銅氧還蛋白或變體、衍生物或 結構等價物的組合物在與保護劑例如聚丙二醇或類似包衣劑混合后也可以 口服。
當經注射施用時，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物可以配 制在水溶液，特別是生理相容緩沖液例如Hanks溶液、林格溶液或生理鹽 水緩沖液中。所述溶液可以含有配制劑例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。 或者，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物可以為粉末形式，在使 用前與適合的載體(vehicle)，例如無菌無熱原水構造。在某些實施方案中， 所述藥物組合物不含有加入的用于增強所述肽促使的免疫應答的佐劑或任 何其它物質。在某些實施方案中，所述藥物組合物包含抑制對所述肽的免 疫應答的物質。
當通過靜脈流體施用時，用于施用銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結 構等價物的靜脈流體可以由類晶體或膠體組成。這里使用的類晶體是礦物 鹽或其它水溶分子的水溶液。這里使用的膠體含有大的不溶分子例如明膠。靜脈流體可以是無菌的。
可以用于靜脈施用的類晶體流體包括但不限于生理鹽水(濃度為0.9% 的氯化鈉溶液)，林格乳酸鹽或林格溶液，以及通常稱作D5W的5%右旋糖 的水溶液，如表2所述。
表2.常用類晶體溶液的組成
沐液Jt他名稱cr〗I泡萄糖 J
D5W5%00252
2/3 & 1/33.3% 0.3"M)然水5151168
'卜塵W!然水0.45% NaCl77770
0.9% NaCl1541540
林格3i酸汰 *林格溶液1301090
承林格乳酸鹽也具有28mmol/L乳酸鹽，4mmol/L K+，和3mmol/LCa2+。 當通過吸入施用時，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物可以 利用適合的推進劑例如二氯二氟甲垸、三氯氟甲垸、二氧化碳或其它適合 的氣體以氣霧劑噴霧形式從加壓包裝或噴霧器中遞送。在加壓氣霧劑的情 況下，可以通過提供閥釋放計量量來確定劑量單位。用于吸入器或吹入器 的例如凝膠的容器和藥筒可以配制成含有所述蛋白質和適合的粉末基質例 如乳糖或淀粉的粉末混合物。
當通過局部施用時，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物可以 配制成溶液、凝膠、軟膏、乳膏、凝膠劑、懸浮液等，如本領域公知。在 某些實施方式中，通過透皮膚貼劑施用。當通過栓劑施用時(例如直腸或陰 道)，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物也可以配制成含有常規栓 劑基質的組合物。
當通過口服施用時，通過將銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價 物與本領域已知的藥物可接受的載體結合可以很容易地配制銅氧還蛋白或 其變體、衍生物或結構等價物。可以利用固體載體例如甘露醇、乳糖、硬 脂酸鎂等；所述載體能使銅氧還蛋白及其變體、衍生物或結構等價物配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，用于 給待治療的受試者口服攝入。對于口服固體劑型例如粉末、膠囊和片劑， 適合的賦形劑包括填充劑例如糖、纖維素制劑、成粒劑以及粘合劑。
其他適合的載體如本領域己知的，也包括多價載體例如細菌莢膜多糖、 右旋糖苷或遺傳工程載體。此外，包括銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結 構等價物的緩釋劑型允許在延長的時期內釋放銅氧還蛋白或其變體、衍生 物或結構等價物，而不具有緩釋的劑型，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或
等價物會在引起或增強治療效果之前被從受試者系統清除、和/或例如被蛋 白酶和簡單的水解降解。
本發明的肽在血流中的半衰期可以通過本領域已知的幾種方法延長或 優化。本發明的肽變體可以包括但不限于多種變體，其可以增加其在血流 中的穩定性、特定活性、壽命，和/或降低銅氧還蛋白的免疫原性，并保留 所述肽在哺乳動物細胞、組織和動物中抑制癌前病變發展的能力。所述變 體包括但不限于那些減少肽的水解、減少肽的脫酰胺作用、減少氧化、降 低免疫原性、增加肽的結構穩定性或增加肽的尺寸的變體。所述肽也包括
環化的肽(參見Monk等人，BioDrugs 19(4): 261-78， (2005); DeFreest等人， J.Pept,Res.63(5): 409-19(2004))， D， L-肽(非對映異構體)，Futaki等人， J.Biol.Chem.Feb23; 276(8): 5836-40(2001); Papo等人，Cancer Res.64( 16): 5779-86(2004); Miller等人，Biothem.Pharmacol.36(l): 169-76， (1987)); 含有非天然氨基酸的肽(參見Lee等人，J.Pept.Res.63(2): 69-84(2004))， N-末端和C-末端修飾(參見Labrie等人，Clin.Invest. Med.l3(5): 275-8， (1990))， 烴類環鉤(參見Schafineister等人，J.Am.Chem.Soc.l22: 5891-5892(2000》； Walenski等人，Science 305: 1466-1470(2004)以及PEG化作用。
在各種實施方式中，所述藥物組合物包含載體和賦形劑(包括但不限于 緩沖液、碳水化合物、甘露醇、蛋白質、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧 化劑、抑菌劑、螯合劑、懸浮劑、增稠劑和域防腐劑)，水，油，鹽水溶液、 右旋糖和甘油水溶液，模擬生理條件需要的其它藥物可接受輔助物質，例 如緩沖劑、張力調節劑、潤濕劑等。應當意識到可以采用本領域普通技術 人員已知的任何適合的載體施用本發明的組合物，根據施用方式改變載體 的類型。也可以使用公知的技術將化合物包在脂質體中。生物可降解的微 球也可以作為載體用于本發明的藥物組合物。適合的生物可降解微球例如在美國專利No.4，897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5，853,763和5,942,252中公開。
所述藥物組合物可以通過常規、公知的滅菌技術進行滅菌，或可以無 菌過濾。得到的水溶液可以包裝原樣使用，或凍干，在施用前凍干制劑與 無菌溶液組合。
銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的施用
銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物可以配制作為藥物組合物 并通過任何適合的途徑施用，例如通過口服、口腔、吸入、舌下、直腸、 陰道、尿道、鼻、局部、經皮膚也就是經皮或腸胃外(包括靜脈內、肌內、 皮下和冠狀動脈內)或玻璃體施用。其藥物組合物以任意有效量施用以達到 其想要的目的。更具體地，所述組合物以治療有效量施用。在特定的實施 方式中，治療有效量一般在大約0.01-20mg/天/kg/體重。
包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的化合物單獨或與其 它活性劑劑組合可用于預防癌癥。適合的劑量當然會根據例如其中使用的 銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的化合物，宿主，給藥模式和 自然界以及被治療的疾病的本質和嚴重性而變化。但是，在人類中獲得滿 意效果的每日劑量通常為0.01-20mg/kg體重。方便服用的銅氧還蛋白或其 中的變體、衍生物或結構等價物的化合物的人類每日指示劑量范圍大約為 0.7mg到1400mg，例如每日劑量，周劑量，月劑量，和/或連續劑量。每日 劑量可以不連續，從每天1次到每天12次。亦或劑量可以為每兩天，每三 天，每四天，每五天，每六天，每周，并且以類似天數增加直至31天或更 長進行施用。或者，定量給藥可以是連續施用貼劑、靜脈內給藥等。
主治醫師考慮病人的情況以決定準確的配方、給藥途徑和劑量。可個 別調整用藥劑量和間隔，提供活性銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等 價物的血漿水平以充分保持的治療效果。通常期望的銅氧還蛋白或其變體、 衍生物或結構等價物，與按照預期的施用途徑和標準治療實踐所選擇的藥 用載體混合施用。
一方面，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物作為DNA遞送， 以致在原處產生多肽。在一個實施方式中，DNA是"裸露的"，例如，正如 在Ulmer等人(Science 259: 1745-1749(1993)和Cohen綜述(Science 259:
561691-1692(1993)中所述的。裸DNA的攝取可以通過將所述DNA涂布于載 體(如可生物降解珠)來增加，然后有效地運輸至細胞內。用這種方法，DNA 可以存在于本領域普通技術人員已知的任意多種遞送系統內，包括核酸表 達系統，細菌和病毒表達系統。將DNA整合到這樣的表達系統中所用的技 術對于本領域普通技術人員是公知的。參見例如WO90/11092, WO93/24640, WO93/17706,以及美國專利5736524。
用于在生物體間穿梭傳送基因物質的載體可以分為大體兩種類型克
隆載體是復制型質粒或噬菌體，具有在適合的宿主細胞中增殖必需的區域，
其中可以插入外源DNA;所述外源DNA被復制和增殖，如同它是載體的 成分一樣。表達載體(例如，質粒、酵母或動物病毒基因組)用于將外源遺傳 物質引入宿主細胞或組織以轉錄并翻譯外源DNA，如銅氧還蛋白的DNA。 在表達載體中，導入的DNA被可操作地連接到元件(例如啟動子)，其給宿 主細胞信號以高度地轉錄插入的DNA。某些啟動子是特別有用的，例如可 誘導型啟動子，其響應于特殊因子來調控基因轉錄。將銅氧還蛋白及其多 肽變體和衍生物可操作地連接到誘導型啟動子可以調控相應于特殊因子的 銅氧還蛋白及其變體和衍生物的表達。典型的誘導型啟動子的實例包括對 a-干擾素、熱激、重金屬離子和類固醇例如糖皮質激素(Kaufinan， Methods Enzymol.l85: 487-511(1990))和四環素響應的那些啟動子。其他理想的誘導 型啟動子包括對于導入構建體的細胞不是內源的那些啟動子，然而，當外 源地提供誘導劑時，在那些細胞中是應答性的。 一般地，有用的表達載體 通常是質粒。然而，其他形式的表達載體，例如病毒載體(例如，復制缺陷 型逆轉錄病毒、腺病毒和腺病毒相關病毒)是預期的。此外，本發明的肽(在 一個實施方案中包括p18)可用作載體，以選擇性地將治療化合物遞送至癌 細胞或腫瘤內。
載體的選擇取決于所用的生物體或細胞和載體預期的命運。通常，載 體包括信號序列，復制起點，標記基因，多接頭位點，增強子元件，啟動 子和轉錄終止序列。
含有銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的試劑盒 一方面，本發明提供了包含下面一種或多種處于包裝容器中的試劑盒: (1 )包含至少一種銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物的藥物活性組合物；(2)另一種化學預防藥物；(3)給患者施用所述生物活性組合物的器材， 例如注射器、噴霧器等。
當提供試劑盒時，所述組合物的不同組分可以視情況包裝在分開的容 器中，在使用前立刻混合。這樣分開包裝組分可以允許長期儲存，而沒有 失去活性組分的功能。
試劑盒中所含的試劑可在任意種類的容器中提供，不同組分的使用期 得到保持并不被容器的材料所吸收或改變。例如，密封的玻璃安瓿可以含 有凍干的銅氧還蛋白及其變體、衍生物或結構等價物，或在中性、不反應 氣體例如氮氣下包裝的緩沖液。安瓿可以由適合的材料構成，例如玻璃、 有機聚合物例如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷、金屬或典型用于保存相似 試劑的任何其它材料。其他適合的容器的實施例包括簡易瓶，其由與安瓿 相似的物質制成，和包殼(eiwelope)，其可以包括箔做內襯的內部例如鋁或 合金。其它容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶、注射器等。容器可以具有無 菌存取口，例如有塞子的瓶子，該塞子可以用皮下注射針剌穿。其它容器 可具有兩室，兩室被容易除去的膜隔開，去除膜后允許組分混合。可除去 的膜可以是玻璃、塑料、橡膠等。
試劑盒也可提供說明材料。說明書可以印在紙或其他載體上，和/或以 電子可讀介質提供，例如軟盤、CD-ROM、 DVD-ROM、壓縮盤、錄像帶、 錄音帶、閃存裝置等。詳細的說明書可以不與試劑盒物理聯系在一起；而 是使用者可以被指引去試劑盒的制造商或分銷商指定的互聯網站或由電子 郵件提供。
銅氧還蛋白、銅氧還蛋白入胞結構域及其變體、衍生物和結構等價物 的修飾
銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結構等價物可以被化學修飾或遺傳改 變以產生變體和衍生物，如上所述。所述變體和衍生物可以利用標準技術 合成。銅氧還蛋白入胞結構域可類似的修飾。
除了天然存在的銅氧還蛋白的等位基因變體，也可通過突變在銅氧還 蛋白編碼序列中引入變化，突變引起被編碼的銅氧還蛋白的氨基酸序列變 化，而這不會顯著改變銅氧還蛋白抑制癌前病變發展的能力。"非必需"氨基 酸殘基是可在野生型銅氧還蛋白序列中被改變，而不改變藥理學活性的殘基，而"必需"氨基酸殘基是這種藥理學活性所需要的。例如銅氧還蛋白中保 守的氨基酸殘基預計是尤其不能改變的，因此是"必需"的。
可進行不改變所述多肽藥理學活性的保守替換的氨基酸是本領域所公
知的。可用的保守替換如表3中"優選替換"所示。只要所述替換實質上沒有 改變化合物的藥理學活性， 一種類型的氨基酸被相同類型的另一種氨基酸 代替的保守替換落在本發明的范圍內。
表3.優選的替換
原始殘艱
^范性扦換
優選的替換
Ala (A) Arg(R) Asn(N) Asp(D) Cys(C) Gin (Q) Glu (E) Gly(G) His (H)
lie (I)
Leu (L)
Lys(K) Met (M) Phe (F) Pro (Pi Ser(S) Thr(T) Trp (W)
Val， Leu, He Lys, Gin, Asn GIn， His， Lys， Arg Glu Ser Asn Asp Pro,Ala Asn， Gln， Lys， Arg Leu， Val, Met, Ma， Phe, Norleucine Norle'ucine, lie, Val, Met, Aa, Phe Arg， Gln， Asn Leu， Phe, De Leu, Val， lie, Ala， Tyr Ala Thr Ser Tyr, Phe
Val Lys Gin Glu Ser Asn Asp Ala Arg
Leu
He
Arg Leu Leu Ala Thr Ser Tyr
Tyr(Y) Val (V)
Trp， Phe, Thr, Ser lie, Leu， Met, P", Ala, Norleucine
Phe Leu
影響(l)多肽主鏈的結構例如P-片層或a-螺旋構象，(2)電荷，(3)疏水性， 或(4)靶位點的側鏈體積(bulk)可以改變藥理學活性。如表4所示，基于共同 的側鏈性質，對殘基分組。非保守替換要求這些類型中的一個的成員變換 成另一種類型。替換可引入至保守替換位點，或更優選非保守位點。
表4.氨基酸類型
59類刑級.戰酸
疏水Norieucine, Met， Ala, Val，
Leu， He
中性親水Cys， Ser, Thr
酸性Asp, Glu
堿性Asn， Gln， His, Lys， Arg
分開的鏈構象Gly, Pro
芳存性Trp， Tyr， Phe
所述變體多肽可使用本領域己知的方法制得，例如寡核苷酸介導的(定
點)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變。定位誘變(Carter， Biochem J.237: 1-7 (1986); Zoller和Smith, Methods Enzymol. 154: 329-350(1987)、盒式誘變、 限制選擇誘變(Wells等人，Gene 34: 315-323(1985)或其它己知的技術可在 克隆DNA上操作以產生銅氧還蛋白變體DNA。
也可以利用已知的銅氧還蛋白突變產生變體銅氧還蛋白用于本發明的 方法中。例如，已知天青蛋白的C112D和M44KM64E突變體具有與天然 天青蛋白不同的細胞毒和生長抑制活性，如此改變的活性可用于本發明的 治療方法中。
參考下面的具體實施例可以更全面地理解本發明。所述實施例只是為 了說明目的，沒有意欲限制本發明的范圍。當條件可暗示或提出賦形劑時， 預期等價物形式和替換上的改變。雖然這里使用了特定的術語，這些術語 的意圖都是為了描述，并不是為了限制的目的。可以對上文所述發明進行 修改和改變，而沒有偏離本發明的精神和范圍。
實施例
實施例1.肽P-28對MMOC模型中DMBA誘導的哺乳動物損傷的效果
小鼠乳腺器官培養物(MMOC)模型允許評價潛在化學預防劑對 DMBA導致的乳腺肺泡病變(MAL)或乳腺導管病變(MDL)的效果。在適當 的孵育條件下，DMBA在培養基中形成基于激素環境的MAL或MDL。
60Hawthorne等，Pharmaceutical Biology 40: 70-74 (2002); Mehta等.，J. Natl. Cancer Inst. 93: 1103-1 106 (2001)。雌激素和孕酮處理的腺體在培養物中發 展導管病變，而醛固酮和氫化可的松處理的腺體形成非雌激素和孕酮依賴 性的肺泡病變。不暴露于致癌物或化學預防劑的乳腺在缺乏生長促進激素 的情況下經歷結構性退化，而用DMBA在第3和第4天之間處理24小時 防止了由缺乏激素引起的結構退化。其原因被認為在于腺體失去了正常的 激素應答，改變了其發育的過程。將轉化細胞移入同種小鼠中產生乳腺癌 也證實了這些未退化區域的癌前腫瘤發生前性質。
從每只Balb/c小鼠中無菌切除乳腺胸廓對，分成幾組。在4個不同的 稀釋下于培養基內評價p28的效果。使用無試驗試劑的致癌物處理的腺體 作為在缺乏化學預防劑情況下測量發病率百分比的手段。還包括額外的對 照，作為化學預防的陽性對照。培養基中包括50ng/ml的天青蛋白。對于 肺泡病變(MAL)著色的腺體評價病變的發病率(與給定治療組的腺體總數 相比的含有任何病變的腺體)。對于導管病變(MDL)適用類似的方案。然而， 如以下方法部分所指出的，所述激素組合不同于肺泡和導管病變。在福爾 馬林中固定腺體，隨后加工用于組織病理學檢驗。切片用曙紅和 hematoxelene染色，在顯微鏡下評價。這里比較了對照和治療組之間導管病 變的多樣性。
器官培養操作.用于研究的實驗動物是年輕未交配BALB/c雌性小鼠， 3-4周齡，來自Charles River, Wilmington, MA。所述小鼠每天皮下注射l嗎 雌二醇_17p+1 mg孕酮，共9天。該處理是必要條件，因為不用甾類預處 理的動物不能對體外激素產生應答。整個培養過程詳細描述于Jang等， Science 275:218-220 (1997); Mehta， Eu. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Mehta 等，J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219 (1997); Mehta等，J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001)。
簡言之，頸脫位法處死動物，在絲布上切下乳腺胸廓對，在無血清 Waymouth MB752/ 1培養基(5-腺體/5 ml/盤)中孵育10天。該培養基補充有 谷胺酰胺、抗生素(盤尼西林和鏈霉素，100單位/ml培養基)和生長促進 激素、5嗎胰島素(I)、 5嗎催乳素(P)、 1嗎醛固酮(A)和1 )ig氫化可的松 (H)每毫升培養基以用于誘導乳房肺泡病變(MAL)。為誘導導管病變 (MDL)，培養基包含5 jig/ml、 5 pg/mlP、 0.001 ng/ml雌二醇-17卩和1嗎/ml孕酮(Pg)。 Mehta等，J. Natl. Cancer Inst. 93:1 103-1 106 (2001)。在第3天和 第4天之間向培養基中加入致癌物DMBA(2 pg/ml)。對于本研究，將DMBA 以終濃度4 mg/ml溶于DMSO中，向100 ml培養基中加入50嗎I，使得終 濃度為2pg/ml。對照盤含有DMSO作為載體(vehicle)。
在第4天，通過在新鮮培養基中漂洗腺體，并將其轉移至含有無DMBA 的新鮮培養基的新盤中，從培養基中除去DMBA。孵育10天后，腺體在僅 含l(5嗎/ml)培養基中保留另14天。在整個培養期間，腺體維持在37。C、 95%02和5%0)2環境下。在生長促進時期的第一個10天內，所述培養基 包含化學預防劑。在從I2.5pg/ml至l」100pg/ml的4個濃度下評價試驗肽 p28。在培養基中以50pg/ml評價天青蛋白。所述肽在使用前溶于無菌水中 并過濾。培養基每周更換3次(周一、周三和周五)。在暴露末期，在福爾 馬林中固定腺體。
結果通過卡方分析和Fisher確切檢驗分析。
MAL的形態學分析.對于MAL檢查，將腺體在明礬洋紅中染色，評 價病變的存在。腺體根據存在或不存在乳房病變、每個腺體的病變嚴重性 和試劑的毒性進行評分。在解剖顯微鏡下評價儲存在二甲苯中的每個腺體 乳房病變的存在或不存在、發病率以及嚴重性。乳腺根據乳房病變評分為 陽性或陰性，發病率百分比確定為具有病變的腺體和該組中腺體總數的比 例。由于化學預防劑處理導致的管膨脹或乳房結構分解被認為是毒性效應。 對數據進行統計學分析以確定潛在化學預防劑的效果。
圖1A顯示了 DMBA處理的腺體中肺泡病變的代表性圖譜，其與用 DMBA與化學預防劑一起處理的腺體進行比較。圖1B-1F顯示了 p28對于 肺泡病變發展的影響，總結于圖2。肽28在25嗎/ml的濃度下抑制了 67% 的MAL形成。增加濃度至lOOpg/ml沒有提高所述肽的效果。該肽與天青 蛋白的比較表明在MAL發育中，p28與天青蛋白一樣有效。天青蛋白在 50ng/ml的濃度下導致了 67%的抑制。統計學分析表明p28的效果在超過 12.5pg/ml濃度下與DMBA對照比較時是統計顯著性的(pO.Ol， Fisher Exact Test,卡方分析)。
MDL的組織病理學評價.對于MDL，加工腺體以進行組織病理學評 價。腺體縱向切割成5微米的切片，用曙紅蘇木精染色。每個腺體的縱向 切片被分成幾個區域，評價每個區域的導管病變。Mehta等，Natl. Cancer Inst.93: 1 103-1106 (2001)。簡而言之，整個腺體在范圍內進行評價；較小的腺 體與較大的腺體相比總區域數更少。這樣，每個腺體具有不同數目的區域。 通常通過導管的切片數目每個腺體之間也有很大不同。這導致了組間數目 的不同。測定具有導管增生或異型的區域并與區域的總數比較，對每個腺 體進行評價。增生或異型和嚴重閉塞的腺體之間不作區分。任何含有這些 組織學特征的區域被認為是病變陽性的。比較治療組與對照的嚴重性，計 算抑制百分比。
圖3顯示了代表性的導管病變。DMBA誘導的導管病變分為增生、異 型和完全的導管阻塞。確定了導管病變/導管切片總數的比例。再一次， 12.5(ig/ml濃度的p28抑制了僅15%的MDL形成。然而，在25pg/ml時， 獲得了與50嗎/ml天青蛋白相比顯著的病變抑制。P28在濃度超過12.5pg/ml 時的效果是統計學顯著性的(pO.Ol， Fishers Exact Test)。這些結果總結于圖 4。通常可區分化學預防劑在MAL和MDL之間的效果。例如他莫西芬抑 制MDL而非MAL的發展。有趣的是，天青蛋白和p28不但抑制雌激素和 孕酮依賴的導管病變，還抑制非依賴的肺泡病變。
本實施例表明，p28和天青蛋白均可預防乳房組織中癌前病變的發展。 因此，p28和天青蛋白可用作哺乳動物患者的化學預防劑。
實施例2.通過銅氧還蛋白和衍生肽類作為潛在的載體選擇性穿透癌細胞進 行基因遞送
我們已經證實天青蛋白，分離自銅綠假單胞菌的銅氧還蛋白家族成員 在體內和體外進入癌細胞并誘導p53介導的細胞凋亡。評價了陽離子和陰 離子銅氧還蛋白及其衍生肽類作為潛在的基因遞送載體的穿透選擇性。試 驗了以下銅氧還蛋白天青蛋白(14kDa， pI5.7)、鐵硫菌藍蛋白(17kDa，p18.0) 和質體藍素(llkDa,p15.4)，其結果表明天青蛋白具有最好的選擇穿透性。
合成了 25個氨基酸的天青蛋白(azu)片段，評價其對多種癌細胞和組織 配對的正常細胞的穿透性。共焦顯微鏡和流式細胞儀(FACS)分析表明用 Alexafluor 568(800Da)標記的18個氨基酸(1.7kDa, azu 50-67)片段(pl8)選擇 性穿透人黑色素瘤(Md-2,7，29)、乳腺癌(MCF-7)、卵巢癌(SK-OV3)、胰腺 癌(CAPAN-2)、膠質母細胞瘤(LN-229)、星形細胞瘤(CCF-STTG1)、前列腺 癌(LN-CAP)和腎癌(ACFfN-CRLl 611)細胞系，但不穿透其各自的對照。LDH
63釋放和溶血測試顯示p18在穿透過程中不破壞癌細胞膜結構或產生人紅細 胞溶血，表明p18在不破壞膜結構的情況下穿透人癌細胞。用細胞內化的
特異性抑制劑(細胞松弛素d;抑制肌動蛋白聚合，紫杉醇；抑制微管蛋白 解聚，氯丙嗪；抑制網格蛋白介導的胞吞作用，疊氮化鈉；代謝抑制劑或 十字孢堿；細胞周期抑制)預處理Md-2細胞對p18的穿透性的效果可忽略 不計。然而，將Md-2細胞與制霉素(細胞膜穴樣凹陷形成抑制劑)和布雷菲 德菌素A (高爾基體破壞劑)孵育顯著地抑制了 p18的穿透，表明該胞吞過 程可能部分與p18穿透有關。在具有異種移植黑色素瘤的無胸腺小鼠體內 對紅外染料(X^ 800nm)標記的p18成像，清楚的顯示在原發性皮下腫瘤和 遠端器官轉移中的選擇性吸收，而不在正常器官和組織中積聚。這樣，本 發明的肽(在一個實施例中包括p18)作為基因治療的非病毒載體具有重要 的作用。
實施例3-質粒構建體
使用校正DNA聚合酶，通過聚合酶鏈反應構建表達谷胱甘肽S-轉移酶 (GST)-截短型wt-天青蛋白(azu)衍生物融合蛋白的質粒。圖5顯示不同截短 型wt-天青蛋白構建體的示意圖。對于pGST-azu 36-128，將擴增的PCR片 段導入商品化GST表達載體pGEXSX (AmershamBiosciences ， Piscataway ， NJ 08855)的BamHl和EcoRl位點。片段擴增以pUC19-azu作為模板， 5'-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGAAGA ACG TCA TGG GC-3' (SEQ ID NO:35)及5'-CGGAATTC GCATCA CTT CAG G GT CAG GG國3' (SEQ ID NO:36)作為引物，其中另外引入的BamHl和EcoRI位點分別用下劃線標出。 通過QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene， LaJolla， CA92037)引入終 止密碼子可逐步進行azu基因的羧基末端截短。
對于pGST-azu 36-50 (SEQ ID NO:37)、 pGST-azu 36-77 (SEQ ID NO:38) 和pGST-azu 36-89 (SEQ ID NO:39)，分別在Ser51、 Ser78和Gly90引入終 止密碼子。以攜帶pGST-azu 36-128的質粒作為模板DNA。用于定點誘變 的三組寡核苷酸顯示如下。pGST-azu 36-50 : 5'畫GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCCGCC GAC ATG CAG-3' (SEQ ID NO:40)和5'-CTG CAT GTC GGCGGC GGT TCA CAG TAC CCA GTTGTGGCC畫3' (SEQ ID NO:41)。 pGST-azu 36-77: 5'-CCTGAAGCCCGA CGA CTG ACG TGT CATCGC CCA CAC C-3' (SEQ ID NO:42)和 5'-GGT GTG GGC GAT GACACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G-3' SEQ ID NO:43)。 pGST-azu36-89: 5'-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGA AGG ACT CGGTGA CC-3' (SEQ ID NO:44)和5'-GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCACGA GCC GAT CAG CTT GG-3 (SEQ ID NO:45)。 以 pGST-azu 36-77作為模板DNA，通過PCR制備質粒pGST-azu 50-77和 pGST-azu67-77。
使用正向引物5'-CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACATGC AGG G-3' (SEQ ID NO:46)和5'-CGGGATCC CCG GCC TGGACA AGG ATT ACC TGA AGC CCG-3 (SEQ ID NO:47)獲取PCR擴增片段azu 50-77 和azu 67-77，其中另外引入的BamHI位點用下劃線標出。這兩種情況中使 用的反向引物均為5'-CGGAATTC GCA TCACTT CAG GGT CAG GG-3' (SEQIDNO:48)。
使用下列寡核苷酸將攜帶gst-azu 50-77的質粒用于Gly67引入終止密 碼子來產生 pGST-azu 50-66 : 5'-GAC GGC ATG GCT TCC TGA CTGGAC AAGGATTACC-3' (SEQ ID NO:49)禾卩5'-GGTAATCCT TGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC-3' (SEQ ID NO:50)。編碼綠色 熒光蛋白的綠色熒光蛋白基因(g制同樣通過PCR擴增。所使用的正向和反 向弓I物是5'-CGGGATCC CCA TGG TGA GCA AGGGCG-3' (SEQ ID NO:51) 和 5'-CGGAATTCCTTGTACAGCTC GTC CAT GCC G-3' (SEQ ID NO:52)，在每個寡核苷酸的5'端均含有BamHI和EcoRI位點。將得到的PCR 片段與pGEXSX載體連接，產生pGST-GFP。以pGST-azu 50-77作為模板， 5'-CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CAT GCAGGG-3' (SEQ ID NO:53)禾口 5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGC TCAGTC GTC GGG CTT CAG GTA ATC C-3' (SEQ ID NO:54)作為引物，通過PCR擴增azu 50-77基因以 制備攜帶gst-g*-azu 50-77的質粒DNA，其中引入的Xho I和Not I位點分 別用下劃線標出。將純化的azu 50-77片段導入pGST-GFP的Xho 1和Not 1 獨特限制性酶切位點。
實施例4-蛋白質純化
如Yamada， T.等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA， vol.101 ， pp.4770-75(2004)
65和共有未決美國專利申請10/720,603所述制備和純化wt-天青蛋白和 M44KM64E天青蛋白突變體，所述文獻內容并入本文參考。簡言之，按照 Kukimotoetal， FEBS Lett, vol.394， pp 87-90(1996)所述方法通過PCR擴 增wt-天青蛋白基因。以銅綠假單胞菌株PA01的基因組DNA作為模板 DNA進行PCR。
545bp的DNA擴增片段經Hindlll和Pstl消化后插入pUC19的相應位 點，使天青蛋白基因位于lac啟動子下游以產生表達質粒pUC19-azuA。 E.col JM109用作天青蛋白基因表達的宿主菌株。重組大腸桿菌菌株在含有 50|ig/ml氨節青霉素、O.lmMIPTG以及0.5mMCuSO 4的2YT培養基中 37'C培養16小時，以產生天青蛋白。
制備M44KM64E天青蛋白突變體時，用QuickChange定點誘變試劑盒 (Stratagene， LaJolla， CA)進行天青蛋白基因的定點誘變。通過DNA測序 驗證突變。
質粒DNA，艮卩pET9a，來自Kazuhiko Sasaki博士 (Central Research Institute ofElectric Power Industry, Chiba， Japan),其攜帶編碼氧化亞鐵硫 桿菌銅氧還蛋白鐵硫菌藍蛋白的rus基因。
采用經修改的Sasaki, K.，等，.Biosci.Biotechnol.Biochem.， vol.67， pp.1039-47 (2003)所述方法從攜帶rus基因的大腸桿菌BL21(DE3)中分離鐵 硫菌藍蛋白。簡言之，使用乙酸緩沖液(pH4.0)和 CM-Sepharose(Sigma Chemicals, St丄ouis， MO 63178)代替(3-丙氨酸緩沖液 (pH4.0)禾卩TSK-gel CM-650柱(Tosoh Bioscience, LLC, Montgomeryville， PA 18936)。其它兩種純化的銅氧還蛋白-層理席藻質體藍素和裂環無色桿菌 假天青蛋白分別來自Beatrix G.Schlarb-Ridley博士(University of Cambridge, UK)禾口 Christopher Dennison博士(University of Newcastle Upon Tyne， UK)。
如下純化所有重組GST-融合衍生物大腸桿菌BL21作為宿主菌株。 以0.4mMIPTG誘導L肉湯中處于對數生長期早期的細菌后，用PBS通過 谷胱甘肽Sepharose4B親和層析法和Sephadex 75凝膠過濾柱 (Amersham Biosciences, Piscataway， NJ 08855)從細胞提取物中純化GST-融合蛋白。按照制造商說明分離以ALEXA FLUOR (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 97402)標記的純化蛋白，wt天青蛋白和GST-衍生物或其 它銅氧還蛋白。通過凝膠過濾柱除去未結合的游離熒光化學物。實施例5-細胞培養
如Yamada， T.等，Infectlmmun.vol.70， pp.7054-62(2002); Goto, M.， 等，Mol咖Microbiol ， vol.47 ， pp.549畫59(2003)禾B Yamada ， T.， 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.99 ， pp. 14098-103(2002)所述培養J774和 UISO-Mel-2細胞(購自Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maiyland， USA)，其內容并入本文參考。人正常成纖維細胞 (Department of Surgical Oncology, University of Illinois(UIC)， Chicago的原 種培養物)在具有含2mM L-谷氨酰胺、O.lmM MEM必需氨基酸并添加10% 熱滅活胎牛血清、100單位/ml青霉素和lOOpg/ml鏈霉素的Eagle's鹽的 MEM中培養。如Punj等，Oncogene 23: 2367-78(2004)所述培養MCF-7和 MOF-10F細胞。
實施例6-J774、 UISO-Mel-2和成纖維細胞的共培養與共聚焦顯微術
J774、 UISO-Mel-2和成纖維細胞在各自蓋玻片上培養。孵育過夜后， 用新鮮培養基洗細胞，將這三株細胞系置于培養皿上，培養皿中含有 20(Vg/ml綴合了 ALEXA FLUOR 568的wt-天青蛋白。然后細胞在5% C02 中37。C孵育0.5或3.5小時。
制備顯微鏡樣品時，細胞在蓋玻片上37-C培養過夜。蛋白處理前，將 細胞置于37'C或4°C2小時。將預熱至37X:或預冷至4'C的新鮮培養基與紅 色熒光(以ALEXA FLUOR 568標記)銅氧還蛋白或GST-融合衍生物混 合，并與細胞孵育。用PBS洗細胞，-20°〇甲醇固定5分鐘。用PBS洗兩次 后加入封片培養基，封片培養基含1.5pg/ml的4'， 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 用于染核(VECTASHILD， Vector, Burlingame， CA)，然后用共聚焦顯微鏡 攝影。
實施例7-銅氧還蛋白進入J774細胞
如實施例6那樣將wt-天青蛋白及其突變體變體M44KM64E、 體藍 素、假天青蛋白和鐵硫菌藍蛋白與J774細胞孵育，用共聚焦顯微鏡觀察細 胞。在這些實驗中，銅氧還蛋白綴合了 ALEXAFLUOR 568而發出紅色 熒光，將200pg/ml銅氧還蛋白與J774細胞在37。C孵育1小時，在另一實驗中，6至7nM野生型天青蛋白和鐵硫菌藍蛋白與J774細胞在37匸孵育1 小時。細胞核被DAPI染成藍色。設一不加蛋白的對照。在所有實驗中都觀 察到了銅氧還蛋白進入J774細胞的胞質溶膠。在類似實驗中，橙綠曲撓素 A和B優先進入MCF7癌細胞，而不是非癌對照細胞。
實施例8-wt天青蛋白和鐵硫菌藍蛋白進入不同類型的細胞
與MCF-7細胞相比，wt-天青蛋白對MCF-10F細胞表現出了較低的細 胞毒性活性。Punj et at Oncogene 23: 2367-2378(2004)。如實施例5所述處 理并觀察J774、腹膜巨噬細胞、肥大細胞、人乳腺癌MCF-7及人正常上皮 細胞MCF-10F(原種培養物來自D印artment of Surgical Oncology ， University of Illinois at Chicago(UIC)， Chicago),并測試wt-天青蛋白是否能 進入上述細胞。
在45mm孵育期間，wt-天青蛋白被J774細胞內在化。但其被腹膜巨噬 細胞或肥大細胞內在化的效率很低。即使孵育6小時后，此類細胞仍僅示 出有限的進入。相似地，wt-天青蛋白能夠有效進入乳腺癌細胞MCF-7，但 其在正常乳腺細胞MCF-10F中示出非常低的入胞比率。
綴合了 Alexa FLUOP^的天青蛋白有效進入UISOMel-2和MCF-7癌細 胞，但在正常乳腺細胞MCF10A1中則不是。而綴合了 Alexa FLUOR 的 鐵硫菌藍蛋白不但進入UISO-Mel-2和MCF-7癌細胞的胞質溶膠也進入正 常MCF 10A1細胞。與鐵硫菌藍蛋白在癌細胞中均勻分布在胞質溶膠內不 同，在MCF10A1細胞中，大多鐵硫菌藍蛋白被隔離在核周圍的核周隙內。
實施例9-wt天青蛋白介導的細胞毒性和生長抑制
為了進一步評價wt-天青蛋白進入不同細胞的特異性，我們測定37'C孵 育30分鐘與3.5小時后，綴合了 Alexa fluor的wt-天青蛋白進入J774、 UISO-Mel-2和正常成纖維細胞的情況。觀察到wt-天青蛋白在30mm內迅 速進入J774和UISO-Mel-2細胞；相同時間內只有極少量的wt-天青蛋白進 入成纖維細胞的胞質溶膠。孵育3.5小時后，在成纖維細胞中只發現了少量 wt-天青蛋白。
如Yamada， T.，等，Infect.Immun.70: 7054-62(2002)， Goto, M.，等， Mol.Microbiol47: 549-59(2003)和2003年11月24日提交的共有未決美國
68專利申請10/720,603所述，進行3-(4， 5-二甲基噻唑-2-基)-2， 5-溴化四 唑)(MTT)法測定wt-天青蛋白的細胞毒性，所述文獻內容并入參考。圖l(b) 顯示在24小時孵育期間，僅在J774細胞和UISO-Mel-2細胞中觀察到了顯 著的wt-天青蛋白介導的細胞毒性。
M44KM64E天青蛋白突變體在J774細胞中表現出非常輕微的凋亡誘導 活性，但在lmg/ml濃度時可顯著抑制(約95%)G1期到S期的細胞周期進展。 如Hiraoka， Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， vol.101:6427-32(2004)和Yamada， T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USAlOl: 4770-75(2004)所述，用流式細胞術分析細 胞周期進展，所述文獻內容并入參考。圖l(a)顯示以500嗎/ml或lmg/ml 的M44KM64E天青蛋白突變體處理成纖維細胞時，細胞周期進展的抑制程 度為約20%。
實施例10-wt天青蛋白微注射成纖維細胞和MCF-10F細胞
如Punj， V，等，Oncogene 23: 2367-78(2004)所述方法，將wt-天青蛋 白微注射入成纖維細胞和MCF-10F細胞。檢査細胞的凋亡誘導情況，凋亡 引起核DNA固縮和碎裂。在用wt-天青蛋白孵育5小時后的微注射的單細 胞中可觀察到顯著的核DNA(以DAPI染成藍色)固縮和碎裂，但用天青蛋 白孵育30分鐘則沒有觀察到此現象。
實施例11-37。C時wt天青蛋白融合衍生物的內化
如實施例1所述制備并純化一系列在N端或C端截短的wt-天青蛋白 的GST融合蛋白(圖2(a)和2(b))。采用實施例5所述方法，用綴合了 ALEXA FLUOR 568的wt-天青蛋白、GST和GST-azu融合衍生物檢測37。C孵育1 小時后J774細胞中的內在化。核用DAPI染成藍色。
wt-天青蛋白被內在化時，GST仍保留在細胞外周，未被內在化。 GST-azu 36-128和GST-azu 36-89及GST-azu 36-77也被內在化。然而進一 步的截短還證明GST-azu 50-77被內在化，而GST-azu 36-50的內在化效率 非常低并似乎在表面形成團。
實施例12-4°C時天青蛋白融合衍生物的內在化
4。C孵育時，檢測了 wt-天青蛋白和GST-azu融合衍生物在J774細胞中
69的內在化。4'C孵育1小時，在J774細胞中wt-天青蛋白的內在化被嚴重損 害。用GST-azu 36-128和GST-azu36-89也觀察到了相似的損害。較短的 GST-azu 36-7、 GST國azu 50-77、 GST-azu 50-66和GST-azu 67-77在4。C時也 證明了內在化的嚴重損害。
實施例13-GST-GFP-azu 50-77融合蛋白在J774細胞和黑素瘤細胞 UISO-Mel-2中的能量依賴性內在化
將GST與GFP融合制備GST-GFP融合衍生物。另夕卜，將azu 50-77與 GST-GFP融合蛋白(Mr 53kDa)融合(圖6(a))。用SDS-PAGE檢測純化的 GST、 GST-GFP和GST-GFP-azu 50-77融合衍生物的遷移率(圖6(b))。通過 考馬斯藍染色及用抗天青蛋白抗體通過Western印跡進行檢測(圖6(c))。
用不同濃度的GST-GFP處理的J774細胞的流式細胞術測定顯示這個 蛋白結合J774細胞。用濃度增大的GST-GFP-azu 50-77融合蛋白處理的J774 細胞的流式細胞術分選顯示與GST-GFP單獨處理相比熒光顯著減弱(圖7)。 應注意的是GFP在哺乳動物細胞中的內在化已知會導致熒光喪失。用 200(ig/ml的GST-GFP-azu 50-77融合蛋白處理J774細胞時并在37。C孵育更 長時間，熒光減弱也是明顯的。
為確定GST-GFP和GST-GFP-azu 50-77的結合與內在化特征是否存在 不同，用GST-GFP和GST-GFP-azu 50-77在37。C和4。C孵育J774和 UISO-Mel-2細胞。使用共聚焦顯微術定位綠色熒光。在J774細胞中， GST-GFP融合蛋白在37'C和4°C均結合表面而未被內在化。相反， GST-GFP-azu 50-77在37i:被內在化，而在4'C未被內在化。在UIS0-Mel-2 細胞中，GST-GFP融合蛋白在37'C和4"C均保留在表面。相反，類似于J774 細胞，GST-GFP-azu 50-77融合蛋白在37"C被內在化，而在4"C未被內在化。
實施例14-wt-天青蛋白通過細胞膜穿透和胞吞機制進入哺乳動物細胞
如果wt-天青蛋白入胞僅依賴于受體介導的胞吞作用，那么其入胞可通 過質子團(protonophore)羰基氰化物間-氯苯基腙(carbonyl cyanide m-chlorophrnylhydrazone， CCCP，一種線粒體能量生成解偶聯劑)或者以未 標記天青蛋白或其它阻斷受體的銅氧還蛋白預先孵育而阻斷。以IO倍以上 濃度的銅氧還蛋白在4"C孵育J774和UISO-Mel-2細胞2小時，充分洗滌細
70胞以除去銅氧還蛋白，然后用綴合了 ALEXA FLUOR 568的天青蛋白在37。C孵育1小時。在未經銅氧還蛋白處理的細胞中用一樣多的內在化的天青蛋白。也測試了細胞松弛素D(購自Sigma-Aldrich， St丄ouis， Mo 63195)的作用，其是一種已知的受體介導胞吞作用的抑制劑，其破壞細胞微絲網絡，也測試了布雷菲德菌素A(購自Sigma-Aldrich, St丄ouis， Mo63195)的作用，其已知破壞高爾基體并抑制經典的囊泡介導的分泌。20pM濃度的CCCP如0.25至0.5pM的細胞松弛素D —樣顯著降低了 UISO-Mel-2細胞對天青蛋白的攝取。而布雷菲德菌素A則沒有明顯作用。
實施例15- GST-PEDIII-azu 50-77融合衍生物進入UISO-Mel-2細胞
如Hwang ， J.等，Cell 48: 129-36(1987); Reiter， Y.和Pastan， I.，Trends Biotechnol 16: 513-20(1998)所述構建銅綠假單胞菌外毒素A結構域in(PEDIII)的GST融合蛋白。這個GST-PEDIII融合衍生物含有外毒素A的氨基酸381-613。 PEDIII已知具有ADP-核糖基轉移酶活性，能夠通過抑制真核延伸因子2而抑制真核細胞中細胞蛋白質合成。
采用針對GST-GFP-azu 50-77所述的PCR法將azu 50-77序列引入到GST-PEDIII融合蛋白的羧基末端(圖8(a))。通過谷胱甘肽-Sepharose 4B柱層析法將這兩種融合蛋白(GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu 50-77)純化為52和54kDa的蛋白質(圖8(b))。然后UISO-Md-2細胞和正常成纖維細胞(FBT)用不同濃度的這些蛋白在37'C孵育24小時，如實施例9所述用MTT分析檢測細胞死亡程度。
GST-PEDIII表現出低細胞毒性，而GST-PEDIII-azu 50-77融合蛋白由于能有效進入UISO-Md-2細胞而具有高細胞毒性(圖8(c))。相反，融合蛋白對于成纖維細胞則表現出低水平的細胞毒性。
實施例16- wt-天青蛋白中a-螺旋去穩定對于其內在化進入UISO-Mel-2細胞
無實質影響
為檢測(x-螺旋是否在天青蛋白入胞中發揮作用，三種螺旋去穩定的脯氨酸殘基被引入wt-天青蛋白的54、 61和70位(圖6)，并檢測全長A54PT61PK70P天青蛋白突變體進入UISO-Mel-2細胞的情況。還 建了這些位點的單突變體和雙突變體并檢測入胞情況。采用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene， LaJolla， CA)通過定點誘變天青蛋白基因來制備A54PT61PK70P天青蛋白突變體。
用200pg/ml突變體在37'C孵育UISO-Mel-2細胞1小時，然后通過共聚焦顯微鏡定位熒光。在所有情況中，綴合了ALEXA FLUOR 568的天青蛋白突變體都進入了 UISO-Md-2細胞。相似地，在檢測GST-GFP-azu 50-77融合蛋白與A54PT61PK70P zau三突變體變體進入UISO-Mel-2細胞的情況時，沒有觀察到顯著區別。
實施例17- GST-PEDIII-鐵硫菌藍蛋白融合衍生物進入UISO-Mel-2細胞
如實施例15構建銅綠假單胞菌外毒素A結構域m(PEDIII)的GST融合蛋白。采用針對GST-GFP-azu 50-77所述PCR法將全長鐵硫菌藍蛋白序列引入到GST-PEDIII融合蛋白羧基末端。通過谷胱甘肽-Sepharose 4B柱層析法純化該融合蛋白。然后用不同濃度的融合蛋白在37'C孵育UISO-Mel-2細胞和FBT細胞24小時，如實施例7所述用MTT分析檢測細胞死亡程度。GST-PEDIII-鐵硫菌藍蛋白融合蛋白對UISO-Mel-2細胞表現出高細胞毒性(圖9)。相反，融合蛋白對FBT細胞僅表現出低水平的細胞毒性。
權利要求
1.分離的肽，其為銅氧還蛋白的變體、衍生物或結構等價物，可抑制哺乳動物組織中癌前病變的發展。
2. 權利要求1的分離的肽，其中所述銅氧還蛋白選自由天青蛋白、假 天青蛋白、質體藍素、鐵硫菌藍蛋白、Laz、橙綠屈撓素、漆樹藍蛋白和黃 瓜堿性蛋白組成的組。
3. 權利要求2的分離的肽，其中所述銅氧還蛋白是天青蛋白。
4. 權利要求1的分離的肽，其中所述銅氧還蛋白來自選自由銅綠假單 胞菌(尸sewdo附o"as "e廠wg7,"oso)、類產減菌(^4/02//^￡"& _/^eca//>s)、木糖氧化無 色桿菌(/4c/zro附ofeacfer jqy/asca/cb")、 支氣管炎博德特菌(5orafete〃a 6n9"c/z&e; "cfl)、甲基單胞菌(A/^/zy/o附o"os 腦膜炎奈瑟球菌(A^ksen働a 膨m'"g7Y逢)、淋病奈瑟球菌(jVe/MeWa go"on^ga)、 熒光假單胞菌 (尸sew(iomo"as,omscms)、綠針假單胞菌(/^ewfifo附o"os c/z/orarapto)、苛養 木桿菌(v^/e//(3 /aWWosfl)和副溶血性弧菌(^n'o ; ara^emo/;^cw力組成的組 的生物體。
5. 權利要求4的分離的肽，其來自銅綠假單胞菌。
6. 權利要求l的分離的肽，其是選自由SEQIDNO:l、 3-19組成的組 的肽的一部分。
7. 權利要求l的分離的肽，其與選自由SEQIDNO:l、 3-19組成的組 的序列具有至少80%的氨基酸序列相同性。
8. 權利要求l的分離的肽，其是所述銅氧還蛋白的截短體。
9. 權利要求8的分離的肽，所述肽大于約10個殘基，但不超過大約 100個殘基。
10. 權利要求8的分離的肽，其中所述肽包括選自由銅綠假單胞菌天青 蛋白殘基50-77、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-67、銅綠假單胞菌天青蛋 白殘基36-88和SEQ ID NO:20-24組成的組的序列。
11. 權利要求10的分離的肽，其中所述肽由選自由銅綠假單胞菌天青 蛋白殘基50-77、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-67、銅綠假單胞菌天青蛋 白殘基36-88和SEQIDNO:20-24組成的組的序列組成。
12. 權利要求l的分離的肽，其中所述肽包括與選自組殘基50-77、殘基50-67和殘基36-88的銅綠假單胞菌天青蛋白區域等價的銅氧還蛋白殘 基。
13. 藥物組合物，其包含置于藥物可接受載體中的至少一種權利要求l 的銅氧還蛋白或肽。
14. 權利要求13的藥物組合物，其包含至少兩種所述銅氧還蛋白或肽。
15. 權利要求13的組合物，其中所述藥物組合物被配制成用于靜脈施用。
16. 權利要求13的組合物，其中所述銅氧還蛋白來自選自銅綠假單胞 菌、糞產堿菌、木糖氧化無色桿菌、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、腦 膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養木 桿菌或副溶血性弧菌組成的組的生物體。
17. 權利要求16的組合物，其中所述銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌。
18. 權利要求13的組合物，其中所述銅氧還蛋白選自由SEQIDNO:l、 3-19組成的組。
19. 治療哺乳動物患者的方法，包括給患者施用治療有效量的權利要求 13的組合物。
20. 權利要求19的方法，其中所述患者是人。
21. 權利要求19的方法，其中所述患者比普通群體具有更高的癌癥發 病風險。
22. 權利要求21的方法，其中所述癌癥選自黑色素瘤、乳腺癌、胰腺 癌、成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、肺癌、結直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前 列腺癌、皮膚癌和宮頸癌。
23. 權利要求21的方法，其中所述患者具有至少一種高風險特征。
24. 權利要求19的方法，其中患者具有癌前病變。
25. 權利要求19的方法，其中所述患者曾被治愈過癌癥或癌前病變。
26. 權利要求19的方法，其中所述藥物組合物通過選自靜脈注射、肌 內注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮貼劑、栓劑、玻璃體注射和口 服組成的組的模式施用。
27. 權利要求24的方法，其中施用模式是通過靜脈注射。
28. 權利要求21的方法，其中所述藥物組合物與至少一種其他化學預 防性藥物共施用。
29. 權利要求26的方法，其中所述藥物組合物與另一種化學預防藥物 在幾乎相同的時間施用。
30. —種試劑盒，其包含位于小瓶中的權利要求13的組合物。
31. 權利要求30的試劑盒，其中該試劑盒被設計用于靜脈施用。
32. —種研究癌癥發展的方法，包括使哺乳動物細胞與權利要求1的銅 氧還蛋白或肽接觸，并測量癌前和癌細胞的發展。
33. 權利要求32的方法，其中所述細胞是人類細胞。
34. 權利要求32的方法，其中所述細胞是乳腺細胞。
35. 權利要求32的方法，其中所述細胞被誘導以發展癌癥。
36. —種表達載體，其編碼權利要求1的肽。
37. 分離的肽，其為銅氧還蛋白的變體、衍生物或結構等價物；其中所 述分離肽與貨物化合物偶聯，可選擇性地進入哺乳動物癌細胞。
38. 權利要求37的分離的肽，其中所述銅氧還蛋白來自選自由銅綠假 單胞菌、糞產堿菌、木糖氧化無色桿菌、支氣管炎博德特菌、甲基單胞菌、 腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養木 桿菌和副溶血性弧菌組成的組的生物體。
39. 權利要求37的分離的肽，其中銅氧還蛋白是天青蛋白。
40. 權利要求39的分離的肽，其中所述天青蛋白來自銅綠假單胞菌。
41. 權利要求37的分離的肽，其包括SEQIDNO:25。
42. 權利要求37的分離的月太，其由SEQIDNO:25組成。
43. 權利要求37的分離的肽，其是銅氧還蛋白的截短體。
44. 權利要求37的分離的肽，其中所述肽大于約IO個殘基，但不超過 大約100個殘基。
45. 權利要求37的分離的肽，其中所述肽包括選自由銅綠假單胞菌天 青蛋白殘基50-77 (SEQ ID NO:2)、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-67 (SEQ ID NO:25)、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基36-88 (SEQ ID NO:26)和SEQ ID NO:20-24組成的組的序列。
46. 權利要求37的組合物，其中所述貨物化合物是DNA或RNA。
47. 權利要求46的組合物，其中所述貨物化合物是反義分子。
48. 權利要求37的組合物，其中所述貨物化合物阻止或殺死哺乳動物 癌細胞。
49. 權利要求48的組合物，其中所述貨物化合物是細胞毒類藥物。
50. 權利要求37的組合物，其中所述貨物化合物選自由蛋白質、脂蛋 白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、納米粒子、毒素和藥物組成的 組。
51. 權利要求37的組合物，其中所述貨物化合物選自由蛋白質和多肽 組成的組，其中所述肽與貨物化合物連接形成融合蛋白。
52. 權利要求37的組合物，其中所述貨物化合物是毒素。
53. 權利要求37的組合物，其中所述貨物化合物是可檢測的物質。
54. 藥物組合物，其包含權利要求37的組合物和藥學上可接受的載體。
55. —種方法，其包括將一或多個細胞與權利要求37的組合物相接觸。
56. 權利要求55的方法，其中所述一或多個細胞源于患有癌癥的患者， 其還包括將所述細胞回輸至患者體內。
57. 權利要求55的方法，其中所述細胞是癌細胞。
58. 權利要求57的方法，其中所述細胞是選自由骨肉瘤細胞、肺癌細 胞、結腸癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞、軟組織肉瘤細胞、乳腺癌細 胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、黑素瘤細胞、腦腫瘤細胞和前列腺癌細胞組 成的組中的癌細胞。
59. —種治療癌癥患者的方法，其中給所述患者施用治療有效量的權利 要求37的組合物。
60. 權利要求59的方法，其中施用所述復合物的方式選自靜脈內、局 部、皮下、肌內和腫瘤內施用。
61. 權利要求59的方法，其中所述復合物與另一癌癥治療方法聯合施用。
62. —種成像患者癌癥的方法，其中給所述患者施用權利要求53的組 合物，并檢測所述貨物化合物的定位。
63. 權利要求62的方法，其中所述貨物化合物是X射線造影劑，并通 過X射線CT檢測所述貨物化合物的定位。
64. 權利要求62的方法，其中所述貨物化合物是磁共振成像造影劑， 并通過MRI檢測所述貨物化合物的定位。
65. 權利要求62的方法，其中所述貨物化合物是超聲造影劑，并通過 超聲成像檢測所述貨物化合物的定位。
66. —種診斷癌癥的方法，其中將權利要求53的組合物與細胞接觸， 并檢測所述貨物分子的定位。
67. 試劑盒，其包括包含權利要求37的組合物的試劑。
68. 權利要求67的試劑盒，其還包括包含藥學上可接受的佐劑或賦形 劑的試劑。
69. 權利要求67的試劑盒，其還包括用于施用所述試劑的載體。
全文摘要
本發明公開了將貨物化合物遞送入癌細胞的方法和材料。貨物化合物的輸送是通過使用衍生自銅氧還蛋白的蛋白轉導結構域實現的。所述貨物化合物可以是核酸，特別是DNA、RNA或反義分子。本發明還揭示了治療癌癥與診斷癌癥的方法。
文檔編號A61K38/00GK101668536SQ200880009621
公開日2010年3月10日 申請日期2008年2月8日 優先權日2007年2月8日
發明者A·查克拉博蒂, C·貝蒂, T·達斯古普塔, 亨山田 申請人:伊利諾斯大學理事會