用于進行干細胞調節的軟凝膠系統的制作方法

專利名稱：用于進行干細胞調節的軟凝膠系統的制作方法
技術領域：
本發明提供了使用軟凝膠調節干細胞發育的方法。具體的，所述的發明提供了用 來對所述的干細胞的發育進行調節的方法、組合物以及裝置，在所述的方法、組合物以及裝 置中使用到具有最優化的粘彈性特性的凝膠。發明的
背景技術：
成人的間充質干細胞具有自我再生的能力并且分化成間充質組織的多種細胞譜 系。因此，已經對這些細胞的臨床應用進行了考慮，例如對受損傷組織進行的替代作用或者 作為抗癌癥試劑的載體。成人間充質干細胞的應用目前仍然被限制在臨床前階段，這在部 分上歸因于這些細胞在體外發生的迅速老化，這種老化限制了它們的擴張以及工程應用。 為了克服由加速老化所帶來的問題，已經報道了通過端粒酶的轉導作用對間充質干細胞進 行永生化處理。然而，一旦它們被植入到組織中時，它們不受限制的自我再生能力可能導致 失控的生長。事實上，已經在體外裝置中觀察到了端粒酶轉導的間充質干細胞的轉化作用。因此，對于成人間充質干細胞的生長的調節對于它們的臨床應用而言是關鍵步驟 之一。發明概述本發明提供了使用軟凝膠調節干細胞發育的方法。具體的，所述的發明提供了用 來對所述的干細胞的發育進行調節的方法、組合物以及裝置，在所述的方法、組合物以及裝 置中使用到具有最優化的粘彈性特性的凝膠。在一種實施方式中，所述的發明提供了一種制造包覆的聚丙烯酰胺凝膠的方法， 其中所述的聚丙烯酰胺凝膠具有在150-750帕(Pa)的范圍內的硬度，所述的方法包括使一 種組合物發生聚合的步驟，其中所述的組合物包括丙烯酰胺和雙丙烯酰胺，所述組合物具 有的丙烯酰胺雙丙烯酰胺的混合比率在100 1到30 1之間，并且用一種組合物包覆 所述柔軟的聚丙烯酰胺凝膠，所述組合物包括一種I型膠原蛋白和一種纖維結合蛋白。在另外一種實施方式中，所述的發明提供了一種制造纖維蛋白基質的方法，其中 所述的纖維蛋白基質具有在0. 1-2. 5千帕(kPa)的范圍內的硬度，所述的方法包括使一種 組合物發生聚合的步驟，其中所述的組合物包括纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白，從而制造 出一種柔軟的纖維蛋白基質，其中存在于所述柔軟的纖維蛋白基質中的所述纖維蛋白或者 纖維蛋白原蛋白的濃度為1-20毫克/毫升，并且利用一種包括粘附蛋白的組合物對所述的 柔軟的纖維蛋白基質進行覆蓋。在另外一種實施方式中，所述的發明提供了一種保存間充質干細胞種群的方法， 所述的方法包括在一種凝膠基質中對所述的間充質干細胞種群進行培養的步驟，其中所述 的凝膠基質具有在0. 1-2. 5千帕(kPa)的范圍內的硬度。在另外一種實施方式中，所述的發明提供了一種誘導間充質干細胞種群分化變成 一種脂肪細胞群體的方法，所述方法包括在有一種儀器存在的情況下培養所述間充質干 細胞種群的步驟，所述一起包括(a) —種凝膠或者基質，所述凝膠或者基質具有的硬度在 150-750帕范圍內，和(b) —種脂肪細胞誘導介質，從而誘導間充質干細胞種群分化成所關心的細胞類型。在另外一種實施方案中，所述的發明提供了一種儀器，該儀器可以用于調節間充 質干細胞的生長，該儀器包括一種凝膠基質，所述凝膠基質的剛性在150-750帕范圍內； 和一種脂肪細胞誘導介質，其中，所述凝膠或者基質包覆有I型膠原蛋白、一種纖維結合蛋 白或者其結合物。在另外一種實施方案中，所述的發明提供了一種凝膠基質，這種凝膠基質包括一 種凝膠試劑、一種丙烯酰胺-雙丙烯酰胺混合物，其中所述凝膠基質包覆有I型膠原蛋白、 一種纖維結合蛋白、或者其結合物，并具有范圍在150-750帕范圍內的剛性。在一種實施方式中，所述的發明提供了一種對間充質干細胞的發育進行調節的方 法，所述的方法包括將所述的間充質干細胞懸浮在一種凝膠基質中的步驟，所述的凝膠基 質中包括一種膠凝劑，其中所述的凝膠基質被1型膠原質、纖維粘連蛋白或者它們的結合 物進行了包覆并且其中所述的凝膠基質被保持在一種預先確定的硬度下；以及將所述的凝 膠基質暴露在一種生長調節因子之中。在另外一種實施方式中，所述的發明提供了一種在體外誘導或者維持成體干細胞 的靜止狀態并且保持成體干細胞的生物學活性的方法，該方法包括將所述的成體干細胞 與一種凝膠基質進行接觸，其中所述的凝膠基質中包括一種細胞外物質，這種細胞外物質 能夠與存在于所述的成體干細胞的膜上的整聯蛋白發生結合，所述的凝膠基質所具有的彈 性與同樣類型的體內成體干細胞的主要體內生物學微環境所具有的彈性在本質上是類似 的；并且向所述的成體干細胞提供營養物質，用以在體外維持所述成體干細胞的生物學活 性。附圖的簡要說明附

圖1A表示的是聚丙烯酰胺底物的機械性質。對具有一定的丙烯酰胺(利用靠 近數據線的百分數進行表示)與雙丙烯酰胺(利用交聯劑進行表示)的比例范圍的聚丙烯 酰胺凝膠的剪切模量進行了測量。所述的剪切模量(G')用帕斯卡(Pascal)進行表示， 在聚合物的質量恒定時，交聯劑的增加產生增加的剪切模量。將所述的丙烯酰胺的濃度從 3%增加至12%，同樣生成了在10至50000Pa范圍內的高硬度。所述的實線代表的是一種 橡膠樣的網狀物的理論硬度，如果每個交聯具有有效彈性的話。附圖1B表示的是存在于堅 硬的基質或者柔軟的基質之上的人類間充質干細胞(hMSC)的細胞形狀以及絲狀肌動蛋白 (F-actin)結構。附圖1C表示的是存在于柔軟的凝膠以及玻璃之上的人類間充質干細胞的 細胞形狀以及絲狀肌動蛋白結構。附圖2表示的是在人類間充質干細胞內進行的5-溴-2'-脫氧核苷尿嘧啶 (BrdU)的引入。附圖3表示的是基質的硬度對于脂肪細胞的分化所產生的影響。A表示的是陽性 細胞百分含量的圖表。在每個系列中的第一個柱油紅0染色。第二個柱過氧化物酶體增 殖物激活受體、2 (PPAR Y 2)染色。附圖4表示的是被接種于堅硬的凝膠或者柔軟的凝膠之上的星形細胞的絲狀肌 動蛋白(F-actin)結構。附圖5表示的是對于Rho的活性從柔軟的凝膠到堅硬的凝膠之上的增加的量化。 將星形細胞接種在具有各種不同硬度的聚丙烯酰胺凝膠之上。對Rho的三磷酸鳥苷(GTP)
9裝載水平進行量化。附圖6表示的是黑素瘤細胞在堅硬的基質上延展的更好。面積的圖解表示法。附圖7表示的是黑素瘤細胞以相同的效率附著于柔軟的凝膠以及堅硬的凝膠之 上。附圖8表示的是存在于堅硬的凝膠之上的更大的黑素瘤細胞種群。附圖9表示的是根據本發明中的各種不同的實施方式，存在于具有不同的彈性的 幾種底物之上的人類間充質干細胞的圖像。附圖10表示的是根據本發明中的各種不同的實施方式，存在于具有不同的彈性 的底物之上的人類間充質干細胞中吸收的5-溴-2'-脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)的量。附圖11表示的是(A-D)根據本發明中的各種不同的實施方式，對一種類似于3D 的環境對于干細胞形狀以及增殖所產生的影響所進行的描述。附圖12表示的是根據本發明中的各種不同的實施方式，人類間充質干細胞對于 脂肪形成性誘導培養基的應答。附圖13表示的是根據本發明中的各種不同的實施方式，利用骨誘導培養基對人 類間充質干細胞進行刺激之后，利用茜素紅(Alizarin Red)S顯現的鈣沉積。附圖14表示的是根據本發明中的各種不同的實施方式，制備一種體系的流程圖， 其中所述的體系被用來在成人干細胞中誘導靜止狀態，分化，以及增殖。附圖15表示的是對本發明所述的體系的實施方式的示意性說明。本發明的
具體實施例方式本發明提供了具有在0. 01-50千帕(kPa)的范圍內的硬度的凝膠以及基質，制造 上述凝膠以及基質的方法，以及保存間充質干細胞種群或者研究間充質干細胞的方法，其 中在所述的方法中包括上述的凝膠以及基質。在一種實施方式中，所述的發明提供了一種制造具有的硬度在150-750帕范圍內 的聚丙烯酰胺凝膠的方法，該方法包括聚合組合物的步驟，搜書組合物包括丙烯酰胺和雙 丙烯酰胺，從而生產一種柔軟的聚丙烯酰胺凝膠，并且用一種包括I型膠原蛋白和纖維連 接蛋白(ffbronectin )的組合物進行包覆，從而產生一種聚丙烯酰胺凝膠，這種聚丙烯酰 胺凝膠具有的硬度在150-750帕范圍內。在另一個實施方案中，所述組合物具有的丙烯酰 胺雙丙烯酰胺的混合比率在100 1到30 1之間。在另一個實施方案中，所述凝膠具 有的丙烯酰胺雙丙烯酰胺的混合比率在100 1到30 1之間。在另外的一個實施方 案中，所述組合物具有的總丙烯酰胺濃度為3-5%。在另外的一個實施方案中，所述凝膠或 者基質具有的總丙烯酰胺濃度為3-5%。在另外的一個實施方案中，所述組合物是一種溶 液。在另外的一個實施方案中，所述組合物是一種懸浮液。在另外的一種實施方案中，所述 組合物是任意一種其他類型的組合物，這種組合物在本發明所屬領域內是已知的。每種可 能性代表本發明的一種單獨的實施方案。在另外一種實施方式中，本發明中提供了一種制造纖維蛋白基質的方法，其中所 述的纖維蛋白基質具有在150-750帕(Pa)的范圍內的硬度，所述的方法包括使一種組合物 發生聚合的步驟，其中所述的組合物包括纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白，從而制造出一種 柔軟的纖維蛋白基質，其中存在于所述柔軟的纖維蛋白基質中的所述纖維蛋白或者纖維蛋 白原蛋白的濃度為3-10毫克/毫升，并且利用一種包括粘附蛋白的組合物對所述的柔軟的纖維蛋白基質進行了包覆，從而制造出一種具有在150-750帕(Pa)的范圍內的硬度的纖維
蛋白基質。在另外的一種實施方案中，本發明提供了一種保存間充質干細胞種群的方法，本 方法包括在一種凝膠或者基質中培養間充質干細胞種群的步驟，從而保存間充質干細胞種 群，所述凝膠或者基質的硬度在150-750帕范圍內。在另外的一種實施方案中，所述培養步 驟在不存在化學誘導作用的條件下進行。在另外的一種實施方案中，所述培養步驟在不存 在誘導作用介質的條件下進行。每種可能性代表本發明的一種單獨的實施方案。在另外的一種實施方案中，本發明提供了一種保存間充質干細胞的方法，本方法 包括在一種凝膠或者基質中培養間充質干細胞種群的步驟，從而保存間充質干細胞，所述 凝膠或者基質的硬度在150-750帕范圍內。在另外的一種實施方案中，所述培養步驟在不 存在化學誘導作用的條件下進行。在另外的一種實施方案中，所述培養步驟在不存在誘導 作用介質的條件下進行。每種可能性代表本發明的一種單獨的實施方案。在另外一種實施方式中，本發明中提供了一種誘導轉化細胞的靜止狀態的方法， 該方法包括在本發明所述的一種凝膠或者基質中培養所述的轉化細胞的步驟，從而誘導所 述轉化細胞的靜止狀態。在另外一種實施方式中，所述的轉化細胞是一種癌癥細胞。在另 外一種實施方式中，所述的轉化細胞是一種贅生性細胞。在另外一種實施方式中，所述的轉 化細胞是本領域中已知的任何其他類型的轉化細胞。每一種可能性代表著本發明的一種單 獨的實施方式。在本發明所述的方法以及組合物的另外一種實施方式中，所述的間充質干細胞種 群的端粒酶長度是保持不變的。在另外一種實施方式中，“保持不變”指的是在所述的長度 上缺少本質上的變化。在另外一種實施方式中，所述的術語指的是在所述的長度上缺少可 以測量的變化。在另外一種實施方式中，所述的術語指的是在所述的長度上缺少足夠的變 化，用以影響增殖能力。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在本發明所述的方法以及組合物的另外一種實施方式中，所述的間充質干細胞種 群被保持在一種靜止的狀態。在另外一種實施方式中，“靜止的”指的是缺少明顯的復制。 在另外一種實施方式中，所述的術語指的是一種被顯著降低的水平的復制。在另外一種實 施方式中，所述的術語指的是占很大比例的細胞被停止在所述的細胞周期中。在另外一種 實施方式中，所述的細胞停止在所述的G1階段。在另外一種實施方式中，所述的細胞停止 在所述的G2階段。在另外一種實施方式中，“靜止的”指的是本領域能夠接受的對上述術語 的任何其他的定義。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在一種實施方式中，當所述的干細胞是一種來自于骨髓的人類間充質細胞的實施 方式中，所述的細胞外基質(ECM)具有大約250帕(Pa)的彈性，并且包括膠原質以及纖維 粘連蛋白的混合物。在另外一種實施方式中，所述的膠原質是鼠尾膠原質，并且所述的纖維 粘連蛋白是人類纖維粘連蛋白。所述的膠原質與纖維粘連蛋白的比例可以存在變化，并且 在一種實施方式中，所述的膠原質與纖維粘連蛋白的比例為大約5 1。也可以使用骨膠原 與纖維粘連蛋白的其他比例。本領域普通技術人員將意識到，可以通過其他的來源獲得所 述的膠原質以及纖維粘連蛋白，并且可以使用除膠原質以及纖維粘連蛋白之外的物質，用 來呈遞彈性并且與存在于所述的細胞膜表面上的整聯蛋白進行結合，從而誘導所述細胞的 靜止狀態。
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根據本發明中的實施方式，通過使用一種底物與細胞外物質(ECM)進行耦聯，為 所述的細胞外材料(ECM)提供一種適宜的表觀彈性，這樣一來含有所述的細胞外材料的干 細胞能夠感知到所述底物的彈性。相對應的，所述的底物可以是一種這樣的材料，當其與所 述的細胞外物質發生耦聯時，所述的底物的彈性能夠被含有所述細胞外物質的干細胞進行 感知。在一些實施方式中，所述的底物是玻璃。在另外的實施方式中，所述的底物是一種具 有250帕(Pa)的彈性的凝膠，或者是一種具有7500帕(Pa)的彈性的凝膠。這些凝膠可以 是聚丙烯酰胺凝膠，并且，正如本領域技術人員所已知的，可以通過例如改變存在于所述凝 膠制劑中的所述丙烯酰胺以及雙丙烯酰胺的濃度，對所述的聚丙烯酰胺凝膠的彈性進行改 變。可以在本發明所述的方法中使用的所述具有不同彈性的凝膠的制造對于依照本說明書 的本領域技術人員而言將是顯而易見的。可以通過下述方式對一個干細胞的體內生物學環境的彈性進行測定分離一種生 理學組織樣本，并且之后測量這一組織樣本的剪切模量，其中所述的生理學組織來自于緊 鄰所述干細胞的體內環境中。用于制備以及測量所述的大鼠組織以及牛組織的彈性的范例 性的過程在本說明書中進行了描述。下面的表格1提供了各種不同類型的組織的彈性表 1 在一種實施方式中，存在于250帕的凝膠之上的人類間充質干細胞(MSC)處于一 種靜止狀態，等待著進一步的信號從而決定它們的命運。在一種實施方式中，所述的人類間 充質干細胞將經受脂肪形成性分化(是由化學因子誘導的)，或者在另外的實施方式中，返 回至所述的細胞周期中(通過將所述的細胞耦聯至一種堅硬的表面之上來進行誘導)，或 者進行成骨性分化(這似乎同時需要化學誘導以及堅硬的底物)。在一種實施方式中，利用 脂肪形成性分化因子對培養在柔軟的凝膠之上的細胞進行刺激，將生成顯著高數量的累積 細胞的脂質液滴。在一種實施方式中，成骨細胞的分化作用需要進行化學誘導。在一種實 施方式中，對于同步的機械性刺激以及化學刺激的需求解釋了人類間充質干細胞是怎樣被 劃分到順應性組織中去并且仍然抵抗自發性的分化作用的，其中所述的順應性組織是例如 骨髓。與基質的彈性相類似，在另外一種實施方式中對于所述的細胞外配體的選擇對人 類間充質干細胞的粘附以及分化產生了強烈的影響。在各種不同的組織中發現了 1型膠原
12質，其中所述的組織包括骨頭以及動物性脂肪，并且所述的1型膠原質通常被用來作為底 物進行細胞粘附試驗。在一種實施方式中，在250帕的凝膠上，單獨使用膠原質不能確保大 部分細胞發生有效的粘附。在一種實施方式中，1型膠原質與纖維粘連蛋白以10 1的比 例組成的混合物提供了所述的細胞與所述的250帕凝膠之間的最佳粘附，并且不會對分化 能力產生影響。人類間充質干細胞(MSC)具有重新改造它們的微環境的能力，其中所述的重新改 造是通過改變所述的基質金屬蛋白酶的表達來實現的，并且在一種實施方式中，當實現了 初始的強力粘附之后，這種能力幫助促進了有效的分化。在一種實施方式中，當人類間充質干細胞被培養在柔軟的凝膠之上，發育成一種 圓形的表現型的時候，發生在人類間充質干細胞中的DNA合成急劇減少。這與其他的增殖 性細胞類型相反，其中所述的增殖性細胞類型是例如NIH 3T3成纖維細胞，牛大動脈內皮 細胞，以及NRK (大鼠腎細胞)上皮細胞，當這些細胞被培養在柔軟的凝膠之上時，它們全部 繼續進行分化。因此，干細胞在250帕的凝膠上的靜止狀態并不是一種一般形態誘導的胞 質分裂的失效，而是這些細胞對于底物順應性的特異性的敏感性。因此并且在一種實施方 式中，本發明提供了一種將干細胞保持在一種靜止狀態下的方法，包括將所述的干細胞懸 浮在一種纖維粘連蛋白/膠原質凝膠之中，其中所述的纖維粘連蛋白/膠原質凝膠具有250 帕的剪切模量(G')。在一種實施方式中，當非增殖性人類間充質干細胞出現在一種包覆有蛋白凝膠基 質的玻璃底物之上時，所述的細胞會發育成一種紡錘形態并且重新進入所述的細胞周期。 在另外一種實施方式中，一種堅硬底物的存在改寫了來自于順應性基質的生理線索。在一 種實施方式中，在不存在任何的化學誘導的前提下，在柔軟的250帕凝膠之上，不存在能夠 通過神經突樣的突起物來表現出神經元表現型的顯著的細胞種群。在一種實施方式中，底物的彈性對具有特異性表現型的細胞的分化作用進行調 節。在另外一種實施方式中，機械性質不能單獨指導干細胞的分化作用。這是因為存在于 所述機體之中的幾種組織具有相似的彈性。例如，大腦、脂肪、以及骨髓組織均具有大約200 帕的貯能模量，然而全部能夠維持獨特的細胞種群。在另外一種實施方式中，體內的人類間 充質干細胞在個體的骨髓中存儲幾十年并且仍然保留了多潛能性。在一種實施方式中，將 人類間充質干細胞體外培養于堅硬的組織培養塑料之上并且能夠保持幾個階段(several passages)的多潛能性。在一種實施方式中，所述的細胞同時對機械性刺激以及化學刺激進 行了整合，用以確定所述細胞的應答。在另外一種實施方式中，盡管化學刺激能夠改寫所述 的底物機械學所帶來的影響，在另外的實施方式中，一種不適當的機械環境能夠阻止針對 化學激動劑的正常的細胞應答。在一種實施方式中，僅僅當靜止態的細胞的物理環境以及 化學環境均發生改變，并且改變成能夠刺激骨生成的環境時，作為其結果，靜止態的細胞分 化成為成骨細胞。因此并且在一種實施方式中，一種具有適宜彈性的基質具有維持一種靜 止態的多潛能性骨髓間充質干細胞種群的能力，其中所述的多潛能性骨髓間充質干細胞能 夠同時對驅動增殖以及分化的機械性刺激以及化學刺激產生應答。附圖14描述的是根據本發明中的各種不同的實施方式，制備一種體系的實施方 式的流程圖，其中所述的體系被用來在成人干細胞中誘導靜止狀態，分化作用，以及增殖作 用。丙烯酰胺以及雙丙烯酰胺的溶液是在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中制備得到的，制得的總體積為500微升。在一種實施方式中，對所述的丙烯酰胺以及雙丙烯酰胺的濃度進行調整 能夠獲得很寬范圍的硬度。利用TEMED(N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺)以及過硫酸銨觸發 了聚合作用從而形成一種凝膠。在步驟601中，丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(聚丙烯酰胺)溶液 (Acrylamide/bisacrylamide (polyacrylamide) solution),將所述的聚合凝膠的一個液滴 (例如，大約200微升)沉積在一個玻璃蓋片之上，其中所述的玻璃蓋片在此之前利用3-氨 基丙基三甲氧基硅烷以及戊二醛進行了修飾。在步驟602中，利用存在于甲苯之中的N-羥 基琥珀酰亞胺進行覆蓋，向步驟601中所述的溶液中施加大約15微升存在于甲苯之中的 2 %的丙烯酸N-羥基琥珀酰亞胺酯，并且，在步驟603中，頂端蓋片(TopCoversl ip)，將一種 經過氯硅烷化的蓋片放置于所述液滴之上。在步驟604中，除去蓋片(Remove coverslip), 當聚合作用完成之后將上述的頂端蓋片除去并且，任選的，利用紫外光對所述的凝膠進行 大約10-15分鐘的照射(未示出)。在步驟605中，細胞外物質(ECM)配體(ECM ligand)， 使存在于所述的凝膠之上的N-琥珀酰亞胺丙烯酸酯與一種細胞外物質配體進行反應，所 述的細胞外物質配體在一種實施方式中為0. 1毫克/毫升的1型膠原質與0. 02毫克/毫升 的纖維粘連蛋白的混合物。在一個進一步的步驟中(未描述)，利用磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 對所述的凝膠進行3次洗滌并且將其保留在磷酸鹽緩沖溶液中直至步驟606，存在于凝膠 之上的細胞(Cells on gel)，當干細胞被接種在所述的凝膠之上時，當來自于骨髓的間充 質干細胞被接種在這種材料之上時，細胞變為靜止狀態，即使在存在能夠引起增殖作用或 者分化作用的化學刺激的情況下。因此，在一種實施方式中，本發明提供了一種在體外誘導或者維持成體干細胞的 靜止狀態并且保持成體干細胞的生物學活性的方法，包括將所述的成體干細胞與一種凝 膠基質進行接觸，其中所述的凝膠基質中包括一種細胞外物質，能夠與存在于所述的成體 干細胞的膜上的整聯蛋白發生結合；所述的凝膠基質所具有的彈性與同樣類型的體內成體 干細胞的主要體內生物學微環境所具有的彈性在本質上是類似的；并且向所述的成體干細 胞提供營養物質，用以在體外維持所述成體干細胞的生物學活性。在本發明所述的一種方法，可以通過各種不同的方式使干細胞與適宜的細胞外物 質(ECM)進行接觸。例如，正如本說明書中所描述的，所述的細胞外物質(ECM)可以形成 一種層，與所述的底物進行耦聯，并且所述的干細胞可以被放置于所述的細胞外物質之上。 可以選擇的，可以將所述的細胞放置于一種細胞外物質之上，其中所述的細胞外物質與所 述的底物進行了耦聯，并且另外使用被放置于所述的細胞之上的細胞外物質與所述的細胞 進行接觸，例如通過在所述的細胞之上放置一種與底物進行了結構耦聯的細胞外物質的方 式，從而向所述的干細胞呈遞適宜的表觀彈性。在另外一種實施方式中，可以存在兩種細胞外物質物質第一種制劑與所述的底 物進行了耦聯，其中所述的制劑中可以包括或者可以不包括營養物質；而第二種制劑中包 括營養物質并且其不與所述的底物進行耦聯。用于將干細胞與一種適宜的細胞外物質(包 括底物以及，選擇性地，連接材料，用于將所述的底物與所述的細胞外物質進行連接)進行 接觸的結構以及構象在本說明書中進行了描述，包括例如附圖6中的描述，并且根據本說 明書，對于本領域技術人員而言是顯而易見的。在本發明所述的方法的實施方式中，根據本發明所述的方法，將不處于一種靜止 狀態下的干細胞與細胞外物質進行接觸，這樣一來靜止狀態被導入到所述的細胞當中并且其從一種非靜止狀態轉變到一種靜止狀態下。在其他的實施方式中，根據本發明所述的方 法將一種靜止態的干細胞與細胞外物質進行接觸，這樣一來靜止狀態被保持在所述的細胞 當中并且其不會從一種靜止狀態中發生轉變。因此，在一種實施方式中，本發明提供了一種對間充質干細胞的發育進行調節的 方法，所述的方法包括將所述的間充質干細胞懸浮在一種凝膠基質中的步驟，所述的凝膠 基質中包括一種膠凝劑，其中所述的凝膠基質被1型膠原質、纖維粘連蛋白或者它們的組 合進行了覆蓋并且其中所述的凝膠基質被保持在一種預先確定的硬度下；以及將所述的凝 膠基質暴露在一種生長調節因子之中，其中暴露在所述的化學因子或者物理因子之中能夠 導致所述的凝膠基質的硬度的增加，所述的硬度能夠被增加到與所述的細胞外物質的硬度 相一致的程度，其中所述的細胞外物質存在于被認為間充質干細胞進行分化的微環境中。在另外一種實施方式中，所述細胞中超過80%的細胞的細胞周期被停止。在另外 一種實施方式中，所述細胞中至少80 %的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中， 所述細胞中超過70%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中至少 70%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中超過75%的細胞的細 胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中至少75%的細胞的細胞周期被停止。 在另外一種實施方式中，所述細胞中超過82%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施 方式中，所述細胞中至少82%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細 胞中超過85%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中至少85% 的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中超過87%的細胞的細胞周 期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中至少87%的細胞的細胞周期被停止。在另 外一種實施方式中，所述細胞中超過90%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式 中，所述細胞中至少90%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中 超過92%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中至少92%的細 胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中超過93%的細胞的細胞周期被 停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中至少93%的細胞的細胞周期被停止。在另外一 種實施方式中，所述細胞中超過94%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中， 所述細胞中至少94%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中超過 95%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中至少95%的細胞的細 胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中超過96%的細胞的細胞周期被停止。 在另外一種實施方式中，所述細胞中至少96%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施 方式中，所述細胞中超過97%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細 胞中至少97%的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中超過98% 的細胞的細胞周期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中至少98%的細胞的細胞周 期被停止。在另外一種實施方式中，所述細胞中超過99%的細胞的細胞周期被停止。在另 外一種實施方式中，所述細胞中至少99%的細胞的細胞周期被停止。每一種可能性代表著 本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復 制而言，復制被減少了 50%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制 而言，復制被減少了 60%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而 言，復制被減少了 65%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，
15復制被減少了 70%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復 制被減少了 75%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復制 被減少了 80%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復制被 減少了 85%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復制被減 少了 90%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復制被減少 了 95%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復制被減少了 97%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復制被減少了超過 97%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復制被減少了超過 98%。在另外一種實施方式中，相對于存在于組織培養皿中的復制而言，復制被減少了超過 99%。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中的一種方法中進一步包括隨后的(例如，在有 本發明所述的凝膠或者基質存在的情況下進行的培養之后)將所述的間充質干細胞種群 放置于(plating) —種組織培養儀器中的步驟。在另外一種實施方式中，所述的組織培養 儀器中含有誘導培養基。在另外一種實施方式中，通過化學誘導來完成所述的隨后的放置 步驟。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明提供了一種研究間充質干細胞的增殖作用或者分 化作用的方法，包括在一種凝膠或者基質中對所述的間充質干細胞進行培養的步驟，其中 所述的凝膠或者基質具有的硬度在150-750帕的范圍內，從而對間充質干細胞的增殖作用 或者分化作用進行研究。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的脂肪細胞種群是一 種包括脂肪細胞的種群。在另外一種實施方式中，所述的種群中富含脂肪細胞。在另外一種 實施方式中，所述的種群是一種被部分純化的脂肪細胞種群。在另外一種實施方式中，所述 的脂肪細胞是從一種生物學來源中分離出來的，并且隨后進行了純化步驟或者富集步驟。 在另外一種實施方式中，從所述的生物學來源中進行分離之后進行培養。在另外一種實施 方式中，從所述的生物學來源中進行分離之后，進行培養步驟以及純化步驟或者富集步驟。 每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的所述細胞種群是在 有本發明中所述的方法以及組合物中的凝膠或者基質的存在的條件下進行培養的。在另 外一種實施方式中，所述的細胞種群被培養在所述的凝膠或者基質之中。在另外一種實施 方式中，所述的細胞種群被培養在所述的凝膠或者基質之上。在另外一種實施方式中，所述 的細胞種群被培養在一種組織培養儀器中，所述的組織培養儀器中含有所述的凝膠或者基 質。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，“間充質干細胞種群”指的是一個包括間充質干細胞 (MSC)的種群。在另外一種實施方式中，所述的種群中富含間充質干細胞。在另外一種實施 方式中，所述的種群是一種被部分純化的間充質干細胞種群。在另外一種實施方式中，所述 的間充質干細胞是從一種生物學來源中分離出來的，并且隨后進行了純化步驟或者富集步 驟。在另外一種實施方式中，從所述的生物學來源中進行分離之后進行培養。在另外一種 實施方式中，從所述的生物學來源中進行分離之后，進行培養步驟以及純化步驟或者富集 步驟。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。
在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的“間充質”細胞是從 骨髓中分離出來或者純化出來的。在另外一種實施方式中，所述的細胞是來自于骨髓的間 充質干細胞。在另外一種實施方式中，所述的細胞是從脂肪組織中被分離出來或者純化出 來的。在另外一種實施方式中，所述的細胞是從軟骨中被分離出來或者純化出來的。在另 外一種實施方式中，所述的細胞是從本領域已知的任何其他組織中被分離出來或者純化出 來的。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的凝膠或者基質具有 150-750帕斯卡(Pa)的硬度。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中 的凝膠或者基質具有150-750帕的剪切模量。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實 施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的凝膠或者基質具有 與一種生物學組織相當的硬度。在另外一種實施方式中，所述的生物學組織是骨髓。在另 外一種實施方式中，所述的生物學組織是脂肪組織。在另外一種實施方式中，所述的生物學 組織是本領域已知的任何其他生物學組織。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施 方式。在一種實施方式中，本發明中所描述的所述凝膠基質能夠形成各種不同強度的凝 膠，這取決于它們的結構以及濃度，并且在另外一種實施方式中，取決于環境因素例如離子 強度，PH以及溫度。在一種實施方式中被稱作“粘彈性”的組合的粘性以及膠凝行為是通 過測定一種振蕩力對所述的物質的運動所產生的作用來檢查的。在另外一種實施方式中， 彈性模量(G’)，粘性模量(G”)，以及復數粘度(n*)被認為是使用本發明中所描述的方法 而被改變的參數，并且在另外一種實施方式中通過伴隨時間對應力或者應變(strain)進 行協調的改變，從而對這些參數進行分析(表格1)。這些參數來自于所述的復數模量(G*) 以及相位角(S)，其中所述的復數模量是最大應力與最大應變(strain)的比例，所述的相 位角是脫離相位的所述應力以及應變(strain)的角度。表格2.云力力學樽量，才目位角(8),\)Xmm (CO)丨旬的關系 在一種實施方式中，在本發明所描述的凝膠基質中，由剪切應力所導致的某些形 變是彈性的并且當所述的力量被去除時所述的形變將還原為零。其他的形變，例如在一種 實施方式中，通過鏈(chains)在所述溶劑中的滑動易位所產生的形變將不會在所述的力 量被去除時還原為零。在一種恒定的力量之下，所述的彈性易位在一種實施方式中保持恒 定，而所述的滑動易位繼續進行這樣的增加。在一種實施方式中，所述的術語“彈性的”或者“彈性”以及類似的術語指的是本 發明中所描述的凝膠基質的一種物理性質，也就是所述的凝膠在機械力量之下的形變能力 以及當所述的形變力量被去除時，所述的凝膠保持其原始形狀的能力。在另外一種實施方 式中，所述的術語“彈性模量”指的是楊氏模量(Young's Modulus)并且是對于一種比例的 測量，其中所述的比例是沿所述物質的一個軸上的單軸向應力與沿該軸的伴隨而來的正應 變(strain)所形成的比例。所述的剪切模量(來自于改變的應變)指的是所述的剪切應力與所述的剪切應變 所形成的比例。所述的剪切模量遵循下述來自于與上文內容相類似的復數關系的公式G* = G，+iG”其中G*是所述的復數剪切模量，G’是所述的相內(in-phase)貯能模量，i是一種 物質相關性因子并且G”是脫離相位的導致相似性的損失模量；G* = E(G’ 2+G”2)。這些參 數發生交叉的頻率與所述物質的特異性的松弛時間(t)相符合。在一種實施方式中，本發明中所描述的凝膠基質的線性粘彈性性質是通過在振蕩 式剪切流體中進行的測量來確定的，其中所述的振蕩式剪切流體是小振幅的并且具有變化 的角頻率。所述G’的數值以及G”的數值在這里在很大程度上是由存在于所述的水溶液之 中的纖維素衍生物的濃度以及所述的代表性粘度數值的量級來決定的。因此，在下文中，僅 僅需要考慮具有增加的角頻率《的G’以及G”的相關過程(relative course) 0在一種 實施方式中，在濃度為1.5%至2% (重量/重量)的纖維素衍生物水溶液中并且在溫度為 大約20°C的條件下，所述的G’以及G”對于所述的纖維素衍生物的行為是這樣的在低角 頻率(《)下時，所述的貯能模量G’小于所述的損失模量G”，但是隨著角頻率的增加，G’比 G”增加的更多。在另外一種實施方式中，當超過了某個角頻率時，G’最終變得高于G”，并 且具有高數值的角頻率的所述溶液因此主要產生彈性作用。使用本發明中所描述的調節方 法能夠對這種行為進行削弱或者改變。在另外一種實施方式中，所述的術語“彈性”指的是一種物質的物理性質，其中所 述的物理性質定義了所述物質受到應力導致形變的能力，無論所述的形變是否是可逆的。 正如在本說明書中所使用的，彈性以及硬度是呈逆相相關的，并且一種物質的彈性(硬度) 可以使用RFS III流體分光流變儀進行測量，所述的流體分光流變儀可以從Rheometrics， 皮斯卡塔韋(Piscataway)，新澤西(NJ)處獲得，在所述的測量中使用了 2%的振蕩剪切應 變，頻率為每秒10弧度(radian)。可以使用本領域技術人員已知的各種方法中的任何一 種對細胞以及其他生理學組織的彈性以及其他10種流變學性質進行測量。作為例子，這樣的方法可能涉及到流變儀或者原子力顯微鏡的使用(參見，例如，EnglerAJ, Rehfeldt F, Sen S, Discher DE 于 2007 年在 Methods Cell Biol.《分子生物學方法》83 :521_45 ; 15 中發表的文章"Microtissueelasticity (measurements by atomic force microscopy and itsinfluence on cell differentiation《通過原子力顯微鏡測量得到的微組織 彈性及其對細胞的分化作用所產生的影響》”;Yeung T，Georges PC, Flanagan LA, Marg B, Ortiz M, Funaki M, Zahir N, Ming ff, Weaver V, Janmey PA 于 2005 年 1 月在 Cell MotilCytoskeleton《細胞運動性以及細胞骨架》60 (1) :24_34中發表的文章“Effects of substrate stiffness on cell morphology,cytoskeletal structure,and adhesion《底 物硬度對于細胞的形態學、細胞骨骼的結構、以及粘附作用所產生的影響》”)。在一種實施方式中，所述的術語“本征粘度([n*]) ”指的是外推到零濃度的所述 降低的粘度的極限。與所述降低的粘度相同，其具有的單位為濃度的倒數，例如，毫升克-1。在一種實施方式中，硬度或者堅硬度，指的是所觀察到的或者所測量到的G’值。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的凝膠或者基質被一 種包括粘附蛋白的溶液進行了覆蓋。在另外一種實施方式中，所述的粘附蛋白是膠原質。在 另外一種實施方式中，所述的粘附蛋白是1型膠原質。在另外一種實施方式中，所述的粘附 蛋白是纖維粘連蛋白。在另外一種實施方式中，所述的粘附蛋白是本領域已知的任何其他 的粘附蛋白。在另外一種實施方式中，所述的凝膠或者基質被一種包括了粘附蛋白的組合 的溶液進行了覆蓋。在另外一種實施方式中，所述的凝膠或者基質被一種包括了膠原質以 及纖維粘連蛋白的溶液進行了覆蓋。在另外一種實施方式中，所述的凝膠或者基質被一種 包括了 1型膠原質以及纖維粘連蛋白的溶液進行了覆蓋。每一種可能性代表著本發明的一 種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的膠原質是一種重組 膠原質。在另外一種實施方式中，所述的膠原質是從一種生物學來源中純化出來的。在另外 一種實施方式中，所述的膠原質是1型膠原質。在另外一種實施方式中，所述的膠原質是本 領域已知的任何其他類型的膠原質。每一種可能性代表著本發明的一個單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的纖維粘連蛋白是一 種重組纖維粘連蛋白。在另外一種實施方式中，所述的纖維粘連蛋白是從一種生物學來源 中純化出來的。在另外一種實施方式中，所述的纖維粘連蛋白是1型纖維粘連蛋白。在另外 一種實施方式中，所述的纖維粘連蛋白是本領域已知的任何其他類型的纖維粘連蛋白。每 一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的膠凝劑是丙烯酰 胺。在另外一種實施方式中，所述的膠凝劑是一種丙烯酰胺_雙丙烯酰胺混合物。在另外 一種實施方式中，所述的膠凝劑中包括丙烯酰胺。在另外一種實施方式中，所述的膠凝劑中 包括一種丙烯酰胺-雙丙烯酰胺混合物。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方 式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的丙烯酰胺凝膠中所 具有的丙烯酰胺雙丙烯酰胺的比例在100 1至30 1之間。在另外一種實施方式中， 所述的丙烯酰胺凝膠是從一種溶液中制備得到的，所述的溶液中所具有的丙烯酰胺雙丙 烯酰胺的比例在100 1至30 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例在100 1
19至20 1之間。在另外一種實施方式中，所述的丙烯酰胺雙丙烯酰胺的比例在100 1 至40 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例在100 1至50 1之間。在另外一 種實施方式中，所述的比例在100 1至60 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例 在100 1至70 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例在120 1至30 1之 間。在另外一種實施方式中，所述的比例在120 1至40 1之間。在另外一種實施方式 中，所述的比例在120 1至50 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例在120 1 至60 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例在120 1至70 1之間。在另外 一種實施方式中，所述的比例在90 1至20 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比 例在90 1至30 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例在90 1至40 1之 間。在另外一種實施方式中，所述的比例在90 1至50 1之間。在另外一種實施方式 中，所述的比例在90 1至60 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例在80 1 至20 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例在80 1至30 1之間。在另外一 種實施方式中，所述的比例在80 1至40 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例 在80 1至50 1之間。在另外一種實施方式中，所述的比例是30 1。在另外一種實施方式中，所述的 比例是20 1。在另外一種實施方式中，所述的比例是25 1。在另外一種實施方式中， 所述的比例是35 1。在另外一種實施方式中，所述的比例是40 1。在另外一種實施方 式中，所述的比例是45 1。在另外一種實施方式中，所述的比例是50 1。在另外一種 實施方式中，所述的比例是55 1。在另外一種實施方式中，所述的比例是60 1。在另 外一種實施方式中，所述的比例是65 1。在另外一種實施方式中，所述的比例是70 1。 在另外一種實施方式中，所述的比例是75 1。在另外一種實施方式中，所述的比例是 80 1。在另外一種實施方式中，所述的比例是85 1。在另外一種實施方式中，所述的比 例是90 1。在另外一種實施方式中，所述的比例是95 1。在另外一種實施方式中，所 述的比例是100 1。每一個丙烯酰胺雙丙烯酰胺的比例代表著本發明的一個單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的丙烯酰胺凝膠具有 3-5%的總丙烯酰胺濃度。在另外一種實施方式中，所述的丙烯酰胺凝膠是從一種溶液中制 備得到的，所述的溶液中具有3-5%的總丙烯酰胺濃度。在另外一種實施方式中，所述的總 丙烯酰胺濃度為2%。在另外一種實施方式中，所述的濃度為2.5%。在另外一種實施方式 中，所述的濃度為3%。在另外一種實施方式中，所述的濃度為3. 5%。在另外一種實施方式 中，所述的濃度為4%。在另外一種實施方式中，所述的濃度為4.5%。在另外一種實施方 式中，所述的濃度為5%。在另外一種實施方式中，所述的濃度為5.5%。在另外一種實施 方式中，所述的濃度為6%。在另外一種實施方式中，所述的濃度為2-5%。在另外一種實 施方式中，所述的濃度為2. 5-5%。在另外一種實施方式中，所述的濃度為3. 5-5%。在另 外一種實施方式中，所述的濃度為2-4%。在另外一種實施方式中，所述的濃度為2-4. 5%。 在另外一種實施方式中，所述的濃度為2-5%。每一種可能性代表著本發明的一個單獨的實 施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的膠凝劑是一種纖維 蛋白。在另外一種實施方式中，所述的膠凝劑是一種纖維蛋白原蛋白。在另外一種實施方式中，所述的纖維蛋白原的凝血因子被耗盡。每一種可能性代表著本發明的一個單獨的實 施方式。在另外一種實施方式中，存在于本發明中所述的方法以及組合物中的凝膠或者基 質中的所述重組纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白的濃度為3-10毫克/毫升。在另外一種實施 方式中，所述的濃度為3-12毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為3-9毫克/ 毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為3-8毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所 述的濃度為3-7毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為3-6毫克/毫升。在 另外一種實施方式中，所述的濃度為2-12毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃 度為2-10毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為2-9毫克/毫升。在另外一 種實施方式中，所述的濃度為2-8毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為2-7 毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為2-6毫克/毫升。在另外一種實施方 式中，所述的濃度為4-12毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為4-10毫克/ 毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為4-9毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所 述的濃度為4-8毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為4-7毫克/毫升。在 另外一種實施方式中，所述的濃度為5-12毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃 度為5-10毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為5-9毫克/毫升。在另外一 種實施方式中，所述的濃度為5-8毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為2毫 克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為2.5毫克/毫升。在另外一種實施方式 中，所述的濃度為3毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為3. 5毫克/毫升。 在另外一種實施方式中，所述的濃度為4毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度 為4.5毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為5毫克/毫升。在另外一種實 施方式中，所述的濃度為6毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為7毫克/毫 升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為8毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的 濃度為9毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為10毫克/毫升。在另外一種 實施方式中，所述的濃度為11毫克/毫升。在另外一種實施方式中，所述的濃度為12毫克 /毫升。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的纖維蛋白或者纖維 蛋白原蛋白是一種異溫動物的纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白。在另外一種實施方式中，所 述的纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白是一種恒溫動物的纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白。在另 外一種實施方式中，所述的纖維蛋白或者纖維蛋白原來自于一種魚。在另外一種實施方式 中，所述的纖維蛋白或者纖維蛋白原來自于一種鮭魚。在另外一種實施方式中，所述的纖維 蛋白或者纖維蛋白原來自于本領域已知的任何其他魚類。在另外一種實施方式中，所述的 纖維蛋白或者纖維蛋白原來自于本領域已知的任何其他異溫動物。在另外一種實施方式 中，所述的纖維或者纖維蛋白原來自于一種哺乳動物。在另外一種實施方式中，所述的纖維 蛋白或者纖維蛋白原是人類纖維蛋白或者纖維蛋白原。在另外一種實施方式中，所述的纖 維蛋白或者纖維蛋白原是牛纖維蛋白或者纖維蛋白原。在另外一種實施方式中，所述的纖 維蛋白或者纖維蛋白原來自于本領域已知的任何其他哺乳動物。在另外一種實施方式中， 所述的纖維蛋白或者纖維蛋白原來自于本領域已知的任何其他恒溫動物。每一種可能性代 表著本發明的一種單獨的實施方式。
在另外一種實施方式中，所述的膠凝劑是瓊脂糖。在另外一種實施方式中，所述的 膠凝劑是瓊脂。在另外一種實施方式中，所述的膠凝劑是粘多糖。在另外一種實施方式中， 所述的膠凝劑是膠原質。在另外一種實施方式中，所述的膠凝劑是角叉菜。在另外一種實 施方式中，所述的膠凝劑是角叉菜膠。在另外一種實施方式中，所述的膠凝劑是刺槐豆膠。 在另外一種實施方式中，所述的膠凝劑是丙三醇。在另外一種實施方式中，本發明中所述的 方法以及組合物中的膠凝劑是本領域已知的任何其他膠凝劑。每一種可能性代表著本發明 的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的凝膠或者基質是一 種二維的凝膠或者基質。在另外一種實施方式中，所述的凝膠或者基質是一種三維的凝膠 或者基質。在另外一種實施方式中，所述的凝膠或者基質是本領域已知的任何其他類型的 凝膠或者基質。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的凝膠或者基質中進 一步包括一種動物血清。在另外一種實施方式中，所述的動物血清是一種胎牛血清。在另 外一種實施方式中，所述的動物血清是一種小牛血清。在另外一種實施方式中，所述的動物 血清是一種馬血清。在另外一種實施方式中，所述的動物血清是本領域已知的任何其他類 型的含有生長因子的動物血清。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的凝膠或者基質中進 一步包括一種蛋白酶抑制劑。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的蛋白酶抑制劑對一 種肽酶的功能進行抑制。在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶抑制劑是一種蛋白。在一 些實施方式中，所述的蛋白酶抑制劑是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，絲氨酸蛋白酶抑制劑 (serpin)，胰蛋白酶抑制劑，蘇氨酸蛋白酶抑制劑，天冬氨酸蛋白酶抑制劑，或者金屬蛋白 酶抑制劑。在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶抑制劑是一種自殺性抑制劑，轉化態抑制 劑，或者是一種螯合劑。在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶抑制劑是大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)。 在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶抑制劑是4-(2_氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽 (AEBSF-HC1)。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是(O-氨基己酸。在另外一種實 施方式中，所述的抑制劑是(a)l-抗胰糜蛋白酶。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑 是抗凝血酶III。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是(a)l-抗胰蛋白酶([a]l_蛋 白酶抑制劑)。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是APMSF-HC1 (4-脒基苯基-甲烷磺 酰基-氟)。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是抑肽酶。在另外一種實施方式中，所 述的抑制劑是鹽酸苯甲脒。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是胰凝乳蛋白酶。在另 外一種實施方式中，所述的抑制劑是DFP(二異丙基氟-磷酸鹽)。在另外一種實施方式 中，所述的抑制劑是亮抑酶肽。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是PEFABLOC SC(4-(2-氨基乙基)-苯磺酰基氟鹽酸鹽)。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是 PMSF(苯甲基磺酰基氟)。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是TLCK(1-氯-3-甲 苯磺酰基氨-7-氨基-2-庚酮鹽酸鹽)。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是 TPCK(1-氯-3-甲苯磺酰基氨-4-苯基-2-丁酮)。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑 是來自于卵白中的胰蛋白酶抑制劑(卵內粘蛋白)。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑
22是來自于大豆的胰蛋白酶抑制劑。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是抑肽酶。在另 外一種實施方式中，所述的抑制劑是噴他脒羥乙磺酸鹽。在另外一種實施方式中，所述的抑 制劑是抑肽素。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是一種鋅螯合劑。在另外一種實施 方式中，所述的抑制劑是碘乙酸。在另外一種實施方式中，所述的抑制劑是鋅。每一種可能 性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，在本發明中所述的方法以及組合物中所利用的蛋白酶抑 制劑的劑量為0. 1毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶抑制劑的劑量為0.2毫 克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為0.3毫克/升。在另外一種實施方式中，所 述的劑量為0.4毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為0.6毫克/升。在另外 一種實施方式中，所述的劑量為0. 8毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為1毫 克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為1.5毫克/升。在另外一種實施方式中，所 述的劑量為2毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為2.5毫克/升。在另外一 種實施方式中，所述的劑量為3毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為5毫克/ 升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為7毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑 量為10毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為12毫克/升。在另外一種實施 方式中，所述的劑量為15毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為20毫克/升。 在另外一種實施方式中，所述的劑量為30毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量 為50毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為70毫克/升。在另外一種實施方 式中，所述的劑量為100毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶抑制劑的劑量為0. 1-1毫克/升。在另外一 種實施方式中，所述的蛋白酶抑制劑的劑量為0. 2-1毫克/升。在另外一種實施方式中，所 述的劑量為0.3-1毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為0.5-1毫克/升。在 另外一種實施方式中，所述的劑量為0. 1-2毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量 為0.2-2毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為0.3-2毫克/升。在另外一種 實施方式中，所述的劑量為0. 5-2毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為1-2毫 克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為1-10毫克/升。在另外一種實施方式中， 所述的劑量為2-10毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為3-10毫克/升。在 另外一種實施方式中，所述的劑量為5-10毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量 為1-20毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為2-20毫克/升。在另外一種實施 方式中，所述的劑量為3-20毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為5-20毫克/ 升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為10-20毫克/升。在另外一種實施方式中，所述 的劑量為10-100毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為20-100毫克/升。在 另外一種實施方式中，所述的劑量為30-100毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑 量為50-100毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為10-200毫克/升。在另外 一種實施方式中，所述的劑量為20-200毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為 30-200毫克/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為50-200毫克/升。在另外一種實 施方式中，所述的劑量為100-200毫克/升。在另外一種實施方式中，在本發明中所述的方法以及組合物中所利用到的蛋白酶 抑制劑的劑量為1000k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為10k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為12k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為15k. i.u.(激肽 釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為20k. i.u.(激肽釋放酶抑制 單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為30k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。 在另外一種實施方式中，所述的劑量為40k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種 實施方式中，所述的劑量為50k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中， 所述的劑量為70k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量 為100k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為150k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為200k. i.u.(激肽 釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為300k. i.u.(激肽釋放酶抑 制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為500k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/ 升。在另外一種實施方式中，所述的劑量為700k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外 一種實施方式中，所述的劑量為1500k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施 方式中，所述的劑量為3000k. i.u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中， 所述的劑量為4000k. i. u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。在另外一種實施方式中，所述的劑 量為5000k. i. u.(激肽釋放酶抑制單位)/升。蛋白酶抑制劑的每一種劑量代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，被本發明中所述的方法以及組合物中的蛋白酶抑制劑作 用的所述蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶。在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶是胰蛋白酶。 在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶是胰凝乳蛋白酶。在另外一種實施方式中，所述的蛋 白酶是羧基肽酶。在另外一種實施方式中，所述的蛋白酶是氨基肽酶。在另外一種實施方式 中，所述的蛋白酶是能夠在所述的十二指腸或者小腸中發揮作用的任何其他的蛋白酶。每 一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的間充質干細胞種群 是一種成人間充質干細胞種群。在另外一種實施方式中，所述的間充質干細胞種群是一種 青少年間充質干細胞種群。在另外一種實施方式中，所述的間充質干細胞種群是一種嬰幼 兒間充質干細胞種群。在另外一種實施方式中，所述的間充質干細胞種群是一種胎兒間充 質干細胞種群。在另外一種實施方式中，所述的間充質干細胞種群是一種人類間充質干細 胞種群。在另外一種實施方式中，所述的間充質干細胞種群來自于本領域已知的任何動物。 每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種干細胞。在另外一種實 施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種造血干細胞。在另外一種實施方式中，所述的感 興趣的細胞類型是一種脂肪細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一 種內皮祖細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種神經干細胞。在 另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種居住在成人組織中的祖細胞。在另 外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種居住在成人組織中的胰腺祖細胞。在 另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種再生性天然細胞。在另外一種 實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種胃腸干細胞。在另外一種實施方式中，所述的 感興趣的細胞類型是一種肝胰腺上皮干細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種表皮干細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種腸內 上皮干細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種視網膜干細胞。在 另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種神經元上皮干細胞。在另外一種實 施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種肌肉干細胞。在另外一種實施方式中，所述的感 興趣的細胞類型是一種內皮干細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是 一種外周血干細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是本領域已知的任 何其他類型的干細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種祖細胞。在另外一種實 施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種軟骨形成性祖細胞。在另外一種實施方式中，所 述的感興趣的細胞類型是一種脂肪形成性祖細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣 的細胞類型是一種骨髓基質祖細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是 一種肌形成性祖細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種骨形成性 祖細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種肌鍵祖細胞。在另外一 種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是本領域已知的任何其他類型的祖細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種后代細胞類型。在另外 一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種軟骨細胞。在另外一種實施方式中，所述 的感興趣的細胞類型是一種基質細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型 是一種肌管細胞。在另外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種骨細胞。在另 外一種實施方式中，所述的感興趣的細胞類型是一種肌鍵細胞。在另外一種實施方式中，所 述的感興趣的細胞類型是本領域已知的任何其他類型的后代細胞。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法中進一步包括在一種誘導培養基中 對所述的間充質干細胞進行培育的步驟。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一 種干細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種成骨細胞誘導培 養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種造血干細胞誘導培養基。在另外 一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種脂肪細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中， 所述的誘導培養基是一種內皮祖細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培 養基是一種神經干細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種居 住在成人組織中的祖細胞的誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一 種居住在成人組織中的胰腺祖細胞的誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培 養基是一種再生性細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一 種胃腸干細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種肝胰腺上皮 干細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種表皮干細胞誘導培 養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種腸內上皮干細胞誘導培養基。在 另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種視網膜干細胞誘導培養基。在另外一種實 施方式中，所述的誘導培養基是一種神經元上皮干細胞誘導培養基。在另外一種實施方式 中，所述的誘導培養基是一種肌肉干細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導 培養基是一種內皮干細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種 外周血干細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是本領域已知的任 何其他類型的誘導培養基。
在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種祖細胞誘導培養基。在另外一 種實施方式中，所述的誘導培養基是一種軟骨形成性祖細胞誘導培養基。在另外一種實施 方式中，所述的誘導培養基是一種脂肪形成性祖細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中， 所述的誘導培養基是一種骨髓基質祖細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘 導培養基是一種肌形成性祖細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基 是一種骨形成性祖細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是一種肌 鍵祖細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是本領域已知的任何其 他類型的祖細胞誘導培養基。在另外一種實施方式中，所述的誘導培養基是本領域已知的任何其他類型的誘導 培養基。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的培養步驟進行至少 5天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行至少4天的時間。在另外一種實 施方式中，所述的培養步驟進行至少6天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟 進行至少7天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行至少8天的時間。在 另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行至少10天的時間。在另外一種實施方式中，所 述的培養步驟進行至少12天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行至少15 天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行至少20天的時間。在另外一種實 施方式中，所述的培養步驟進行至少25天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步 驟進行至少30天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行至少35天的時間。 在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行至少40天的時間。在另外一種實施方式中， 所述的培養步驟進行至少50天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行至少 60天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行超過4天的時間。在另外 一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行超過6天的時間。在另外一種實施方式中，所述 的培養步驟至少進行超過7天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行 超過8天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行超過10天的時間。在 另外一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行超過12天的時間。在另外一種實施方式 中，所述的培養步驟至少進行超過15天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟 至少進行超過20天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行超過25天 的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行超過30天的時間。在另外一種 實施方式中，所述的培養步驟至少進行超過35天的時間。在另外一種實施方式中，所述的 培養步驟至少進行超過40天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行超 過50天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟至少進行超過60天的時間。在 另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行4天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培 養步驟進行6天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行7天的時間。在另 外一種實施方式中，所述的培養步驟進行8天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養 步驟進行10天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行12天的時間。在另外 一種實施方式中，所述的培養步驟進行15天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養 步驟進行20天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行25天的時間。在另 外一種實施方式中，所述的培養步驟進行30天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行35天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行40天的時間。在 另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行50天的時間。在另外一種實施方式中，所述的 培養步驟進行60天的時間。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟進行超過60天的時 間(at over 60 days)。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，在本發明中所述的凝膠或者基質之中對所述的間充質干 細胞種群進行培養的步驟之前，進行下述步驟在一種組織培養儀器中對所述的間充質干 細胞進行培養。在另外一種實施方式中，所述的組織培養儀器是一種培養皿。在另外一種 實施方式中，所述的組織培養儀器是一種培養板。在另外一種實施方式中，所述的組織培養 儀器是一種長頸瓶。在另外一種實施方式中，所述的組織培養儀器是一種燒瓶。在另外一 種實施方式中，所述的組織培養儀器是一種試管。在另外一種實施方式中，所述的組織培養 儀器是本領域已知的任何其他類型的組織培養儀器。在另外一種實施方式中，在進行所述 的培養步驟之前進行下述步驟在一種組織培養介質中對所述的間充質干細胞進行培養， 其中所述的組織培養介質中例如不存在本發明中所述的凝膠或者基質。在另外一種實施方 式中，所述的在一種組織培養儀器或者在組織培養介質中對所述的細胞進行培養的步驟是 在將所述的間充質干細胞種群從一種生物學樣本中分離出來之后再進行的。在另外一種實 施方式中，所述的培養步驟是在將所述的間充質干細胞種群從一種生物學樣本中純化出來 之后再進行的。在另外一種實施方式中，所述的培養步驟是在對存在于一種生物學樣本中 的所述間充質干細胞種群進行富集之后再進行的。每一種可能性代表著本發明的一種單獨 的實施方式。在另外一種實施方式中，在本發明中所述的凝膠或者基質之中對所述的間充質干 細胞種群進行培養的步驟是在將所述的間充質干細胞種群從一種生物學樣本中分離出來 之后直接進行的。在另外一種實施方式中，所述的進行培養的步驟是在將所述的間充質干 細胞種群從一種生物學樣本中純化出來之后直接進行的。在另外一種實施方式中，所述的 進行培養的步驟是在對存在于一種生物學樣本中的所述間充質干細胞種群進行富集之后 直接進行的。在另外一種實施方式中，“直接”指的是不存在首先在一種組織培養儀器中進 行培養的培養步驟。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的所述祖細胞種群是 一種造血干細胞種群。在另外一種實施方式中，所述的祖細胞種群是一種內皮細胞前體種 群。在另外一種實施方式中，所述的祖細胞種群是一種衛星細胞種群(例如，肌細胞前體)。 在另外一種實施方式中，所述的祖細胞種群是一種短暫增殖(transit-amplifying)神經 祖細胞沿喙側遷移流種群。在另外一種實施方式中，所述的祖細胞種群是一種骨髓基質細 胞種群。在另外一種實施方式中，所述的祖細胞種群是本領域已知的任何其他的祖細胞種 群。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，“祖細胞種群”指的是一種包括祖細胞的種群。在另外一 種實施方式中，所述的種群中富含祖細胞。在另外一種實施方式中，所述的種群是一種經過 部分純化的祖細胞種群。在另外一種實施方式中，所述的祖細胞是從一種生物學來源中分 離出來的，之后對其進行了純化步驟或者富集步驟。在另外一種實施方式中，從所述的生物 學來源中進行分離之后對其進行了培養。在另外一種實施方式中，從所述的生物學來源中 進行分離之后對其進行了培養步驟以及純化步驟或者富集步驟。每一種可能性代表著本發
27明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中提供了一種將轉化細胞分化成為一種分化的細 胞類型的方法，包括在本發明所述的一種凝膠或者基質中對所述的轉化細胞進行培養的步 驟，從而使所述的轉化細胞分化成為一種分化的細胞類型。在另外一種實施方式中，所述的 分化的細胞類型是一種祖細胞。在另外一種實施方式中，所述的分化的細胞類型是一種后 代細胞類型。在另外一種實施方式中，所述的分化的細胞類型是一種組織細胞類型。在另 外一種實施方式中，所述的分化的細胞類型是上述細胞類型中的一種。在另外一種實施方 式中，所述的分化的細胞類型是本領域已知的任何其他類型的分化的細胞類型。每一種可 能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，通過本發明中所述的方法制備得到的細胞或者細胞種群 被用來在宿主體內對損傷組織進行替代。在另外一種實施方式中，通過本發明中所述的方 法制備得到的細胞或者細胞種群被用來作為載體，用于抗癌癥試劑中(參見KassemM于 2006年5月在Ann N Y Acad Sci.《紐約科學研究會年報》1067 :436_42中發表的文章)。 每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。用于確定間充質干細胞的增殖能力以及分化潛能的方法是本領域熟知的，并且在 例如下述文獻中進行了描述BaXter M等人(于2004年在Stem Cells《干細胞》22 (5) 675-82 中發 @ 白勺文章 Study of telomere length reveals rapid aging of human marrowstromal cells following in vitro expansion《對于端粒長度的石if究揭不了人 類骨髓基質細胞在經過體外膨脹之后的快速老化》)，Liu L等人(于2004年3月10日 在Exp Cell Res.《實驗細胞研究》294(1) :1_8中發表的文章Telomerase deficiency impairsdifferentiation of mesenchymal stem cells《端粒酶缺陷對于間充質干細胞的 分化作用的削弱》)，以及Bonab匪等人(于2006年3月10日在BMC Cell Biol. ((BMC細 胞生物學》7 :14中發表的文章Aging of mesenchymal stem cell in vitro《間充質干細 胞的體外老化》)。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物的一項優點在于不存在 所述的間充質干細胞的永生化作用。在另外一種實施方式中，所述的一項優點在于不存在 來自于間充質干細胞種群的癌癥細胞的進化。在另外一種實施方式中，所述的一項優點在 于對于所述的目標細胞分化成多種細胞類型的能力的保持。在另外一種實施方式中，所述 的一項優點在于對于所述細胞的增殖能力的保持。在另外一種實施方式中，所述的一項優 點在于對于所述細胞支持造血細胞生長的能力的保持。在另外一種實施方式中，所述的一 項優點在于所述的目標細胞不需要經過接觸抑制作用而進行分化的能力。在另外一種實施 方式中，所述的分化作用是對增殖作用的抑制作用的結果。每一種可能性代表著本發明的 一種單獨的實施方式。在一種實施方式中，本發明中提供了誘導一種靜止態的成體干細胞的增殖作用的 方法。已經發現，將一種干細胞與一種物質進行接觸，能夠有效的誘導所述干細胞的增殖作 用，其中所述的物質所具有的彈性小于同樣類型的所述干細胞所天然存在的體內微環境所 具有的彈性。本發明中的實施方式因此包括將所述的成體干細胞與一種物質進行接觸，其 中所述的物質包括與存在于所述的細胞膜表面上的整聯蛋白發生連接的化合物，并且所述 的物質對于所述干細胞所產生的表觀彈性小于存在于體內成體干細胞的生物學微環境中的主要物質所具有的彈性，其中所述的體內成體干細胞與所述的成體干細胞具有相同的類 型。例如，可以通過將靜止態的干細胞放置于載玻片上，來誘導所述靜止態干細胞的增殖作 用，其中所述的載玻片具有高于1吉帕斯卡(gigaPascal)(大多數人類組織類型或者動物 組織類型所具有的彈性的一個小的分數)的硬度并且所述的載玻片被一種物質進行了覆 蓋，其中所述的物質與存在于所述細胞之上的整聯蛋白進行了接觸。在其他的實施方式中， 可以通過將所述的細胞與一種物質進行接觸的方式對一種干細胞的增殖作用進行誘導，其 中所述的物質對所述細胞所產生的表觀彈性小于所述的干細胞的體內自然微環境所具有 的彈性的0. 1。在其他的實施方式中，可以通過將所述的干細胞與一種物質進行接觸的方式 對其增殖作用進行誘導，其中所述的物質對所述的干細胞所產生的表觀彈性小于所述的干 細胞的體內自然微環境所具有的彈性的大約0. 5倍(例如，大約0. 4倍至大約0. 5倍)。在實施方式中，同樣可以向所述的細胞提供營養性的生長物質，例如，包括生長因 子以及血清，用于對所述干細胞及其體外后代的增殖作用進行促進并且維持它們的生物學 活性。對于特定的細胞類型而言，所述的營養性生長物質的配制對于本領域技術人員而言 是已知的，并且不需要對針對特定類型的干細胞的已知的營養性生長物質進行改變，來實 現本發明的這個方面。與本發明中的其他方面相同，這種增殖作用誘導方面的實施方式可以利用干細胞 進行實現，其中所述的干細胞包括間充質干細胞(MSC)。所述的間充質干細胞可以從存活的 組織中收集得到，正如本說明書中所描述的，或者其來自于其他來源例如體外培養物以及 低溫凍干的干細胞。這樣的細胞可以呈現一種天然存在的靜止狀態或者呈現一種人工誘導 的靜止狀態，并且例如可以包括這樣的細胞，在所述的細胞中，其靜止態是通過使用本發明 中所述的方法來進行誘導或者進行維持的。因此，依照本發明中所述的方法對其增殖作用 進行誘導的細胞可以包括來自于骨髓的間充質干細胞(MSC)，腎臟干細胞，肝臟干細胞，來 自于骨骼肌的干細胞，來自于骨頭的干細胞，牙髓間充質干細胞，來自于心肌的間充質干細 胞，來自于滑液的間充質干細胞，臍帶間充質干細胞，以及本領域技術人員依照本說明書能 夠識別出來的其他類型的細胞。根據本發明所述的干細胞的增殖作用是可逆的，從而使得能夠在一種細胞中誘導 靜止態以及增殖作用的交替狀態。例如，可以使用本發明中所述的方法在一個干細胞中誘 導并且維持靜止態，例如通過將所述的干細胞與一種物質進行接觸的方式，其中所述的物 質包括與存在于所述的細胞表面之上的整聯蛋白發生結合的化合物，并且所述的物質對所 述細胞所產生的表觀彈性與所述細胞的體內微環境所具有的彈性大致相同。之后可以通過 將所述的細胞與一種物質進行接觸的方式在所述的細胞中誘導增殖作用，其中所述的物質 包括與整聯蛋白發生連接的化合物并且所述的物質對所述的細胞所產生的表觀彈性在本 質上小于所述細胞的體內微環境所具有的彈性。隨后可以通過將上述得到的子細胞與一種 物質進行接觸的方式誘導并且維持靜止態，其中所述的物質包括整聯蛋白結合化合物并且 所述的物質對所述的細胞所產生的表觀彈性與所述細胞的體內微環境大致相同。在另外一種實施方式中，依照本發明中所述的方法將增殖的干細胞誘導進入一種 靜止狀態。按照上面的描述，隨后可以誘導這些靜止態的細胞進行增殖。本發明中進一步提供了誘導一種成體干細胞的分化作用的方法，依照本發明中所 述的方法，在所述的成體干細胞中保持了其生物學活性并且在所述的成體干細胞中對靜止
29態進行了誘導或者維持。本發明中這一方面的實施方式中包括將這樣的細胞與一種分化物 質進行接觸的步驟，其中所述的分化物質中包括化學刺激，所選擇的化學刺激能夠刺激所 述細胞的分化作用，使其分化成為一種預先確定的細胞類型，并且向所述的細胞提供一種 分化細胞營養物質，用以維持所述的分化作用刺激型細胞的生物學活性。在一些實施方式 中，可以在所述的接觸步驟之前進行一個包括例如在體外對所述的成體干細胞的增殖作用 進行誘導(或者許可)的步驟，其中所述的誘導(或者許可)是通過將所述的干細胞與一 種物質進行接觸的方式來實現的，所述的物質所具有的彈性小于意在進行分化作用的所述 目標細胞的天然微環境所具有的彈性。依照本發明，使用已知的方法或者依照本說明書對于本領域技術人員而言顯而易 見的方法可以在靜止態干細胞或者增殖性干細胞中誘導分化作用，其中所述的干細胞的生 物學活性被得以保持。例如，如果所述的干細胞是一種來自于人類骨髓的間充質干細胞，可 以按照本說明書中詳細描述的方法，通過將所述的細胞與一種存在于底物之上的脂肪形成 培養基(如實施例1中所討論的)進行接觸的方式，可以將所述的細胞分化成為脂肪細胞， 其中所述的底物具有大約250帕(Pa)的彈性。利用能夠從本說明書中獲得的信息或者按照 本發明中所描述的信息，其中所述的信息關系到各種不同組織類型的流變能力以及被用來 對干細胞進行誘導使其分化成為各種不同類型的細胞的分化培養基，本領域技術人員將能 夠顯而易見的知曉本發明中所描述的方法可以被用來對一種來自于人類骨髓的間充質干 細胞進行誘導，使其分化成為至少下述細胞類型中的一種或者多種成骨細胞，軟骨細胞， 肌細胞，脂肪細胞，胰島細胞，以及神經元細胞。更為常見的，利用關于各種不同的組織 類型的流變能力方面以及用于對各種不同的干細胞類型的分化作用進行誘導使其分化成 為各種不同類型的細胞的分化介質方面的信息，在本說明書中所識別出的任何類型的干細 胞中對分化作用進行誘導對于本領域技術人員而言將是容易的顯而易見的，將所述的干細 胞分化成為下述細胞中的一種或者多種成骨細胞，軟骨細胞，肌細胞，脂肪細胞，胰島 細胞，神經元細胞，或者另外的細胞類型。在本發明中這個方面的實施方式中，所述的分化細胞與一種培養基進行了接觸， 其中所述的培養基中包括能夠維持所述細胞的生物學活性的營養物質。例如，如果使用本 發明中所述的方法對一種來自于人類骨髓的間充質干細胞進行誘導使其分化成為脂肪細 胞，則為了保持它們的生物學活性，可以將上述得到的脂肪細胞與一種營養物質培養基進 行接觸。所述的營養物質培養基中可以包括DMEM(低葡萄糖)，胎牛血清，以及胰島素。依 照本說明書，其他的營養物質介質以及將分化細胞與它們進行接觸的方法，對于本領域技 術人員而言將是顯而易見的。本發明中進一步提供了一種人造系統，用于誘導或者維持一種成體干細胞的靜止 態及其可持續的生物學活性。在實施方式中，所述的系統中包括一種用于接觸干細胞的細 胞外物質(ECM)配體物質，一種與所述的細胞外物質配體物質進行連接的底物物質，以及 一種用于向所述的干細胞提供營養物質并且保持其生物學活性的培養基。所述的細胞外物 質配體物質，當其與所述的底物物質進行連接時，其所具有的彈性與存在于所述的同樣類 型的體內干細胞的生物學微環境中的主要體內物質所具有的彈性相類似。所述的系統的實 施方式可以適合于在任何的細胞類型中進行靜止態的誘導，其中在所述的任何的細胞類型 中，可以根據本說明書中所描述的發明的方法對其靜止態進行誘導。例如，所述的系統的實施方式可以適合于在下述細胞中對靜止態進行誘導成體干細胞或者胚胎干細胞，人類干 細胞或者動物干細胞，間充質成體干細胞(MSC)，來自于骨髓的間充質成體干細胞，腎臟干 細胞，來自于肝臟的干細胞，來自于骨骼肌的間充質成體干細胞，來自于骨頭的間充質成體 干細胞，牙髓間充質成體干細胞，來自于心肌的間充質成體干細胞，來自于滑液的間充質成 體干細胞，或者臍帶間充質成體干細胞。在實施方式中，當所述的細胞外物質配體物質與所述的底物發生連接并且與一種 干細胞進行接觸時，正如本說明書中詳細描述的，所述的細胞外物質(ECM)物質與存在于 所述的干細胞表面之上的整聯蛋白發生結合，其中所述的結合是以能夠誘導所述的干細胞 進入靜止態的方式來實現的。在本發明中這樣的系統的實施方式中，可以存在一種連接物質，其中所述的連接 物質將所述的細胞外物質(ECM)配體物質與所述的底物物質進行了連接。例如，當所述的 底物物質中包括一種聚丙烯酰胺凝膠并且所述的細胞外物質(ECM)中包括一種膠原質-纖 維粘連蛋白混合物時，所述的連接物質可以是N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，尤其包括N-羥基 琥珀酰亞胺丙烯酸酯。依據所述的底物物質以及所述的細胞外物質所具有的性質，本領域 技術人員能夠容易的確定出連接物質，所述的連接物質也可以被定義為交聯劑，其被用來 在本發明中所述的系統的各種實施方式中將所述的底物物質與所述的細胞外物質進行連 接。在本發明中的實施方式中，當所述的細胞外物質(ECM)配體層與所述的底物發生 耦聯時，所述的細胞外物質配體層對所述的干細胞所產生的表觀彈性在本質上與存在于一 種體內干細胞的生物學微環境之中的主要物質所具有的彈性是相類似的，其中所述的體內 干細胞與所述的跟細胞外物質配體層發生接觸的干細胞的類型相同。所述的細胞外物質 配體層所具有的這種表觀彈性可以不依賴于所述底物的彈性，基本不依賴于所述底物的彈 性，或者取決于所述底物的彈性。在實施方式中，所述的底物所具有的彈性在本質上與存在 于一種體內干細胞的生物學微環境之中的主要物質所具有的彈性是相類似的，其中所述的 體內干細胞與所述的跟細胞外物質配體層發生接觸的干細胞的類型相同，并且所述的細胞 外物質配體層呈遞于所述干細胞的彈性在本質上等于其所耦聯的所述底物所具有的彈性。可以使用各種不同的結構對本發明中所述的人造系統進行實施。在實施方式中， 所述的底物物質形成了一種基質，并且所述的細胞外物質(ECM)被分散在所述的基質之 中。在實施方式中，為了使所述的底物基質物質與所述的細胞外物質發生連接，還可以將一 種連接物質分散在所述的底物基質之中。例如，根據一種實施方式，將膠原質(0.5毫克/ 毫升)與纖維粘連蛋白(0. 1毫克/毫升)的5 1的混合液以及一種N-羥基琥珀酰亞胺 丙烯酸酯(NHS)交聯劑分散在一種聚丙烯酰胺凝膠之中，其中所述的膠原質來源于鼠尾， 所述的纖維粘連蛋白來源于人類。對所述的凝膠進行配制，使所述結構所具有的彈性為大 約250帕。當來自于骨髓的間充質干細胞與所述的聚丙烯酰胺-N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸 酯-纖維粘連蛋白-膠原質結構進行接觸時，它們被誘導進入靜止態。當同樣向與所述結 構發生接觸的間充質干細胞提供適合的營養物質時，它們在靜止狀態下的生物學活性被得 以保持。在實施方式中，所述的底物物質形成了一種層，并且所述的細胞外物質(ECM)形 成了一種與所述的底物層進行直接或者間接連接的層。在其他的實施方式中，所述的連接物質形成了一種連接層，所述的連接層將所述的細胞外物質配體層與所述的底物層進行了 連接。所述的連接層能夠將所述底物所具有的彈性呈遞到所述的細胞外物質配體層中，其 中所述的呈遞是以能夠讓所述的細胞外物質配體層將這種彈性呈遞到所述的干細胞中的 方式來進行的，在所述的干細胞中進行了靜止態的誘導。在一種實施方式中，所述的連接層 中包括了適宜的交聯組合物以及能夠提供這類功能的其他物質。例如，所述的耦聯層中可 以包括N-羥基琥珀酰亞胺，或者在具體的實施方式中，可以包括N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸在實施方式中，所述的底物物質是一種聚丙烯酰胺凝膠。正如本領域中所已知的， 可以通過對存在于所述凝膠之中的丙烯酰胺以及雙丙烯酰胺的濃度進行改變，從而對所述 的聚丙烯酰胺的彈性進行調整。依照本說明書，怎樣制備聚丙烯烯胺或者用在本發明中所 述的系統之中的其他凝膠或者底物物質對于本領域技術人員而言將是顯而易見的。正如依照本說明書將進一步顯而易見的，實施方式中可以利用其他的結構。例如， 通過下述方式可以建立一種準3D結構將干細胞接種在上文中所描述的一種細胞外物質 層之上，通過將所述的系統浸沒于帶有細胞的培養基之中的方式，使所述的細胞沉積在所 述的細胞外物質層上，并且在所述的細胞之上放置另外一種細胞外物質層，其中所述的另 外一種細胞外物質層具有適宜的表觀彈性，正如實施例1中所進一步描述的。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物所具有的一項優點在于 所述的基質或者凝膠對于蛋白水解性降解所產生的抗性。在另外一種實施方式中，所述的 一項優點在于所述的細胞對于活性重建所產生的抗性。在另外一種實施方式中，所述的一 項優點在于異溫動物(例如，鮭魚)的纖維蛋白對于蛋白酶所產生的抗性，其中所述的蛋白 酶是由哺乳動物的神經元所分泌的，并且其中所述的抗性是相較于哺乳動物(例如，人類 或者牛)的纖維蛋白而言的。在另外一種實施方式中，所述的一項優點在于在異溫動物(例 如，鮭魚)的纖維蛋白中傳染性疾病轉移的低發生率，這種低發生率是相較于哺乳動物(例 如，人類或者牛)的纖維蛋白而言的。每一種可能性代表著本發明中的另外一種實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的所述目標細胞是一 種永生化間充質干細胞。在另外一種實施方式中，本發明中提供了一種誘導永生化間充質干細胞的生長停 止的方法，包括在本發明所述的一種凝膠或者基質中對所述的永生化間充質干細胞進行培 養的步驟，從而誘導所述的永生化間充質干細胞的生長停止。在另外一種實施方式中，本發 明中提供了一種抑制永生化間充質干細胞種群的生長的方法，包括在本發明所述的一種凝 膠或者基質中對所述的永生化間充質干細胞進行培養的步驟，從而抑制所述的永生化間充 質干細胞種群的生長。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的所述目標細胞是一 種轉化細胞。在另外一種實施方式中，所述的轉化細胞是一種惡性黑素瘤細胞。在另外一 種實施方式中，所述的轉化細胞是本領域已知的任何其他類型的轉化細胞。每一種可能性 代表著本發明的一種單獨的實施方式。正如本發明中所提供的，M2細胞在較為堅硬的底物上呈現出更大的尺寸以及更大 的細胞種群。在另外一種實施方式中，增加的細胞種群是所述的細胞在堅硬的底物之上的 生長被增強而導致的。在另外一種實施方式中，增加的種群歸因于所述的細胞在柔軟的底物之上的死亡被增強。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中提供了一種誘導轉化細胞的生長停止的方法， 包括在本發明所述的一種凝膠或者基質中對所述的轉化細胞進行培養的步驟，從而誘導所 述的轉化細胞的生長停止。在另外一種實施方式中，本發明中提供了一種抑制轉化細胞種 群的生長的方法，包括在本發明所述的一種凝膠或者基質中對所述的轉化細胞進行培養的 步驟，從而抑制所述的轉化細胞種群的生長。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實 施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的柔軟的底物導致了 所述目標細胞中的以滅活的GDP-結合形式存在的三磷酸鳥苷(GTP)蛋白的增加。在另外 一種實施方式中，所述的三磷酸鳥苷蛋白是Rho。在另外一種實施方式中，所述的三磷酸鳥 苷蛋白是Rac。在另外一種實施方式中，所述的三磷酸鳥苷蛋白是Cdc42。在另外一種實施 方式中，所述的三磷酸鳥苷蛋白是本領域已知的任何其他的三磷酸鳥苷蛋白。每一種可能 性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，所述的Rho家族通過黏著斑的形成而發出信號。在另外 一種實施方式中，Rho的活化作用抑制了 p21WAFlMpl的表達。在另外一種實施方式中，p21的 抑制作用激活了周期素依賴性激酶(CDK)。在另外一種實施方式中，Rho的活化作用誘導了 p27Klpl的去調節以及降解，其中所述的P27k1p1是另外一種周期素依賴性激酶抑制劑。在另 外一種實施方式中，Rho的活化作用誘導了與Rho相關的卷曲蛋白激酶(ROCK)，導致了所述 的Ras-Raf-MEK-ERK途徑的活化。在另外一種實施方式中，這種途徑誘導了由Ras介導的 周期素-D1的轉錄。在另外一種實施方式中，這誘導了 G1-階段的進行。同時，Rho的活化 作用已經表現出能夠導致G1-階段的進行。在另外一種實施方式中，Rac或者Cdc42的活 化作用對周期素-E1以及周期素-D1進行了上調節，導致了 G1-階段的進行。在另外一種 實施方式中，Rho家族的三磷酸鳥苷結合小蛋白的活化作用導致了信號轉導，從而增強了細 胞周期的進行。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的柔軟的底物減小了 所述目標細胞的肌動球蛋白系統的收縮性，這誘導了目標細胞，使其終止增殖作用。在另外 一種實施方式中，這誘導了目標細胞，使其有能力接受進一步的刺激，從而重新開始增殖作 用。在另外一種實施方式中，這誘導了目標細胞，使其有能力接受進一步的刺激，從而進行 終末分化作用。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的柔軟的底物誘導了 肌動球蛋白的活化作用。在另外一種實施方式中，所述的柔軟的底物誘導的是由Rho調節 的肌動球蛋白。在另外一種實施方式中，所述的柔軟的底物誘導的是肌球蛋白II。在另外 一種實施方式中，所述的柔軟的底物誘導的是由Rho調節的肌球蛋白II。每一種可能性代 表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，本發明中所述的方法以及組合物中的組合物進一步包括 一種Rho家族成員的活化劑。在另外一種實施方式中，所述的組合物進一步包括一種Rho家 族成員的抑制劑。在另外一種實施方式中，所述的Rho家族成員是Rho。在另外一種實施方 式中，所述的Rho家族成員是Rac。在另外一種實施方式中，所述的Rho家族成員是Cdc42。 在另外一種實施方式中，所述的Rho家族成員是本領域已知的任何其他的Rho家族成員。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，所述的組合物 中進一步包括一種肌動球蛋白的活化劑。在另外一種實施方式中，所述的組合物中進一步 包括一種肌動球蛋白的抑制劑。在另外一種實施方式中，所述的組合物中進一步包括一種 肌球蛋白II的活化劑。在另外一種實施方式中，所述的組合物中進一步包括一種肌球蛋白 II的抑制劑。每一種可能性代表著本發明的一種單獨的實施方式。對丙烯酰胺凝膠進行聚合的方法是本領域熟知的。在另外一種實施方式中，向適 宜劑量的水中加入1. 5微升的N, N，N，，N，-四甲基乙二胺(TEMED) (FisherBiotech CAS no. 110189)以及5微升10%的過硫酸銨，從而達到1000微升的總體積，將所述溶液用移液 管移液到一個蓋片之上，并且在所述溶液的上方放置一個頂端的蓋片，隨后在10分鐘之后 剝離所述的頂端蓋片。每一種方法代表著本發明的一種單獨的實施方式。在另外一種實施方式中，為了使粘附蛋白交聯在所述的凝膠或者基質之上，使 用到一種雙異官能性交聯劑。在另外一種實施方式中，所述的雙異官能性交聯劑是硫 代-SANPAH(硫代琥珀酰亞胺6 (4’-疊氮-2’-硝基苯基-氨基)己酸酯，Pierce no. 22589)。 在另外一種實施方式中，所述的雙異官能性交聯劑是本領域已知的任何其他的雙異官能性 交聯劑。在另外一種實施方式中，硫代琥珀酰亞胺6(4’ -疊氮-2’ -硝基苯基-氨基)己 酸酯(sulfo-SANPAH)是按照下述方式進行使用的。將1毫克/毫升的硫代琥珀酰亞胺 6 (4’-疊氮-2’-硝基苯基-氨基)己酸酯溶解于水中，并且將200微升這種溶液用移液管 移液在所述的凝膠表面之上。之后將聚丙烯酰胺凝膠放置于距紫外燈下6英寸處并且照射 10分鐘。之后對其洗滌三次，每次使用3毫升200毫摩的pH為8. 6的4-羥乙基哌嗪乙磺 酸(HEPES)。當最后的4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液被吸出后，利用移液管將200微升0. 14毫 克/毫升的魚纖維粘連蛋白溶液(Sea Run Holdings, South Fre印ort，ME)或者0. 14毫克 /毫升的I型膠原質移液到所述的聚丙烯酰胺凝膠之上。之后將容納所述凝膠的多孔培養 板在5°C下培養4小時。每一種方法代表著本發明的一種單獨的實施方式。在本發明中的另外一個方面，可以提供一種含有組分的試劑盒，用于按照上文中 所述的方法裝配一種系統或者相反的，用于實現本發明中所述的方法。在一種實施方式中， 這樣的一種試劑盒中包括下述單獨存在的組分(1) 一種底物，或者用于制造一種底物的 材料；⑵任選的用于制造和/或施用一種耦聯層的材料；以及⑶用于制造和/或施用細 胞外物質配體物質的材料，從而形成一種細胞外物質配體層。所述的底物組分可以，例如， 包括一種具有預先確定的彈性的聚丙烯酰胺凝膠，含有某種物質的聚丙烯烯胺凝膠，其中 所述的物質能夠將所述的凝膠的彈性調整至一種預先確定的彈性或者彈性范圍內，或者所 述的物質能夠使得凝膠或者其他適合的底物具有所期望的彈性。在實施方式中，所述的試 劑盒中包括一種裝置，所述的裝置用于鑲嵌或者容納所述的凝膠，其目的是為了方便所述 的細胞外物質配體層的應用以及任選的一種耦聯層的應用，其中所述的耦聯層用于將所述 的底物耦聯至所述的細胞外物質配體層上。依照本說明書，正如對于本領域技術人員而言 顯而易見的，為了便于所述試劑盒的存儲、裝運以及裝配，可以將本發明中所述的試劑盒中 的各種不同的組分進行混合。這樣的試劑盒的實施方式中還可以包括用于制造和/或施用所述的細胞外物質 配體層的材料。例如，所述的試劑盒中可以包括細胞外物質配體材料，用于直接施用在所述 的底物上。在其他的實施方式中，所述的試劑盒中可以包括所述的細胞外物質配體層材料的各種組分或者成分，并配有用以說明制備其并且將其施用至所述試劑盒中的其他組分中 的說明書。任選的，所述的試劑盒中可以包括用于裝配以及施用一種耦聯層的材料以及說 明書，其中所述的耦聯層用于將所述的底物耦聯至所述的細胞外物質配體層之上。在一種 具體的實施方式中，用于在一種來自于人類骨髓間充質干細胞中誘導靜止態的本發明中所 述的系統的試劑盒中包括下述(a) 一個玻璃皮氏培養皿(或者其他的儀器，用于支撐所述的底物并且容納剩余 的所述組分)；(b)用于制備一種聚丙烯酰胺凝膠的材料，其中所述的聚丙烯酰胺凝膠具有大約 250帕(Pa)的硬度，適合用來作為所述的底物，其中所述的材料包括適宜劑量的丙烯酰胺 以及雙丙烯酰胺；(c)用于在所述的凝膠上進行施加的N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯(NHS)，其目的 在于形成一種耦聯層；以及(d)用于制備一種細胞外物質配體層的材料，包括在實施例1中所定義的材料，用 于制備一種15的纖維粘連蛋白-膠原質細胞外物質。在一種實施方式中，本發明中所述的試劑盒中包括一種聚丙烯酰胺凝膠，所述的 聚丙烯酰胺凝膠被配制成具有一種能夠在一種指定類型的干細胞中誘導靜止態的彈性；一 種包括交聯組合物的溶液，用于在所述的凝膠上進行施用；配制好的細胞外物質，用來與一 種指定類型的細胞表面上的整聯蛋白進行結合；以及，任選的，適合的營養物質(所述的營 養物質也可以由使用者來制備)，所述的營養物質是用于所述的被誘導進入靜止態的細胞 的。在所述試劑盒的一些實施方式中，所述的試劑盒中包括一層材料，用來同時提供 彈性以及細胞外物質配體。在另外一種實施方式中，所述的試劑盒中可以包括下述三層材 料a) 一種凝膠底物，用于向所述的系統中提供彈性；b)細胞外物質配體；以及c)交聯劑，用來將細胞外物質配體連接在所述的底物之上。在本發明中所述的試劑盒的實施方式中，所述的試劑盒中的組分被放置在一種容 器之中，其中所述的容器是例如含有磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的袋子或者塑料包裝。在一些 實施方式中，所述的容器中同樣可以含有防腐劑例如疊氮化鈉。存在于所述試劑盒中的所 述組分可以是水合形式的，例如，在存儲過程中。在一些實施方式中，所述的容器利用適宜 的支架(scaffolds)進行了密封和/或保護，從而避免對所述的系統產生的損壞。所述的 試劑盒可以在低溫下進行裝運，其中所述的低溫是例如大約2°C至大約8°C。在本發明中所述的試劑盒的實施方式中，使用者可以打開所述的容器并且將所述 試劑盒中的所述組分放置在一種適宜的物質之上，其中所述的適宜的物質是例如一種組織 培養板。使用者同樣可以除去所述組分之上的任何堅硬的物質，從而暴露出所述的細胞外 物質配體并且利用一種緩沖液對所述的組分進行洗滌，其中所述的緩沖液是例如磷酸鹽緩 沖溶液(PBS)。之后使用者可以將細胞接種在所述的系統之上，其中所述的接種是通過將 一種細胞懸浮液放置于所述的系統之上的方式來完成的，其中所述的細胞懸浮液中包括細 胞，培養基，以及血清，如果需要的話。
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本發明中所述的系統以及方法可以在體內以及體外被實現。這樣的系統可以包括 例如多孔結構，用以插入到具體組織或者所述的循環系統之中，從而在所述的機體內將一 種干細胞維持在靜止態。例如，干細胞，相應的細胞外物質以及任選的連接物質，可以被分 散在一種聚合基質中，其中所述的聚合基質對所述的干細胞具有適宜的表觀彈性，能夠誘 導或者維持靜止態，并且其同樣具有足夠的多孔性，從而允許體內營養物質到達所述的細 胞中并且允許由所述的細胞所表達的蛋白以及其他因子離開所述的基質。其他的實施方式 中可以包括能夠在干細胞中誘導或者維持靜止態、并且能夠被植入到一種宿主體內的盒子 或者其他裝置。本發明中的一個進一步的方面包括一種體外靜止態干細胞，所述的體外靜止態干 細胞具有持續的生物學活性。這樣的干細胞的例子包括成體干細胞或者胚胎干細胞，人類 干細胞或者動物干細胞，間充質干細胞(MSC)，來自于骨髓的間充質干細胞，腎臟干細胞，來 自于肝臟的干細胞，來自于骨骼肌的間充質干細胞，來自于骨頭的間充質干細胞，牙髓間充 質干細胞，來自于心肌的間充質干細胞，來自于滑液的間充質干細胞或者臍帶間充質干細 胞。在實施方式中，本發明中所述的系統以及方法被用來在一種干細胞中誘導或者維持靜 止狀態，并且對這樣的靜止態的干細胞的所述生物學活性進行保持。因此，在一種實施方式中，本發明中提供了一種對間充質干細胞的生長進行調節 的儀器，所述的儀器中包括一種凝膠基質，其具有在150-750帕的范圍內的硬度；以及一 種脂肪細胞誘導培養基，其中所述的凝膠或者基質被1型膠原質、纖維粘連蛋白、或者它們 的組合進行了覆蓋。在其他的實施方式中，在上文中所描述的任意方法中的所述凝膠以及基質具有本 發明中所述的組合物中的凝膠或者基質中的任何一種性質。每一種性質代表著本發明的一 種單獨的實施方式。詳細的試驗部分實施例1 對各種不同的組織所具有的硬度所進行的測量以及與所述的組織具有材料以及試驗方法聚丙烯酰胺凝膠的制備 制備丙烯酰胺以及雙丙烯酰胺(Fisher Biotech, Loughborough, Leicestershire, UK)溶液，使所述的溶液中含有7. 5 %的恒定不變的聚合物質量，以及 0. 01%、0. 03%或者0. 3%濃度的雙丙烯酰胺，用以改變硬度。使存在于一種甲苯無水層之 下的丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、過硫酸銨、以及N，N，N’，N’_四甲基乙二胺(TEMED)發生聚合作 用，其中所述的甲苯中含有0.5%的N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯(Sigma，St. Louis，MS)，并 且所述的聚合作用是發生在兩層蓋片之間的，其中所述的蓋片是按照下述方式進行化學修 飾的將200微升0. 1N的氫氧化鈉用移液管進行移液，從而對一個25毫米直徑的玻璃蓋片 (Fisherbrand，catalog no. 12-545-102 ；Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)的表面進行 5分鐘的覆蓋。將所述的氫氧化鈉溶液吸出，并且施用200微升的3-APTMS (3-氨基丙基三 甲氧基硅烷，Sigma no. 28-1778，Sigma, St. Louis, M0)并保持3分鐘。利用去離子水對所 述的玻璃蓋片進行徹底的漂洗，從而洗掉任何殘留的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-APTMS) 溶液，并且將200微升0. 5%體積的戊二醛(Sigma no. G7651)的水溶液加入到所述的蓋片之上并保持20分鐘。利用水對所述的玻璃蓋片進行漂洗，將一個18毫米直徑的玻璃蓋片 放置于一片封口膜之上，其中所述的封口膜存在于一個組織培養皿之中，并且在接近所述 蓋片端的所述封口膜之上用移液管對幾滴10%體積的Surfasil溶液(Pierce no. 42800， Pierce,Rockford, IL)進行移液，其中所述的10%體積的Surfasil溶液是存在于氯仿之中 的。將帶有一個半閉合蓋子的所述組織培養皿在一個真空干燥器內放置10分鐘。利用0.2 毫克 / 毫升的層粘連蛋白(Collaborative Biomedical,Bedford,MA)與 被導入到所述的凝膠表面之上的N-琥珀酰亞胺丙烯酸酯進行反應，從而生成一種粘著性 配體的均一涂層。利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液進行洗滌從而除去痕量的未 聚合溶劑之后，向含有所述的聚丙烯酰胺(PA)凝膠的孔中加入培養基并且使其在37°C下 平衡過夜。材料支架(material scaffolds)的粘彈性特征在一種應變控制型流體分光流變儀III (Rheometrics, Piscataway，NJ)中對所述 凝膠的動力學剪切模量進行測量。在兩片鋼板之間使500微升的樣本發生聚合作用，并且 通過相內(inphase)的剪切應力對于描述彈性抗性的剪切模量G’ ( )進行計算，其中所述 的相內存在2%的振蕩型(1弧度/秒)剪切應變。所述組織的動力學剪切模量通過類似 的方法進行測量。使用不銹鋼沖床對一個8毫米直徑的樣本進行切割并且將所述的樣本放 置于所述的板之間。通過在2%的應變下進行的振蕩作用對短期剪切模量(《)進行測量， 并且通過施加10%的穩定應變并且允許所述樣本松弛30秒的方式對所述的長期剪切模量 G(t)進行測量。MM對聚丙烯酰胺凝膠進行制備并且利用0. 14毫克/毫升的1型膠原質以及0. 14毫 克/毫升的魚纖維粘連蛋白的混合物對其進行覆蓋。通過調整所述的丙烯酰胺以及雙丙烯 酰胺的濃度，取得了在一個很寬范圍內的硬度(附圖1A)。所述的聚丙烯酰胺凝膠的硬度不 會對所述的細胞外物質的劑量以及所述的細胞外物質在所述凝膠上的分布產生影響。體外 流變儀同樣被用來確定與間充質干細胞相關的所述組織的彈性性質(表格1)。制備彈性 模量(G’)為200帕的聚丙烯酰胺凝膠(在本發明中被用來作為“柔軟的凝膠”的一種實施 例，并且被用來指代“柔軟的凝膠”)或者彈性模量為7500帕的聚丙烯酰胺凝膠(在本發明 中被用來作為“堅硬的凝膠”的一種實施例，并且被用來指代“堅硬的凝膠”)；所述的柔軟 的凝膠模擬的是所述的骨髓以及脂肪組織所具有的硬度。表格1.組織的硬度。大鼠組織是從三只Sprague-Dawley大鼠中獲得的 因此，對聚丙烯酰胺凝膠進行制備，從而模擬所述的生物學組織所具有的硬度。實施例2 存在于柔軟的凝膠以及堅硬的凝膠之上的人類間充質干細胞的細胞形 狀以及絲狀肌動蛋白結構材料以及試驗方法將人類間充質干細胞稀松的接種在堅硬的凝膠之上或者柔軟的凝膠之上，其中所 述的凝膠利用1型膠原質以及纖維粘連蛋白進行了覆蓋。將細胞在DMEM+10%胎兒小牛血 清中進行24小時的培育，固定，并且利用Alexa Fluor 488鬼筆環肽進行染色。MM對所述的細胞外物質所具有的硬度對hMSC (人類間充質干細胞)的形狀以及絲狀 肌動蛋白結構所產生的影響進行了研究。將細胞在存在有血清的基質之上進行24小時的 培育，從而允許其進行粘附以及延展，其中所述的基質具有各種不同的硬度。被接種在堅硬 的凝膠或者玻璃之上的人類間充質干細胞表現出一種紡錘樣的形狀并且呈現出應力纖維 以及皮質絲狀肌動蛋白(由Alexa Fluor 488鬼筆環肽染色所顯現出的)，而被接種在柔軟 的凝膠之上的細胞呈現出一種圓形的外觀，缺少應力纖維，并且含有絲狀肌動蛋白附聚物 (附圖 1B-C)。因此，人類間充質干細胞能夠感知到所述的細胞外物質所具有的硬度，其中所述 的硬度影響了它們的形狀以及絲狀肌動蛋白結構。實施例3 存在于柔軟的凝膠之上的人類間充質干細胞的增殖作用的抑制材料以及試驗方法在有血清的存在下，利用5-溴-2’-脫氧核苷尿嘧啶(BrdU) (Invitrogen公司，卡 爾斯巴德，加利福尼亞)對人類間充質干細胞進行培育。對所述的細胞進行固定并且針對 5_溴-2’-脫氧核苷尿嘧啶(BrdU) (Invitrogen公司)進行免疫染色。在隨機選擇的區域 內對多于50個的細胞進行三次計數。MM作為一種細胞周期進行的標記物，對于在人類間充質干細胞中的5-溴-2’ -脫氧 核苷尿嘧啶的導入進行測量(附圖2)。將細胞接種在柔軟的凝膠、堅硬的凝膠或者玻璃表 面之上，上述所有的表面均利用1型膠原質以及纖維粘連蛋白進行了覆蓋。作為對照，同樣 制備了存在于玻璃表面之上的密集的細胞。正如所預料到的，被稀松的接種在玻璃表面之 上的人類間充質干細胞有效的進行了 5-溴-2’ -脫氧核苷尿嘧啶的導入，這表明著高水平 的增殖作用。當細胞密集在玻璃表面上時，由于接觸抑制作用，非常少的人類間充質干細胞 進行了 5-溴-2’ -脫氧核苷尿嘧啶的導入。存在于堅硬的凝膠之上的42%的人類間充質 干細胞進行了 5-溴-2’-脫氧核苷尿嘧啶的導入，這表面一個大的細胞種群進行了增殖，盡 管其顯著的小于被稀松的接種在一種玻璃表面之上的細胞的種群。在另外一方面，存在于柔軟的凝膠之上的人類間充質干細胞沒有進行5-溴-2’ _脫氧核苷尿嘧啶的導入，即使所 述的細胞是可以存活的，其中所述的可以存活是通過缺乏臺盼蘭(Trypan Blue)染色來進 行評價的。進一步的，對存在于基質上的稀松接種的人類間充質干細胞所進行的持續培育 產生了一種不同的細胞密度，這取決于所述的基質所具有的硬度，在更為堅硬的基質上具 有更高的密度。因此，柔軟的基質能夠抑制人類間充質干細胞的增殖作用，即使是在有血清存在 的情況下。實施例4 存在干柔軟的凝膠之上的人類間充質干細胞有能力分化成為脂肪細胞材料以及試驗方法脂肪細胞分化作用的研究將來自于細胞懸浮液中的人類間充質干細胞以3. 5xl04個細胞/孔的密度接種在 96孔組織培養板上，其中所述的96孔組織培養板利用1型膠原質加上纖維粘連蛋白進行 了覆蓋。在含有10%的胎兒小牛血清(FCS)的DMEM(生長培養基，“GM”)中對所述的細胞 進行24小時的培養之后，通過在脂肪形成性誘導培養基(AIM)(生長培養基，1微摩地塞米 松，200微摩茚甲新，10微克/毫升胰島素，以及0. 5毫摩甲基異丁基黃嘌呤)中進行3天 (2個細胞周期)的培養并且之后將其保持在脂肪形成性保持培養基(生長培養基，10微 克/毫升胰島素)中的方式，對所述的細胞進行誘導，使其分化成為脂肪細胞。在將其轉 至脂肪形成性誘導培養基中的8天之后，可以通過油紅0染色(Sigma-AldriCh，St. Louis, M0)或者通過使用抗過氧化物酶體增殖物激活受體y2(PPARY2)抗體針對過氧化物酶體 增殖物激活受體y2(PPARY2)進行的免疫染色的方式對脂肪細胞的分化作用進行評價。 在隨機選擇的區域內對多于50個的細胞進行三次計數。抗過氧化物酶體增殖物激活受體 y 2 (PPAR y 2)抗體是由賓夕法尼亞大學的Mitchell A. Lazar教授提供的。結果
為了對存在于柔軟的凝膠之上的人類間充質干細胞的存活能力進行證實，通過 兩種方式對所述的人類間充質干細胞分化成為脂肪細胞的能力進行測定；(a)過氧化物酶 體增殖物激活受體y2(PPARY2)的免疫染色，其中所述的過氧化物酶體增殖物激活受體 y2(PPARy2)是脂肪形成中的一種關鍵的轉錄因子，以及(b)油紅0-染色，用來測量脂質 體的積累。當使用一種存在于含有胎兒小牛血清的培養基中的地塞米松、茚甲新、3-異丁 基-1-甲基-黃嘌呤以及胰島素的混合物對存在于一種玻璃表面之上的密集的人類間充質 干細胞進行誘導使其進行脂肪細胞的分化作用時，大約有40%的細胞表現出一種脂肪細胞 表現型(附圖3A)。與之形成對照，在柔軟的凝膠上進行誘導作用，所述的分化率達到超過 80%，顯著的高于在玻璃上的分化率；當不進行誘導作用時，沒有觀察到脂肪細胞的分化作 用。進一步的，被稀松的接種在玻璃之上的人類間充質干細胞表現出一種高水平的增殖作 用(附圖2)并且沒有分化成為脂肪細胞(附圖3B)。這些結果進一步的表明人類間充質干 細胞可能需要離開所述的細胞周期，這是進行終末分化作用的一個先決條件。因此，被稀松的接種在柔軟的凝膠之上的人類間充質干細胞是完全可以存活的并 且有能力進行脂肪細胞的分化作用。實施例5 被接種在堅硬的凝膠或者柔軟的凝膠之上的星形細胞中的絲狀肌動蛋 白結構
為了對所述細胞對基質硬度所產生的應答進行進一步的定義以及量化，同樣測試 了所述的細胞外物質所具有的硬度對星形細胞中的絲狀肌動蛋白結構所產生的影響。首先 按照下述方法從Sprague-Dawley大鼠的晶胚中分離出星形細胞通過剖腹產手術從一個 定時懷孕(timed-pregnant)的Sprague-Dawley大鼠體內取出晶胚(E17-E19)并且除去 所述的皮質。在胰蛋白酶/脫氧核糖核酸酶中于37°C下對組織進行消化，離心(1000gx5 分鐘)，并且過濾，從而得到一種細胞懸浮液。為了獲得同時含有神經元以及神經膠質細 胞的培養物，將所述的細胞直接放置于底物之上。首先將星形細胞培養物保持進行14天 的培養，其中進行了一系列的胰蛋白酶化作用用以去除神經元。用在試驗中的培養物具有 大于98%的星形細胞，這是通過神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學試劑來確定 的。細胞在一個培養器中于37°C下以及含有5%的二氧化碳的貝科的改良Eagle的培養基 (Dulbecco’ s modified Eagle's medium)(百威泰克公司，東盧瑟福，新澤西州)中進行 7天的生長，其中在所述的培養基中補充有Ham’ s F12(Sigma公司)以及5%的胎牛血清 (Hyclone，Logan，UT)，在此之后在Neurobasal (Gibco，卡爾斯巴德，加利福尼亞)中又進行 了 5天的培養，其中在所述的Neurobasal中同樣補充有5 %的胎牛血清，2毫摩的L_谷氨 酸鹽，50微克/毫升的鏈霉素，以及50單位/毫升的盤尼西林。在有血清存在的條件下，在堅硬的聚丙烯酰胺凝膠(11千帕)或者柔軟的聚丙烯 酰胺凝膠(150帕)之上對所述的細胞進行48小時的培育，從而允許其進行粘附以及延展。 對細胞進行固定，并且利用鬼筆環肽對絲狀肌動蛋白的結構進行顯現。正如附圖4中所表 示的，在被放置于堅硬的凝膠之上的星形細胞中觀察到了應力纖維以及皮質絲狀肌動蛋 白。與之形成對照，在被放置于柔軟的凝膠之上的星形細胞中，不存在應力纖維并且僅僅觀 察到皮質肌動蛋白殼。因此，存在于柔軟的凝膠之上的星形細胞能夠對所述基質的彈性進 行感知并且因此不會呈現出應力纖維。實施例6 存在于柔軟的凝膠之上的星形細胞中的低水平的RH0三磷酸鳥苷 (GTP)-負載材料以及試驗方法Rhotekin 牽出試驗(pulldown assay)利用冰冷的Tris-緩沖鹽水對細胞進行洗滌并且將所述的細胞裂解于RIPA緩沖 液中(50毫摩的Tris，pH 7. 2，1%的TritonX-100，0. 5%的脫氧膽酸鈉，0. 的十二烷基 磺酸鈉，500毫摩的氯化鈉，10毫摩的氯化鎂，亮抑酶肽以及抑肽酶分別為10毫克/毫升， 以及1毫摩的苯甲基磺酰氯)。通過在4°C下于13000xg離心10分鐘，對所述的細胞裂解 液進行澄清，并且將同樣體積的裂解液于4°C下利用谷胱甘肽-S-轉移酶-Rhotekin結合 結構域(GST-RBD) (20毫克)珠進行45分鐘的培育。利用緩沖液B (Tris緩沖液，其中含有
的Triton X-100，150毫摩的氯化鈉，10毫摩的氯化鎂，亮抑酶肽以及抑肽酶分別為10 毫克/毫升，以及01毫摩的苯甲基磺酰氯)對所述的珠進行4次洗滌。使用一種抗RhoA的 單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)通過Western印跡對結合型Rho蛋白進行探測。 使用Alphalmager 系統(Alphalrmotech)進行密度計量學分析。為了對不同樣本中的Rho 活性(三磷酸鳥苷結合型Rho的水平)進行比較，所述的Rhotekin結合結構域(RBD)結合 型Rho的劑量被歸一化為存在于細胞裂解液中的所述Rho的總劑量。MM
為了確定在星形細胞中由柔軟的凝膠所誘導的應力纖維的缺失是否與Rho的滅 活作用有關，將星形細胞接種在具有各種不同硬度的聚丙烯酰胺凝膠之上并且在有血清 存在的條件下進行48小時的培育。制備細胞裂解液，并且使用純化的谷胱甘肽-S-轉移 酶-Rhotekin以及Rhotekin牽出試驗(pulldown assay)對Rho的三磷酸鳥苷(GTP)裝載 進行檢測。對三磷酸鳥苷結合型Rho與全部Rho的比例進行計算。存在于柔軟的凝膠之上 的星形細胞表現出一種低水平的三磷酸鳥苷結合型Rho (附圖5)，這表明存在于一種柔軟 的基質之上的星形細胞中的Rho活性的減弱能夠導致所述細胞中的應力纖維的缺失。實施例7 惡件黑素瘤細胞根據所沭的細胞外物質所具有的硬度來調節它們的延 顯材料以及試驗方法將M2細胞稀松的接種在具有各種不同硬度的基質之上，其中所述的基質利用1型 膠原質以及纖維粘連蛋白的混合物進行了覆蓋。經過24小時的培育之后，通過追蹤細胞的 邊界從而對細胞面積進行測量。在隨機選擇的區域內對多于30個的細胞進行三次計數。MM為了測試轉化細胞是否是依據所述的細胞外物質所具有的硬度來調節它們的行 為，在人類惡性黑素瘤細胞系中對所述的硬度對于細胞的延展所產生的作用進行測量，其 中所述的人類惡性黑素瘤細胞系被稱為M2細胞。正如附圖6中所表示的，M2細胞在較為 堅硬的底物之上呈現出了更大的尺寸。因此，轉化的M2細胞具有依據所述基質所具有的機 械性質來調節它們的行為(例如，細胞的延展)的能力。實施例8 在柔軟的凝膠之上的惡性黑素瘤細胞的劑量的減少為了確定所述的基質硬度對于所述的M2細胞種群的大小所產生的作用，將M2細 胞接種在柔軟的凝膠之上或者堅硬的凝膠之上(在每種凝膠之上接種的數量相同)并且利 用1型膠原質以及纖維粘連蛋白的混合物對其進行覆蓋。在有血清存在的條件下經過24小 時的培育之后，當存在于兩種凝膠之上的M2細胞完全發生了粘附并且進行了延展時，對所 述細胞對于每種底物的粘附效率進行評價。正如附圖7中所表示的，在柔軟的凝膠與堅硬 的凝膠之間，在粘附細胞的數量上不存在顯著的差異，這表明所述的基質硬度不能夠對M2 細胞的粘附性產生影響。在經過72小時的培育之后，盡管在每種底物上具有相同數量的細 胞發生了粘附(附圖7)，但是上述增加的48小時的培育在堅硬的凝膠之上產生了一個顯著 增大的細胞種群(附圖8)。在經過72小時的培育之后，在柔軟的凝膠與堅硬的凝膠之間， 在漂浮在所述培養基中的所述細胞的數量上沒有觀察到顯著的差異。這些結果進一步對用于量化人類間充質干細胞對柔軟的底物所產生的應答的方 法進行了論證。實施例9:在不減弱存活能力及自我再牛的是下，#用柔軟6爾疑膠X寸人類 間充質干細胞講行長期的保存材料以及試驗方法按照實施例1中所描述的方法，在玻璃蓋片上制備柔軟的聚丙烯酰胺凝膠，其中 所述的聚丙烯酰胺凝膠具有大約200帕的剪切模量(G’)，并且利用1型膠原質以及纖維粘 連蛋白的混合物對其進行了覆蓋。將聚丙烯酰胺凝膠放置于6孔培養板中，其中所述的6 孔培養板利用1 %的瓊脂糖凝膠進行了覆蓋，從而避免發生在聚丙烯酰胺凝膠或者玻璃蓋片之外的細胞粘附作用。將5xl04個處于2階段(passage 2)的人類間充質干細胞接種在 柔軟的聚丙烯酰胺凝膠之上或者直接接種在6孔組織培養板中，其中所述的6孔組織培養 板利用1型膠原質加上纖維粘連蛋白進行了覆蓋，并且將上述的人類間充質干細胞在補充 有10%的胎兒小牛血清(FCS)的DMEM中進行培育。將相同的人類間充質干細胞樣本懸浮 于DMEM中，并且依照傳統的方案(參見Gordon SL等人于2001年9月在Cryobiology《低 溫生物學》43(2) :182-7中發表的文章)使其在液態氮蒸汽中保持冷凍，其中在所述的DMEM 中含有10 %的胎兒小牛血清以及10 %的二甲基亞砜(DMS0)。在達到90 %的密集程度之后， 對那些被直接放置于組織培養板之上的細胞進行胰蛋白酶化并且以5xl04個細胞/孔的密 度將所述的細胞在新的6孔組織培養板中進行次級培養。將細胞保持在組織培養板之上直 至它們到達10階段(passage 10)。每7天使用新鮮的DMEM對存在于柔軟的聚丙烯酰胺凝 膠之上的細胞進行兩次重新喂養，其中所述的新鮮的DMEM中補充有10%的胎兒小牛血清。 當被保持在組織培養板中的人類間充質干細胞到達10階段(passage 10)時，將存儲在液 態氮蒸汽中的人類間充質干細胞進行解凍，從而生成一種細胞懸浮液。MM為了對以靜止的狀態在柔軟的凝膠中經過了長期保存的人類間充質干細胞的存 活能力進行確定，將人類間充質干細胞存儲于柔軟的凝膠之中直至被保持在組織培養板上 的人類間充質干細胞到達10階段(passage 10)。將這些細胞的存活能力與存儲在液態氮 蒸汽中的細胞的存活能力進行比較。對粘附在柔軟的凝膠之上或者組織培養板之上的細胞 進行胰蛋白酶化，同時將存儲在液態氮氣中的細胞進行解凍，從而生成一種細胞懸浮液。通 過對上述的細胞懸浮液進行臺盼蘭(Trypan Blue)染色來確定存活能力。因此，在柔軟的 凝膠中的存儲是保持所述的人類間充質干細胞的存活能力的一種有效的方式。為了對經過長期存儲的、在柔軟的凝膠上進行培育的人類間充質干細胞所具有的 增殖潛能進行測定，制備被保持在柔軟的凝膠之上的細胞、被保持在組織培養板之上的細 胞、或者在液態氮蒸汽中保持冷凍的細胞，并且通過下述方式進行5-溴-2’-脫氧核苷尿嘧 啶(BrdU)的導入檢測將來自于每一種來源的細胞重新放置于一種組織培養板上，并且在 有血清以及5-溴-2’ -脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)存在的條件下進行12小時的培育，其中所 述的組織培養板上利用1型膠原質加上纖維粘連蛋白進行了覆蓋。對細胞進行固定并且通 過利用抗5-溴-2’-脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)抗體(Invitrogen)對細胞進行培育的方式進 行針對5-溴-2’ -脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)的免疫染色。實施例10 在不減弱分化作用的前提下，使用柔軟的凝膠對人類間充質干細胞講 行長期的保存材料以及試驗方法成骨細胞分化作用檢測將到達10階段(passage 10)的人類間充質干細胞以103個細胞/孔的密度接種 在96孔組織培養板上，其中所述的96孔組織培養板利用1型膠原質加上纖維粘連蛋白進 行了覆蓋。將所述的細胞在生長培養基(GM)中進行24小時的培育之后，通過將所述的培 養基轉換為骨形成性誘導培養基(0IM)(生長培養基，50微摩的抗壞血酸-2-磷酸鹽，10毫 摩的P-磷酸甘油，以及100納摩的地塞米松)的方式對所述的細胞進行誘導，使其分化成 為成骨細胞，每三天對所述的培養基進行一次轉換，共持續3周。通過使用丙酮/檸檬酸鹽對所述的細胞進行固定并且利用固藍(Fast Blue)RR/萘酚(Sigma-Aldorich，Kit#85)針 對堿性磷酸酯酶的活性進行染色的方式，對成骨細胞分化作用進行評價。MM接下來，對以靜止的狀態在柔軟的凝膠中經過了長期保存的人類間充質干細胞的 分化潛能進行測定。對存儲于柔軟的凝膠之上或者組織培養板之上的人類間充質干細胞進 行胰蛋白酶化，從而制備生成的(generated)懸浮液；與此并行的，通過對冷凍保存在液態 氮氣中的人類間充質干細胞進行解凍的方式，制備細胞懸浮液。按照實施例4中所描述的 方法對脂肪細胞的分化作用進行評價。在另外的研究中，在將人類間充質干細胞直接培育在所述的柔軟的凝膠上之后， 對脂肪細胞的生成量進行測量，其中不先將所述的細胞放置于組織培養皿中并且不進行胰 蛋白酶化。在另外的研究中，對存在于細胞懸浮液中的蝕骨細胞的生成量進行測量，其中所 述的細胞懸浮液是通過柔軟的凝膠、組織培養板、或者冷凍保存來制備的。在另外的研究中，在將人類間充質干細胞直接培育在所述的柔軟的凝膠上之后， 對蝕骨細胞的生成量進行測量，其中不先將所述的細胞放置于組織培養皿中并且不進行胰 蛋白酶化。實施例11 在干細胞』的牛長調節中所渉及到的RH0-家族三磷酸鳥苷(GTP)結合 _、舶圓幾云滅舶碰，財戸斤誦i寸細材料以及試驗方法Rho家族檢測在玻璃蓋片上制備具有大約200帕的剪切模量(G’ )的聚丙烯酰胺凝膠(柔軟的 凝膠)以及具有大約7500帕的剪切模量的聚丙烯酰胺凝膠(堅硬的凝膠)，并且利用1型 膠原質以及纖維粘連蛋白的混合物對所述的凝膠以及蓋片進行了覆蓋。將聚丙烯酰胺凝膠 或者玻璃蓋片放置于6孔培養板中，其中所述的6孔培養板利用1 %的瓊脂糖凝膠進行了覆 蓋，從而避免發生在聚丙烯酰胺凝膠或者玻璃蓋片之外的細胞粘附作用。將5xl04個人類間 充質干細胞接種在聚丙烯酰胺凝膠之上或者玻璃蓋片之上，之后在有血清存在的條件下對 其進行24小時的培育。使所述的細胞進行牽出試驗(pull-down assay)，從而對Rho、Rac 以及Cdc42的三磷酸鳥苷(GTP)裝載水平進行調查，其中所述的調查是通過使用它們的活 化作用檢測試劑盒(Upstate Biotech, Charlottesville, VA)來進行的。利用顯性負性形式的Rho或者組成性激活形式的Rho進行的細胞轉染從一個大鼠肝臟cDNA文庫中克隆用于所述的候選Rho三磷酸鳥苷酸酶(GTPase) 的cDNA，并且引入一種突變，其中所述的突變能夠生成顯性負性(D/N)形式或者組成性激 活(C/A)形式的Rho蛋白(參見Qui RG等人于1995年12月5日在ProcNatl Acad Sci USA《美國科學院院刊》92(25) :11781-5中發表的文章；Lu X等人于1996年12月1日在 Curr Biol.《當代生物學》6(12) 1677-84中發表的文章)，并且在每一個cDNA中加入一個 編碼myc標簽的序列。表達突變的Rho家族蛋白的重組腺病毒被得以建立并且所述的重組 腺病毒被用來在人類間充質干細胞中對所述的突變蛋白進行過表達。MM為了進一步的研究所述的Rho-家族蛋白在對關于所述的細胞外物質的信息進行傳遞時所起到的作用，在間充質干細胞中對Rho_家族蛋白的活動性進行了檢測，其中所述 的間充質干細胞是生長在柔軟的凝膠或者堅硬的凝膠中的。對在這些信號的傳遞過程中所 涉及到的其他的Rho_家族蛋白進行了識別。在另外的試驗中，在人類間充質干細胞中，對所述的感興趣的顯性負性(D/N)形 式或者組成性激活(C/A)形式的Rho-家族蛋白進行了過表達。將表達LacZ的重組腺病毒 作為一種負性對照來進行使用。制備來自于柔軟的凝膠、堅硬的凝膠、或者玻璃蓋片上的人 類間充質干細胞，進行24小時的培育，之后保持不對其進行感染，或者利用腺病毒對其進 行感染，其中所述的腺病毒表達LacZ或者Rho-家族蛋白的突變形式。在經過36小時的 培育之后，向所述的培養基中加入5-溴-2’ -脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)，并且在含有血清的 培養基中對所述的細胞再進行12小時的培育，之后進行固定并且使用抗-myc抗體(Cell SignalingTechnology, Danvers，MA)以及抗 _5_ 溴-2，-脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)抗體 (Invitrogen, Carlsbad, CA)同時針對myc-標簽以及5-溴-2，-脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)進 行免疫染色。對未經感染的細胞以及利用LacZ腺病毒進行感染的細胞中對5-溴-2’ -脫 氧核苷尿嘧啶(BrdU)染色呈陽性的所述細胞的數量進行比較，利用上述的比較來證實腺 病毒感染本身不會對所述的人類間充質干細胞的生長產生影響。將對5-溴-2’-脫氧核苷 尿嘧啶(BrdU)的導入呈陽性的所述細胞的數量與對myc-標簽染色呈陽性的所述細胞的數 量進行比較。組成性激活(C/A)形式以及顯性負性(D/N)形式的Rho-家族蛋白分別對由 柔軟基質誘導的生長停止或者由剛硬基質誘導的生長促進所產生的去調節作用，證明了所 述的過表達的Rho-家族蛋白參與了對人類間充質干細胞的生長調節，這種調節是通過基 質硬度來實現的。實施例12 確定肌動球蛋白在干細胞的生長調節中所起到的作用，其中所述的調為了對肌動球蛋白在人類間充質干細胞的生長調節中所起到的作用進行研究，其 中所述的人類間充質干細胞生長在柔軟的凝膠之上，并且并未分化成為具體的細胞譜系， 將所述的人類間充質干細胞接種在玻璃蓋片上，所述的玻璃蓋片利用1型膠原質以及纖維 粘連蛋白的混合物進行了 24小時的覆蓋，之后，在存在或者不存在20毫摩2，3- 丁二酮 月虧(BDM)、100微摩blebbistatin或者0. 25微摩/毫升細胞松弛素D (CD)的條件下，利用 5_溴-2’-脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)對所述的細胞再進行12小時的培育。在所述試驗的全 部過程中，細胞是在有血清存在的條件下進行培育的。在經過所述的培育之后，對細胞進行 固定并且進行針對5-溴-2’ -脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)的免疫染色。對由丁二酮肟(BDM) 或者blebbistatin對肌球蛋白II所形成的抑制作用對人類間充質干細胞的生長所產生的 影響進行評價，或者對由細胞松弛素D (CD)對肌動蛋白纖維絲所形成的破壞作用對人類間 充質干細胞的生長所產生的影響進行評價。實施例13 人類間充質干細胞在柔軟的三維纖維蛋白凝膠中的生長以及分化作用。材料以及試驗方法纖維蛋白凝膠的制備以及接種在水中使鮭魚纖維蛋白原(Searun Holdings, Freeport, ME)進行重新水合并且 在pH為7. 4的50毫摩的Tris、150毫摩的氯化鈉中將其稀釋至3毫克/毫升(對于柔軟的凝膠而言)或者18毫克/毫升(對于堅硬的凝膠而言)，在組織培養孔中，使用2單位/ 毫升的魚凝血酶(Searim Holdings)對400微升(yl)等份的稀釋液進行聚合。通過3毫 克/毫升以及18毫克/毫升的纖維蛋白原所制備得到的所述的鮭魚纖維蛋白凝膠所具有 的硬度分別為250帕以及2150帕。在進行聚合之前，在含有10%的胎兒小牛血清(FCS)的 DMEM中將104個人類間充質干細胞與纖維蛋白原溶液進行混合，所述的細胞在其中進行24 小時的培育。MM在有血清以及5-溴-2’-脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)存在的條件下，對所述的細胞再 進行12小時的培育，在此之后對其進行固定并且針對5-溴-2’ -脫氧核苷尿嘧啶(BrdU) 的導入進行免疫染色，通過上述方法對對于存在于柔軟的以及堅硬的纖維蛋白凝膠之中的 間充質干細胞的增殖作用所進行的分析來進行評價。通過脂肪細胞分化作用的效率對存在于纖維蛋白凝膠之中的人類間充質 干細胞的分化潛能進行評價，通過將所述的培養基轉換為脂肪形成性誘導培養基 (“AIM"DMEM+10%胎牛血清(FBS)，1毫摩(mcM)地塞米松，200毫摩茚甲新，10毫克(meg)/ 毫升胰島素，以及0. 5毫摩甲基異丁基黃嘌呤)并保持3天的方式，對存在于纖維蛋白凝 膠之中的間充質干細胞進行誘導，使其分化成為脂肪細胞，之后將所述的細胞保持在脂肪 形成性保持培養基中(生長培養基，10毫克/毫升胰島素)。在將其轉至脂肪形成性誘導 培養基中的8天之后，可以通過油紅0染色或者通過使用抗過氧化物酶體增殖物激活受體 Y 2 (PPAR y 2)抗體免疫染色的方式對脂肪細胞的分化作用進行評價。對存在于柔軟的纖維 蛋白凝膠和存在于堅硬的纖維蛋白凝膠中的、對于油紅0染色或者過氧化物酶體增殖物激 活受體y2(PPARY2)染色呈陽性的細胞的百分比進行比較。在其他的試驗中，向所述的基質中加入蛋白酶抑制劑，從而對蛋白水解性降解作 用或者由所述細胞產生的其他活性重建進行防止或者抑制。實施例14 本發明中所述的人類間充質干細胞在維持造血干細胞的存活能力中 的用涂將到達10階段(passage 10)的間充質干細胞懸浮液以103個細胞/孔的密度接 種在96孔組織培養板上，其中所述的96孔組織培養板利用1型膠原質加上纖維粘連蛋白 進行了覆蓋。按照上述實施例中所描述的方法，將所述的細胞在生長培養基(GM)中進行24 小時的培育之后，在有柔軟的凝膠或者基質存在的條件下對所述的細胞進行培養。之后將 上述得到的間充質干細胞培養物加入造血干細胞培養物之中，用以對后者細胞的存活能力 進行維持。在另外的研究中，直接在所述的柔軟的凝膠之上對人類間充質干細胞進行培育， 而不先將所述的細胞放置于組織培養皿中并且不進行胰蛋白酶化。已經結合相應的附圖對本發明優選的實施方式進行了說明，本領域技術人員應當 理解本發明不應被局限在這些具體的描述中，在不脫離所附權利要求書定義的本發明范圍 和精神的條件下，本發明可以進行各種各樣的改變和修飾。
4權利要求
一種制造包覆的聚丙烯酰胺凝膠的方法，其中所述的聚丙烯酰胺凝膠具有在150-750帕(Pa)的范圍內的硬度，所述的方法包括使一種組合物發生聚合的步驟，其中所述的組合物包括丙烯酰胺和雙丙烯酰胺，所述組合物具有的丙烯酰胺雙丙烯酰胺的混合比率在100∶1到30∶1之間，并且用一種組合物包覆所述柔軟的聚丙烯酰胺凝膠，所述組合物包括一種I型膠原蛋白和一種纖維結合蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述凝膠是一種二維凝膠。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述凝膠進一步包括一種血清，所述血清選自由 胎牛血清、小牛血清和馬血清所組成的組中。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述凝膠進一步包括一種蛋白酶抑制劑。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述包括丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的組合物具有 的總丙烯酰胺濃度為3-5%。
6.一種制造纖維蛋白基質的方法，其中所述的纖維蛋白基質具有在0. 1-2. 5千帕 (KPa)的范圍內的硬度，所述的方法包括使一種組合物發生聚合的步驟，其中所述的組合物 包括纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白，從而制造出一種柔軟的纖維蛋白基質，其中存在于所 述柔軟的纖維蛋白基質中的所述纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白的濃度為1-20毫克/毫升， 并且利用一種包括粘附蛋白的組合物對所述的柔軟的纖維蛋白基質進行了包覆。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述粘附蛋白是一種I型膠原蛋白或者纖維結合 蛋白。
8.根據權利要求6所述的方法，其中，所述基質進一步包括胎牛血清。
9.根據權利要求6所述的方法，其中，所述基質進一步包括一種蛋白酶抑制劑。
10.根據權利要求6所述的方法，其中，所述基質是一種三維基質。
11.根據權利要求6所述的方法，其中，所述纖維蛋白或者纖維原蛋白是異溫動物的纖 維蛋白或者纖維蛋白原蛋白。
12.—種保存間充質干細胞種群的方法，所述方法包括在一種凝膠基質中培養所述間 充質干細胞種群的步驟，所述凝膠基質具有的剛性在0. 1-2. 5千帕范圍內。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述的間充質干細胞種群的端粒酶長度是保 持不變的。
14.根據權利要求12所述的方法，其中，所述的間充質干細胞種群被保持在一種靜止 的狀態。
15.根據權利要求12所述的方法，其中，所述間充質干細胞種群保持有分化成一種細 胞型的能力，所述細胞型選自由脂肪細胞或者成骨細胞所組成的組中。
16.根據權利要求12所述的方法，其中，所述凝膠或者基質包括一種丙烯酰胺。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述凝膠或者基質具有的丙烯酰胺雙丙烯 酰胺混合比率在100 1到30 1之間。
18.根據權利要求16所述的方法，其中，所述凝膠或者基質具有的總丙烯酰胺濃度為 3% -5%。
19.根據權利要求12所述的方法，其中，所述凝膠或者基質包括一種纖維蛋白或者纖 維蛋白原蛋白質。
20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述凝膠或者基質中纖維蛋白或者纖維原蛋白的濃度時3-10毫克/毫升。
21.根據權利要求19所述的方法，其中，所述纖維蛋白或者纖維原蛋白是一種異溫動 物的纖維蛋白或者纖維原蛋白。
22.根據權利要求12所述的方法，其中，所述凝膠或者基質是一種二維凝膠或者基質。
23.根據權利要求12所述的方法，其中，所述凝膠或者基質是一種三維凝膠或者基質。
24.根據權利要求12所述的方法，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種血清，所述 血清選自由胎牛血清、小牛血清和馬血清所組成的組中。
25.根據權利要求12所述的方法，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種蛋白酶抑 制劑。
26.根據權利要求12所述的方法，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種粘附蛋白。
27.根據權利要求12所述的方法，其中，所述粘附蛋白是一種I型膠原蛋白、一種纖維 結合蛋白或者他們的結合物。
28.根據權利要求12所述的方法，其中，所述間充質干細胞種群是一種成人間充質干 細胞種群。
29.根據權利要求12所述的方法，其中，所述間充質干細胞種群是一種人類間充質干 細胞種群。
30.根據權利要求12所述的方法，其中，所述培養步驟進行至少5天的時間。
31.根據權利要求12所述的方法，其中，所述培養步驟進行至少60天的時間。
32.根據權利要求12所述的方法，其中，在一種凝膠或者基質之中對所述的間充質干 細胞種群進行培養的步驟之前，進行下述步驟在一種組織培養儀器中對所述的間充質干 細胞進行培養。
33.根據權利要求12所述的方法，其中，所述培養步驟在從生物學樣本中分離、純化或 者富集所述間充質干細胞種群之后直接進行。
34.根據權利要求12所述的方法，進一步包括隨后在一種組織培養儀器中涂布所述間 充質干細胞種群的步驟。
35.一種誘導間充質干細胞種群分化成脂肪細胞種群的方法，所述方法包括在一種儀 器參與的情況下培養所述間充質干細胞種群的方法，所述儀器包括(a) —種凝膠或者基 質，所述凝膠或者基質具有的剛性在150-750帕范圍內，和(b) —種脂肪細胞誘導培養基， 從而誘導間充質干細胞種群分化成所關心的細胞型。
36.根據權利要求35所述的方法，其中，所述凝膠或者基質包括一種丙烯酰胺。
37.根據權利要求36所述的方法，其中，所述凝膠或者基質具有的丙烯酰胺雙丙烯 酰胺混合比率在100 1到30 1的范圍內。
38.根據權利要求36所述的方法，其中，所述凝膠或者基質具有的總丙烯酰胺濃度為 3-5%。
39.根據權利要求35所述的方法，其中，所述凝膠或者基質包括一種纖維蛋白或者纖 維蛋白原蛋白質。
40.根據權利要求39所述的方法，其中，所述凝膠或者基質中纖維蛋白或者纖維原蛋 白的濃度時3-10毫克/毫升。
41.根據權利要求39所述的方法，其中，所述纖維蛋白或者纖維原蛋白是一種異溫動物的纖維蛋白或者纖維原蛋白。
42.根據權利要求35所述的方法，其中，所述凝膠或者基質是一種二維凝膠或者基質。
43.根據權利要求35所述的方法，其中，所述凝膠或者基質是一種三維凝膠或者基質。
44.根據權利要求35所述的方法，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種血清，所述 血清選自由胎牛血清、小牛血清和馬血清所組成的組中。
45.根據權利要求35所述的方法，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種蛋白酶抑 制劑。
46.根據權利要求35所述的方法，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種粘附蛋白。
47.根據權利要求46所述的方法，其中，所述粘附蛋白是一種I型膠原蛋白、一種纖維 結合蛋白或者他們的結合物。
48.根據權利要求35所述的方法，其中，所述間充質干細胞種群是一種成人間充質干 細胞種群。
49.根據權利要求35所述的方法，其中，所述間充質干細胞種群是一種人類間充質干 細胞種群。
50.根據權利要求35所述的方法，其中，所述培養步驟進行至少3天的時間。
51.根據權利要求35所述的方法，進一步包括在有一種儀器參與的情況下培養所述間 充質干細胞的步驟，所述儀器包括(a)所述凝膠或者基質，和(b) —種產生脂肪的維持液。
52.根據權利要求35所述的方法，其中，所述培養步驟至少進行5天的時間。
53.根據權利要求35所述的方法，其中，在一種凝膠或者基質之中對所述的間充質干 細胞種群進行培養的步驟之前，進行下述步驟在一種組織培養儀器中對所述的間充質干 細胞進行培養。
54.根據權利要求35所述的方法，其中，所述培養步驟在從生物學樣本中分離、純化或 者富集所述間充質干細胞種群之后直接進行。
55.一種用于調節間充質干細胞生長的儀器，所述儀器包括一種凝膠基質，所述凝膠 基質具有的剛性在150-750帕范圍內；和一種誘導培養基，其中，所述凝膠或者基質包覆有 一種I型膠原蛋白、一種纖維結合蛋白或者他們的結合物。
56.根據權利要求55所述的儀器，其中，所述凝膠由丙烯酰胺-雙丙烯酰胺混合物組成。
57.根據權利要求56所述的儀器，其中，所述凝膠或者基質具有的丙烯酰胺雙丙烯 酰胺混合比率在100 1到30 1的范圍內。
58.根據權利要求56所述的儀器，其中，所述凝膠或者基質具有的總丙烯酰胺濃度為 3-5%。
59.根據權利要求55所述的儀器，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種膠凝劑。
60.根據權利要求59所述的儀器，其中，所述凝膠劑是一種重組纖維蛋白或者纖維原蛋白。
61.根據權利要求60所述的儀器，其中，所述凝膠或者基質中纖維蛋白或者纖維原蛋 白的濃度時3-10毫克/毫升。
62.根據權利要求60所述的儀器，其中，所述纖維蛋白或者纖維原蛋白是一種異溫動 物的纖維蛋白或者纖維原蛋白。
63.根據權利要求55所述的儀器，其中，所述凝膠或者基質是一種二維凝膠或者基質。
64.根據權利要求55所述的儀器，其中，所述凝膠或者基質是一種三維凝膠或者基質。
65.根據權利要求55所述的儀器，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種血清，所述 血清選自由牛血清和馬血清所組成的組中。
66.根據權利要求55所述的儀器，其中，所述誘導培養基是一種adipocye誘導培養基 或者一種成骨細胞誘導培養基。
67.根據權利要求55所述的儀器，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種蛋白酶抑 制劑。
68.一種凝膠基質，包括一種凝膠劑和一種丙烯酰胺-雙丙烯酰胺混合物，其中所述凝 膠基質上包覆有一種I型膠原蛋白、一種纖維結合蛋白、或者他們的結合物，并且具有的剛 性在150-750帕的范圍內。
69.根據權利要求68所述的凝膠基質，其中，所述凝膠基質具有的丙烯酰胺雙丙烯 酰胺混合比率在100 1到30 1之間。
70.根據權利要求68所述的凝膠基質，其中，所述凝膠基質具有的總丙烯酰胺濃度為 3-5%。
71.根據權利要求68所述的凝膠基質，其中，所述凝膠劑是一種重組纖維蛋白或者纖 維原蛋白。
72.根據權利要求71所述的凝膠基質，其中，所述凝膠基質中存在的重組纖維蛋白或 者纖維原蛋白的濃度是3-10毫克/毫升。
73.根據權利要求71所述的凝膠基質，其中，所述重組纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白 是異溫動物的纖維蛋白或者纖維原蛋白。
74.根據權利要求68所述的凝膠基質，其中，所述凝膠或者基質是一種二維凝膠或者 基質。
75.根據權利要求68所述的凝膠基質，其中，所述凝膠或者基質是一種三維凝膠或者基質。
76.根據權利要求68所述的凝膠基質，其中，所述凝膠基質進一步包括一種牛血清或者一種馬血清。
77.根據權利要求68所述的凝膠基質，其中，所述凝膠基質進一步包括一種蛋白酶抑 制劑。
78.—種調節間充質干細胞發育的方法，包括將間充質干細胞懸浮在一種凝膠基質中 的步驟，所述凝膠基質包括一種凝膠劑，其中，所述凝膠基質包覆有一種I型膠原蛋白、一 種纖維結合蛋白、或者他們的結合物，其中，所述的凝膠基質被保持在一種預先確定的硬度 下；以及將所述的凝膠基質暴露在一種生長調節因子之中。
79.根據權利要求78所述的方法，其中，所述生長調節因素是一種物理因素、一種化學 因素、或者他們的結合。
80.根據權利要求79所述的方法，其中，所述物理因素是壓力、溫度或者他們的結合。
81.根據權利要求79所述的方法，其中，所述凝膠基質進一步包括，所述化學因素是誘 導培養基。
82.根據權利要求81所述的方法，其中，所述誘導培養基是一種adipocye誘導培養基或者成骨細胞誘導培養基。82.根據權利要求78所述的方法，其中，所述暴露于化學因素或者物理因素會導致所 述凝膠基質硬度的增加。
83.根據權利要求82所述的方法，其中，增加所述的凝膠基質所具有的硬度使之與所 述的間充質干細胞分化成的所述微環境中的細胞外物質(ECM)所具有的硬度相符合。
84.根據權利要求78所述的方法，其中，所述凝膠基質是一種丙烯酰胺/雙丙烯酰胺混 合物，具有的比例在大約100 1到30 1之間。
85.根據權利要求84所述的方法，其中，所述凝膠基質具有的總丙烯酰胺濃度為 3-5%。
86.根據權利要求78所述的方法，其中，所述凝膠劑是一種重組纖維蛋白或者纖維蛋 白原蛋白。
87.根據權利要求86所述的方法，其中，所述凝膠基質中存在的重組纖維蛋白或者纖 維原蛋白的濃度是1-20毫克/毫升。
88.根據權利要求87所述的方法，其中，所述重組纖維蛋白或者纖維蛋白原蛋白是異 溫動物的纖維蛋白或者纖維原蛋白。
89.根據權利要求78所述的方法，其中，所述凝膠或者基質是一種二維凝膠基質。
90.根據權利要求78所述的方法，其中，所述凝膠或者基質是一種三維凝膠基質。
91.根據權利要求78所述的凝膠基質，其中，所述凝膠基質進一步包括一種血清，所述 血清選自由牛血清或者馬血清所組成的組中。
92.根據權利要求78所述的凝膠基質，其中，所述凝膠或者基質進一步包括一種蛋白 酶抑制劑。
93.根據權利要求78所述的方法，其中，所述凝膠基質具有的硬度在大約0.1到2. 5千 帕范圍內。
94.根據權利要求78所述的方法，其中，所述凝膠基質進一步包括一種粘附蛋白。
95.根據權利要求78所述的方法，其中，所述凝膠基質是一種纖維結合蛋白/膠原蛋白 混合物。
96.根據權利要求95所述的方法，其中，所述纖維結合蛋白/膠原蛋白的比率大約是 5 I0
97.一種在體外誘導或者維持成體干細胞的靜止狀態并且保持成體干細胞的生物學活 性的方法，包括將所述的成體干細胞與一種凝膠基質進行接觸，其中所述的凝膠基質中包 括一種細胞外物質，所述細胞外物質能夠與存在于所述的成體干細胞的膜上的整聯蛋白發 生結合，所述的凝膠基質所具有的彈性與同樣類型的體內成體干細胞的主要體內生物學微 環境所具有的彈性在本質上是類似的；并且向所述的成體干細胞提供營養物質，用以在體 外維持所述成體干細胞的生物學活性。
98.根據權利要求97所述的方法，其中，所述成體干細胞是一種間充質干細胞(MSC)。
99.根據權利要求97所述的方法，其中，所述成體干細胞選自由來自于骨髓的間充質 成體干細胞(MSC)，腎臟干細胞，來自于肝臟的干細胞，來自于骨骼肌的間充質成體干細胞， 來自于骨頭的間充質成體干細胞，牙髓間充質成體干細胞，來自于心肌的間充質成體干細 胞，來自于滑液的間充質成體干細胞，或者臍帶間充質成體干細胞所組成的組中。
100.根據權利要求97所述的方法，其中，在接觸之間，所述成體干細胞不處于靜止狀態。
101.體外誘導權利要求97所述的成體干細胞的增殖作用的方法，包括將成體干細胞 與一種增殖誘導材料進行體外接觸的步驟，所述增殖誘導材料包括一種凝膠基質，所述凝 膠基質與存在于所述成體干細胞表面上的整聯蛋白發生連接，所述凝膠基質具有的彈性小 于存在于體內生物學微環境中成體干細胞所具有的彈性；以及向所述的成體干細胞提供營 養物質，用以體外促進所述的成體干細胞及其子代的增值作用并維持所述的成體干細胞及 其子代的生物學活性。
102.根據權利要求101所述的方法，其中，所述的增殖誘導物質對于所述的成體干細 胞所產生的表觀彈性小于在一種體內成體干細胞的生物學微環境中存在的主要體內物質 所具有的彈性的大約0. 4至0. 5倍，其中所述的體內成體干細胞與所述的成體干細胞是相 同類型的。
103.一種用于在權利要求97所述的成體干細胞中誘導體外分化作用的方法，包括下 述步驟將所述的成體干細胞與一種分化物質進行接觸，其中所述的分化物質中包括化學 刺激，所選擇的化學刺激能夠刺激所述的成體干細胞的分化作用，使其分化成為一種預先 確定的細胞類型；以及向所述的分化細胞提供一種分化細胞營養物質，用以保持所述的分 化細胞的生物學活性。
104.根據權利要求103所述的方法，其中所述的成體干細胞是一種來源于人類骨髓 的間充質干細胞，并且其中所述的分化細胞是一種成骨細胞，軟骨細胞，肌細胞，脂肪細胞， β-胰島細胞，神經元細胞或者結締組織細胞。
105.一種誘導或者維持在靜止狀態并保持生物活性的成體干細胞，如權利要求97、 78、或者12中任意一項所述。
106.根據權利要求105所述的成體干細胞，其中，所述細胞是一種間充質干細胞 (MSC)。
107.根據權利要求106所述的成體干細胞，其中，所述間充質干細胞是骨髓的間充質 成體干細胞(MSC)，腎臟干細胞，來自于肝臟的干細胞，來自于骨骼肌的間充質成體干細胞， 來自于骨頭的間充質成體干細胞，牙髓間充質成體干細胞，來自于心肌的間充質成體干細 胞，來自于滑液的間充質成體干細胞，或者臍帶間充質成體干細胞。
全文摘要
本發明提供了具有在150-750帕(Pa)的范圍內的硬度的凝膠以及基質，制造上述凝膠以及基質的方法，以及保存間充質干細胞種群或者研究間充質干細胞的方法，其中在所述的方法中包括上述的凝膠以及基質。
文檔編號A61K9/14GK101855337SQ200880104932
公開日2010年10月6日 申請日期2008年6月30日 優先權日2007年6月29日
發明者J·溫內爾, P·A·簡梅, 船木真理 申請人:船木真理