免疫調節性小細胞及使用方法

免疫調節性小細胞及使用方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請根據35U.S.C. § 119(e)要求2012年10月2日遞交的美國臨時申請第 61/709102號的優先權，其通過引用整體明確地并入本文中。
[0003] 序列表引用
[0004] 本申請連同電子形式的序列表一起遞交。序列表提供為2013年10月2日生成、 大小20Kb、標題SEQLISTING. TXT的文件。電子形式序列表的信息通過引用整體并入本文 中。
[0005] 發明背景
技術領域
[0006] 本申請涉及用于治療疾病如膀胱癌和其他惡性腫瘤的免疫調節性真細菌小細胞 的組合物及制備、純化、配制和使用方法。
[0007] 相關領域的描沐
[0008] 提供了本發明背景的以下描述以幫助理解本發明，但并非承認其描述或構成了本 發明的現有技術。本申請中提及或敘述的文章、專利和專利申請及所有其他文件和可電子 獲取的信息的內容，均通過引用整體并入本文中，其程度就像明確和單獨地指出通過引用 并入每個單獨的出版物。申請人保留從任何這樣的文章、專利、專利申請或其他文件實際并 入任何和所有材料和信息至本申請的權利。
[0009] 已熟知免疫系統在預防癌癥中起重要作用。越來越清楚免疫調節可能是癌 癥治療的具吸引力的治療方式。使用最久的市售抗癌免疫調節治療劑為牛分枝桿菌 (Mycobacterial bovis)、卡介苗（BCG)的活的減毒菌株，其被用作非肌肉侵入性膀胱癌治 療的術后輔助治療。其他非市售實驗性抗癌免疫調節方法包括使用細菌的其他活的減毒物 種，如鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、雙歧桿菌（Bifidobasterial)、單核細 胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes)、釀胺鏈球菌（Streptococcus pyrogenes)、 粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)、諾維氏梭菌（Clostridium novyi)、豬霍亂沙門氏 菌（Salmonella choleraesius)和霍亂弧菌（Vibrio cholera)。雖然在某種程度上有效， 使用的每種菌株受到感染風險、害怕活的減毒菌株遺傳回復至致病性以及敗血癥的限制。 所有這些方法均出現了在最有效劑量或接近最有效劑量時發生的具毒性活細菌感染的極 大毒性回復。這造成了每種菌株類型的較窄的治療指數。
[0010] 為了解決活細菌作為免疫調節治療的毒性問題，其他人已嘗試使用不同的細菌組 分（與完整的活生物體相反）來產生相同的免疫效應。這種類型的實驗性治療劑包括：純 化的細菌毒素、純化的促炎性脂多糖（LPS)、純化的磷壁酸（TCA)和其他細菌細胞壁制劑， 以及其他細菌亞細胞級分。這些方法改善了毒性特性，但在一些情況下伴隨功效的損失。另 外，許多僅刺激極化免疫反應（Thl或Th2)，大多數刺激Th2 (產生抗體的）反應。有文獻 合理而充分記載的是，Thl (細胞免疫反應）反應看起來對具有抗腫瘤免疫調節效應是優先 的。最后，這些制劑可能很難以支持市場需求的規模和質量制備，并且最終僅可生成不能產 生抗腫瘤效應的免疫反應子集。在用于治療大多數癌癥的蛋白毒素的情況下，蛋白毒素的 功效由于對正常組織具有毒性而明顯受限。另外，有助于系統性暴露水平的藥物代謝動力 學（PK)參數，通常不被且不能被完全優化以同時最大化抗腫瘤活性和最小化副作用，特別 是當相同的細胞靶標或機制負責抗腫瘤活性和正常組織毒性時。再次地，這引起對大多數 蛋白毒素共有的非常窄的治療指數。
[0011] 除了作為免疫調節"通用物"的活的細菌載體和細菌組分外，其他研宄者已嘗試開 發不同的、特異性的Thl免疫調節性細胞因子和趨化因子作為抗癌治療劑。實例包括但不 限于：干擾素 γ (IFN-Y)、干擾素 α (IFN-α)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF)、月中 瘤壞死因子a (TNF- α )、白介素-2 (IL-2)、白介素-12 (IL-12)和白介素-18 (IL-18)。這些 方法中的每種受限于預期不到的和嚴重的毒性，以及在單獨給藥時具有很少或沒有免疫治 療益處。在某種程度上已清楚，單種細胞因子或趨化因子試劑并不引起具有抗癌效應所需 的完整Thl免疫反應譜，并且這些因子可能以隨時間變化的不同水平一起發揮作用。用多 重產物制劑（formulation)來重演（recapitulate)和協調（orchestrate)，這是近乎不可 能的免疫信號轉導事件級聯。大多數單種試劑細胞因子在臨床上失敗了，除了用于治療慢 性肝炎C病毒感染的聚乙二醇化干擾素外。
[0012] 基于觀察到的這些開發免疫調節性抗癌治療劑的方法的限制，人們需要免疫調節 性治療，其能夠模擬活細菌感染而不引入感染和感染相關毒性的風險，同時仍然引起足以 賦予抗癌活性的有效和不同的免疫反應。
[0013] 發明概述
[0014] 一些實施方案公開了細菌小細胞，其包含膽固醇依賴性細胞溶素蛋白，其中所述 小細胞不顯示抗體或包含抗體的Fc區的其他分子。
[0015] 在一些實施方案中，膽固醇依賴性細胞溶素蛋白選自：李斯特菌溶素0、李斯特 菌溶素0 L461T、李斯特菌溶素0 E247M、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 E247M、 李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、鏈球菌溶素0、鏈球菌溶素0 c、鏈球菌 溶素〇 e、球菌溶素（sphaericolysin)、炭疽桿菌溶素0(anthrolysin 0)、賭狀芽孢桿 菌溶素（cereolysin)、蘇云金芽孢桿菌溶素0(thuringiensilysin 0)、韋氏芽孢桿菌 溶素（weihenstephanensiIysin)、蜂房類芽胞桿菌溶素（alveolysin)、短芽孢桿菌溶 素（brevilysin)、丁酸芽孢梭菌溶素（butyriculysin)、破傷風溶素0、諾維氏芽孢梭 菌溶素（novyilysin)、凝集素溶素（lectinolysin)、肺炎球菌溶素、緩癥鏈球菌溶素 (mitilysin)、假肺炎球菌溶素、豬鏈球菌溶素、中間鏈球菌溶素（intermedilysin)、伊氏李 斯特菌溶素（ivanolysin)、斯氏李斯特菌溶素0(seeligeriolysin 0)、陰道加德納菌溶素 (vaginolysin)和化膿隱秘桿菌溶素（pyolysin)。在一些實施方案中，膽固醇依賴性細胞 溶素蛋白為產氣莢膜梭菌溶素〇(perfringolysin 0)。在一些實施方案中，膽固醇依賴性細 胞溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0016] 在一些實施方案中，小細胞還包含侵襲素。在一些實施方案中，小細胞不包含侵襲 素。
[0017] 在一些實施方案中，小細胞還包含Thl細胞因子。在一些實施方案中，Thl細胞因 子選自：IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-a 和 IFN-γ。
[0018] 在一些實施方案中，小細胞還包含Th2細胞因子。在一些實施方案中，Th2細胞因 子選自：IL_1 α、IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-IO 和 IL-13。
[0019] 在一些實施方案中，小細胞還包含磷脂酶。在一些實施方案中，磷脂酶為PC-PLC 或PI-PLC。
[0020] 在一些實施方案中，小細胞包含蛋白毒素，其選自：白喉毒素的片段A/B、 白喉毒素的片段A、炭疽毒素 LF和EF、腺苷酸環化酶毒素、白樹毒素、肉毒桿菌溶素 B (botulinolysin B)、肉毒桿菌溶素 E3、肉毒桿菌溶素 C、肉毒桿菌毒素、霍亂毒素、梭菌毒 素 A、B和α、蓖麻毒素、志賀A毒素、志賀樣A毒素、霍亂A毒素、百日咳Sl毒素、假單胞菌 外毒素 Α、大腸桿菌熱不穩定毒素（LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、細胞 因子、趨化因子、細胞穿膜肽，以及以上物質的組合。
[0021] 在一些實施方案中，小細胞不包含任何其他的治療活性部分。在一些實施方案中， 小細胞不包含治療性小分子、任何其他的治療性蛋白或治療性核酸。在一些實施方案中，小 細胞不顯示蛋白G或蛋白A的Fc結合部分。在一些實施方案中，小細胞不包含任何治療性 核酸如siRNA。
[0022] 本文中公開的一些實施方案提供了產小細胞的細菌，其包含：編碼產小細胞的基 因產物的可表達的基因，所述基因產物調節隔膜形成、二分裂和染色體分離中的一種或多 種；和能夠功能性表達膽固醇依賴性細胞溶素蛋白的重組表達盒，其中所述細菌不顯示抗 體或包含抗體的Fc區的其他分子，并且不顯示蛋白G或蛋白A的Fc結合部分。
[0023] 在一些實施方案中，產小細胞的細菌還包含：編碼異源核酸內切酶的可表達的"遺 傳自殺"基因，其中所述產小細胞的細菌的染色體包含所述核酸內切酶的一個或多個識別 位點；確定的營養缺陷型；以及lpxM/msbB基因中的缺失或突變。
[0024] 在一些實施方案中，核酸內切酶選自：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、 I-SceIII、I-Crel、I-Msol、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-Dmol、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII 和PI-ScpI。在一些實施方案中，營養缺陷型是由于必要代謝基因中的缺失或失活突變。 在一些實施方案中，編碼產小細胞的基因產物的可表達的基因選自：ftsZ、sulA、ccdB和 sfiCo
[0025] 在一些實施方案中，膽固醇依賴性細胞溶素蛋白選自：李斯特菌溶素0、李斯特菌 溶素0 L461T、李斯特菌溶素0 E247M、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 E247M、李 斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、鏈球菌溶素0、鏈球菌溶素0 c、鏈球菌溶素0 e、球菌溶素、炭疽桿菌溶素0、蠟狀芽孢桿菌溶素、蘇云金芽孢桿菌溶素0、韋氏芽孢桿菌溶 素、蜂房類芽胞桿菌溶素、短芽孢桿菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破傷風溶素0、諾維氏芽孢 梭菌溶素、凝集素溶素（lectinolysin)、肺炎球菌溶素、緩癥鏈球菌溶素、假肺炎球菌溶素、 豬鏈球菌溶素、中間鏈球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素0、陰道加德納菌溶 素和化膿隱秘桿菌溶素。在一些實施方案中，膽固醇依賴性細胞溶素蛋白為產氣莢膜梭菌 溶素0。在一些實施方案中，膽固醇依賴性細胞溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1。
[0026] 在一些實施方案中，小細胞還包含能夠功能性表達侵襲素的重組表達盒。
[0027] 一些實施方案提供了治療癌癥的方法，包括向有需要的患者給予包含膽固醇依賴 性細胞溶素蛋白的細菌小細胞，其中所述給藥誘導非免疫原性的抗腫瘤免疫調節效應。
[0028] 在一些實施方案中，小細胞不顯示抗體或包含抗體的Fc區的其他分子。
[0029] 在一些實施方案中，膽固醇依賴性細胞溶素蛋白選自：李斯特菌溶素0、李斯特菌 溶素 O L461T、李斯特菌溶素 O E247M、李斯特菌溶素 O D320K、李斯特菌溶素 O E247M、李 斯特菌溶素 O D320K、李斯特菌溶素 O L461T、鏈球菌溶素0、鏈球菌溶素 O c、鏈球菌溶素 O e、球菌溶素、炭疽桿菌溶素0、蠟狀芽孢桿菌溶素、蘇云金芽孢桿菌溶素0、韋氏芽孢桿菌溶 素、蜂房類芽胞桿菌溶素、短芽孢桿菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破傷風溶素0、諾維氏芽孢 梭菌溶素、凝集素溶素（lectinolysin)、肺炎球菌溶素、緩癥鏈球菌溶素、假肺炎球菌溶素、 豬鏈球菌溶素、中間鏈球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素0、陰道加德納菌溶 素和化膿隱秘桿菌溶素。在一些實施方案中，膽固醇依賴性細胞溶素蛋白為產氣莢膜梭菌 溶素0。在一些實施方案中，膽固醇依賴性細胞溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1。
[0030] 在一些實施方案中，小細胞還包含侵襲素。在一些實施方案中，小細胞不包含侵襲 素。
[0031] 在一些實施方案中，小細胞還包含Thl細胞因子。在一些實施方案中，Thl細胞因 子選自：IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-a 和 IFN-γ。
[0032] 在一些實施方案中，小細胞還包含Th2細胞因子。在一些實施方案中，Th2細胞因 子選自：IL_1 a、IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-13。
[0033] 在一些實施方案中，小細胞還包含磷脂酶。在一些實施方案中，磷脂酶為PC-PLC 或PI-PLC。
[0034] 在一些實施方案中，所述方法還包括蛋白毒素，其選自：白喉毒素的片段Α/Β、白 喉毒素的片段Α、炭疽毒素 LF和EF、腺苷酸環化酶毒素、白樹毒素、肉毒桿菌溶素 Β、肉毒桿 菌溶素 Ε3、肉毒桿菌溶素 C、肉毒桿菌毒素、霍亂毒素、梭菌毒素 Α、Β和a、蓖麻毒素、志賀A 毒素、志賀樣A毒素、霍亂A毒素、百日咳Sl毒素、假單胞菌外毒素 A、大腸桿菌熱不穩定毒 素（LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、細胞因子、趨化因子、細胞穿膜肽，以 及以上物質的組合。
[0035] 在一些實施方案中，小細胞不包含任何其他的治療活性部分。在一些實施方案中， 小細胞不包含治療性小分子、任何其他的治療性蛋白或治療性核酸。在一些實施方案中，小 細胞不顯示蛋白G或蛋白A的Fc結合部分。
[0036] 在一些實施方案中，癌癥包括實體瘤、轉移瘤或液體瘤。在一些實施方案中，癌癥 為上皮、成纖維細胞、肌肉或骨起源的。在一些實施方案中，癌癥選自：乳腺癌、肺癌、胰腺 癌、前列腺癌、睪丸癌、卵巢癌、胃癌、腸癌、口腔癌、舌癌、咽癌、肝癌、肛門癌、直腸癌、結腸 癌、食管癌、膽囊癌、皮膚癌、子宮癌、陰道癌、陰莖癌和腎癌。在一些實施方案中，癌癥為膀 胱癌。在一些實施方案中，癌癥選自：腺癌、肉瘤、纖維肉瘤和眼癌、腦癌和骨癌。在一些實 施方案中，癌癥選自：非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病、 慢性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病和慢性髓性白血病。
[0037] 在一些實施方案中，給藥產生Thl優勢免疫反應。在一些實施方案中，給藥產生 Th2優勢免疫反應。
【附圖說明】
[0038] 圖1的柱狀圖顯示，乳酸脫氫酶（LDH)釋放測定的結果指示了 PFO介導的哺乳動 物細胞膜滲透。
[0039] 圖2的圖顯示了相對于小細胞遞送的等量產氣莢膜梭菌溶素 O(PFO)，純化的重組 產氣莢膜梭菌溶素 O(BTX-IOO)的體外細胞毒性。
[0040] 圖3的圖顯示，靶向部分侵襲素的去除對包含PFO的小細胞的抗腫瘤活性沒有影 響。
[0041] 圖4描述的相片和圖表顯示了在肺和卵巢轉移中VAX-Iro小細胞的相似的抗腫瘤 效應。
[0042] 圖5的柱狀圖顯示，靜脈內給藥后在小鼠的肺而非卵巢中可檢測到vAx-iro小細 胞。
[0043] 圖6的柱狀圖顯示，VAX-Iro小細胞在嚴重免疫缺陷的NIH-III小鼠中具有很少 的抗腫瘤效應。
[0044] 圖7的圖顯示，VAX-IP小細胞在建立的非肌肉侵入性膀胱癌MB49鼠模型中高度 有效。
[0045] 圖8是構建產VAX-IP小細胞的菌株及來源于其的VAX-IP小細胞的總體方案示意 圖。
[0046] 圖9是pVX-336的質粒圖。
[0047] 圖10是pVX-128的質粒圖。
[0048] 圖11顯示了可誘導的小細胞形成的掃描電子顯微照片。
[0049] 圖12示出了顯示VAX-IP小細胞中侵襲素和產氣莢膜梭菌溶素 O的表達的照片和 圖表。
[0050] 發明詳述
[0051] 定義
[0052] 如本文所用，術語"Thl免疫調節性小細胞"是指能夠刺激Thl免疫反應的小細胞。
[0053] 如本文所用，術語"Th2免疫調節性小細胞"是指能夠刺激Th2免疫反應的小細胞。
[0054] 如本文所用，術語"Thl/Th2免疫調節性小細胞"是指能夠刺激Thl和Th2免疫反 應的小細胞。
[0055] 如本文所用，術語"重組侵入性免疫調節性小細胞"是指經遺傳改造而表達和顯示 能夠刺激內化至真核細胞的異源小細胞表面蛋白的小細胞。
[0056] 如本文所用，術語"天然侵入性的免疫調節性小細胞"是指這樣的小細胞，其從正 常侵入性的細菌制備而來，使得所述小細胞表達和顯示天然存在的能夠刺激內化至真核細 胞的小細胞表面蛋白。
[0057] 如本文所用，術語"免疫原性的"是指通過適應性免疫機制介導的抗原特異性的體 液或細胞免疫反應。免疫原性的小細胞指導免疫反應響應特定和具體的抗原，并且可用于 例如使用免疫原性的小細胞作為病原體特異性疫苗的環境中。
[0058] 如本文所用，術語"免疫調節"是指以所需的形式（包括但不限于產生Thl和Th2 免疫反應）總體調節（即，非免疫原性本身）免疫反應。
[0059] 如本文所用，術語"免疫治療"是指使用免疫調節化合物如免疫調節性小細胞，產 生針對消除或減緩疾病特別是癌癥的進展具有有益效果的總體（即，非免疫原性本身）免 疫反應。
[0060] 如本文所用，術語"粘附小細胞"是指能夠結合和粘附至非組成性吞噬真核細胞表 面而不顯著刺激所述小細胞的內吞的小細胞。
[0061] 如本文所用，術語"粘膜-粘附小細胞"是指能夠結合和粘附至粘膜表面的小細 胞。
[0062] 如本文所用，術語"VAX-P小細胞"是指表達和包含產氣莢膜梭菌溶素 O (PFO)的小 細胞。
[0063] 如本文所用，術語"VAX-IP小細胞"是指表達和顯示來自假結核耶爾森菌 (Yersinia pseudotuberculosis)的泛β?-整合素革E向細胞表面分子侵襲素及其任何功 能等同物的小細胞，其中所述小細胞還包含產氣莢膜梭菌溶素 O(PFO)。
[0064] 如本文所用，術語"VAX-IPT小細胞"是指表達和顯示來自假結核耶爾森菌的泛 β 1-整合素靶向細胞表面分子侵襲素及其任何功能等同物的小細胞，其中所述小細胞還包 含產氣莢膜梭菌溶素 O(PFO)和蛋白毒素。
[0065] 如本文所用，術語"VAX-IPP小細胞"是指表達和顯示來自假結核耶爾森菌的泛 β 1-整合素靶向細胞表面分子侵襲素及其任何功能等同物的小細胞，其中所述小細胞包含 產氣莢膜梭菌溶素 O(PFO)和除蛋白毒素外的外源性多肽。
[0066] 如本文所用，術語"VAX-iro小細胞"是指表達和顯示來自假結核耶爾森菌的泛 β 1-整合素靶向細胞表面分子侵襲素及其任何功能等同物的小細胞，其中所述小細胞包含 產氣莢膜梭菌溶素 O(PFO)和白喉毒素的催化片段。
[0067] 如本文所用，術語"VAX-IPG小細胞"是指表達和顯示來自假結核耶爾森菌的泛 β 1-整合素靶向細胞表面分子侵襲素及其任何功能等同物的小細胞，其中所述小細胞包含 產氣莢膜梭菌溶素 O(PFO)和白樹毒素。
[0068] 如本文所用，術語"VAX-IPPA小細胞"是指表達和顯示來自假結核耶爾森菌的泛 β 1-整合素靶向細胞表面分子侵襲素及其任何功能等同物的小細胞，其中所述小細胞包含 產氣莢膜梭菌溶素 O(PFO)和假單胞菌外毒素 Α。
[0069] 如本文所用，術語"VAX-IPR小細胞"是指表達和顯示來自假結核耶爾森菌的泛 β 1-整合素靶向細胞表面分子侵襲素及其任何功能等同物的小細胞，其中所述小細胞包含 產氣莢膜梭菌溶素 O(PFO)和蓖麻毒素 Α。
[0070] 如本文所用，術語"成孔細胞溶素蛋白"和術語"膽固醇依賴性細胞溶素蛋白"可 互換使用，并且是指這樣的蛋白，其能夠攻擊包含膽固醇的細胞膜而在膜上形成孔。對于一 些膽固醇依賴性細胞溶素蛋白，細胞膜中膽固醇的存在并非膽固醇依賴性細胞溶素蛋白結 合細胞膜所需要。例如，膽固醇依賴性細胞溶素蛋白可以為革蘭氏陽性細菌分泌的β-桶 成孔外毒素的家族成員。膽固醇依賴性細胞溶素蛋白的非限制性實例包括：李斯特菌溶素 0、李斯特菌溶素0 L461T、李斯特菌溶素0 Ε247Μ、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 Ε247Μ、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、鏈球菌溶素0、鏈球菌溶素0 c、鏈球 菌溶素〇 e、球菌溶素、炭疽桿菌溶素0、蠟狀芽孢桿菌溶素、蘇云金芽孢桿菌溶素0、韋氏芽 孢桿菌溶素、蜂房類芽胞桿菌溶素、短芽孢桿菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破傷風溶素0、諾 維氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素（Iectinolysin)、肺炎球菌溶素、緩癥鏈球菌溶素、假肺炎 球菌溶素、豬鏈球菌溶素、中間鏈球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素0、陰道 加德納菌溶素、化膿隱秘桿菌溶素和產氣莢膜梭菌溶素0。在一些實施方案中，膽固醇依賴 性細胞溶素蛋白包含ECTGLAWEffffR(SEQ ID NO: 1)所示的氨基酸序列。在一些實施方案中， 膽固醇依賴性細胞溶素蛋白包含WEWWRT(SEQ ID N0:2)所示的氨基酸序列。
[0071] 如本文所用，術語"治療性核酸"是指當被引入真核生物體（例如，哺乳動物如人） 時具有治療效應的核酸分子。治療性核酸可為例如ssDNA、dsDNA、SSRNA(包括ShRNA)、 dsRNA (包括siRNA)、tRNA(包括稀有密碼子使用tRNA)、mRNA、微小RNA(miRNA)、核糖體 RNA(rRNA)、肽核酸（PNA)、DNA = RNA雜