專利名稱：：治療c型肝炎的醫藥組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種治療C型肝炎的醫藥組合物，特別地是涉及治療C型肝炎的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物。
背景技術：
：根據世界衛生組織(WHO)的統計，全球約有3%(約3億)人口感染C型肝炎，成為世界性公共衛生問題。大多數受到感染的人并不會出現早期癥狀，因而未被診斷出來。受到急性感染的人約20%會自體清除病毒而痊愈，但是有高達80%的人會發展為慢性肝炎，其中20%會導致肝硬化。C型肝炎病毒(HCV)為正單股RNA病毒，主要是經由打針注射或者被污染的血液制劑傳染，產生肝炎復合癥，包括黃疸、食欲不振、倦怠、腹痛、肝功能間歇性異常、肝臟酵素指數異常升高等。目前使用傳統型和長效型的干擾素以及核酸類似物(ribavirin)來控制慢性病毒性肝炎。但是這些藥劑本身具有顯著的副作用，而且大多會產生抗藥性。因此臨床上期望能發展具有低副作用的替代藥物，用于治療C型肝炎。一種植物多酚的白黎蘆醇(Reveratrol)，已知具有低密度膽固醇(LDL)的氧化抑制作用、血小板凝集抑制作用、抗發炎反應、抗癌效應等(RokaYoboShokuhinnoKaihatsu,DevelopmentofAnti-AgingFoods,CMCPublishingCo.,Ltd.,pp.156-168,1999)。在醫藥上也已被作為例如抗血小板凝結劑(JP-A-61-171427)、抑制循環系統疾病進程藥劑(JP-A-2003-300904)、高脂血癥的預防及治療劑(JP-A-2001-72583)、或硬骨疾病的預防及治療劑(JP-A-2000-281567)等。白黎蘆醇(Reveratrol)的化學名稱為3，4，5_三羥基二苯代乙烯(3，4，5-trihydroxystibene)，在自然界常以寡聚合物型態存在，產生于葡萄科、蓼科、豆科等多種植物之中，是植株在真菌、細菌、寄生蟲等感染時產生的反應物質，成為植物體內一種重要的植物抗毒素(phytoalexin)。也因為具有抗氧化功能，白黎蘆醇(Reveratrol)目前也被廣泛作成保健食品或化妝品(W02004/103265A2)。本發明人等基于白黎蘆醇為天然植物衍生物并具有的種種生理特性，期望發展天然、具有低副作用的抗C型肝炎的治療藥劑，進行白黎蘆醇寡聚合物與C型肝炎之間的作用關系的研究，進而完成本發明。
發明內容本發明的目的在于提供一種用于治療C型肝炎的醫藥組合物。本發明的一實施例提供一種治療C型肝炎的醫藥組合物，包括以3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物為活性成分。上述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物較佳為一六個單體。上述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物較佳為三或四個單體。上述的3，4，5_三羥基二苯代乙烯寡聚合物較佳具有呋喃結構。上述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物較佳具有12個呋喃結構。上述的3，4，5_三羥基二苯代乙烯寡聚合物較佳為法第酚A(Vaticanc)IA)、法第酚B(vaticanolB)、法第酚C(vaticanolC)、及(-)-霍畢酚((-)-hopeaphenol)。上述的3，4，5_三羥基二苯代乙烯寡聚合物可由相關的羥基二苯代乙烯氧化縮合(OxidativeCoupling)制備(如J.Org.Chem.2004，69，2598-2600)。或者，上述的3，4，5_三羥基二苯代乙烯寡聚合物可萃取自例如蓼科(polygonaceae)、豆科(Leguminosae)、葡萄科(Vitaceae)、或桃金娘科(Myrtaceae)等植株，例如萃取自蓼科虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)的根及莖。本發明的另一實施例提供一種上述3，4，5_三羥基二苯代乙烯寡聚合物在制備治療C型肝炎的藥物中的應用。本發明的醫藥組合物中的活性成分——法第酚A、法第酚B、法第酚C、及(-)_霍畢酚具有抑制C型肝炎病毒復制的能力，可有效對抗C型肝炎。具體實施例方式3，4，5-三羥基二苯代乙烯(Reveratrol)的分子式為C14H12O3,化學式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>，在植物體內可以例如二聚體、三聚體、或四聚體的型態存在。三聚體例如法第酚A(vaticanolΑ)；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>四聚體例如法第酚B(vaticanolB)、法第酚C(vaticanolC)、及(-)-霍畢酚((-)-hopeaphenol)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>上述的3，4，5_三羥基二苯代乙烯寡聚合物由相關的羥基二苯代乙烯氧化縮合(OxidativeCoupling)制備(如J.Org.Chem.2004，69，2598-2600)，或萃取自例如蓼科(polygonaceae)、豆科(Leguminosae)、葡萄科(Vitaceae)、或桃金娘科(Myrtaceae)等植株，例如萃取自蓼科虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)的根及莖。本發明的萃取方法可使用例如蒸餾法、柱層析法、C02超臨界萃取法、超音波萃取法、薄膜層析法、毛細管電泳法(capillaryelectrophoresis;CE)、固相萃取法(solidphaseextraction;SPE)、或ι效液才匿層析夕去(highperformanceIiquidchromatography；HPLC)。將上述3，4，5_三羥基二苯代乙烯寡聚合物作為候選化合物(candidatecompound)進行生體夕卜(invitro)活性評估。利用Huh-luc/neo-ET細胞帶有I3891uc-ubi-NS3_3’/ET構筑基因的C肝病毒細胞復制系統，此復制系統可通過HCV的IRES(internalribosomeentrysite)所轉譯表現出的螢火蟲冷光酵素(fireflyluciferase)-泛素(ubiquitin)-新霉素磷酸轉移酶(neomycinphosphotransferase)的聚合蛋白質，以及由EMCV(encephalomyocarditis)的IRES所轉譯表現出的C肝病毒非結構性蛋白質(NS3-5B)包含蛋白酶(protease)、解旋酶(helicase)及聚合酶(polymerase)多蛋白。當HCV的IRES或HCV非結構性蛋白質組成的復制復合體(implicationcomplex)受到候選物(candidate)影響時，可通過測定螢火蟲冷光酵素活性的強度，評估候選物對抑制HCV復制子活性的效果，進而篩選出具有抑制C肝病毒能力的潛力候選物。使此Huh-luc/neo-ET細胞與候選化合物(例如法第酚A、法第酚B、法第酚C)等接觸，測量通過HCV的5’NTR非轉錄區域的IRES轉譯表現出螢火蟲冷光酵素_泛素_新霉素磷酸轉移酶的聚合蛋白質，以及由EMCV的IRES轉譯表現出C型肝炎病毒非結構性蛋白質(NS3-5B)的表現活性，測定螢火蟲冷光酵素的活性強度，評估候選化合物對抑制HCV復制子(Rplicon)活性的效果，篩選出具有抑制C型肝炎病毒的潛力候選物。實施例1法第酚A(vaticanolΑ)對C型肝炎病毒的抑制作用將Huh-luc/neo-ET細胞以每100μ1密度2.5X104個細胞/孔位接種于96孔細胞培養盤中，置于37°C二氧化碳細胞培養箱進行培養，隔天將96孔盤中原培養液以真空泵吸除，將待測樣品(法第酚A)以培養液稀釋成所需濃度加入96孔盤中(ΙΟΟμΙ/孔位)，對照組則為加任何藥物的培養液。培養二天后將培養液吸除，再以100μ1IxPBSdmMKH2PO4,IOmMNa2HPO4,137mMNaCl,2.7mMKCl)清洗上述細胞兩次，將此細胞進行以下的細胞毒性測試及螢火蟲冷光活性測試。細胞毒性測試每孔加入含有0.5mg/mlMTT(Sigma,M2128)的培養液50μ1/孔位，置于二氧化碳細胞培養箱中培養45分鐘后，加入150μ1DMS0,以搖擺震蕩器將紫色沉淀搖勻后于連續波長微孔盤分析系統中，測量560nm的波長測吸光值。以對照組的平均吸光代表100%的細胞的存活率(％)，計算實驗組加入各種不同濃度樣品的細胞的存活率)。細胞存活率計算公式為(與樣品培養后吸光值/對照組吸光值)X100%。以樣品的各種濃度所造成的細胞存活率作xy散布圖，原則上求得R2值超過0.9的趨勢線公式，以此公式代入y=50，χ即為可造成細胞50%死亡的樣品濃度(樣品物的CC50值)，或是y=85時，χ為可造成細胞15%死亡的樣品濃度(樣品物的CC15值)。試螢火蟲冷光活性測試加入35μ1Ix被動溶胞緩沖液(passivelysisbuffer)(Promega)后以搖擺震蕩器震蕩10分鐘后用定量吸管反復沖吸將細胞均勻打散，從中吸取30μ1換至測螢火蟲冷光用的96孔白盤，再依序分別加入40μ1的冷光分析緩沖液(21.5mMMgCl2,3.7mMΑΤΡ,Ο.IMKH2PO4)以及20μ1的冷光受質(ImMD-Luciferin，以二次水稀釋)，并在加入受質后立即以微盤冷光儀測量冷光的活性(Rlu/s)。以對照組的冷光活性為標準計算各樣品實驗組的抑制C肝病毒效率(抑制率(％))。抑制率(％)的計算公式為{[(對照組冷光活性)_(實驗組冷光活性)]/(實驗組冷光活性)}X100%。其中對于C肝病毒復制子有良好抑制效果的樣品，在經過連續稀釋然后測定其不同濃度的抑制百分比后，以grafit5軟件計算出該樣品抑制病毒效率50%時的樣品濃度(樣品物的IC50值)。實施例2法第酚B(vaticanolB)對C型肝炎病毒的抑制作用以實施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET細胞測試法第酚B(vaticanolB)對C型肝炎病毒的抑制活性。實施例3法第酚C(vaticanolC)對C型肝炎病毒的抑制作用以實施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET細胞測試法第酚C(Vaticanc)IC)對C型肝炎病毒的抑制活性。實施例4(-)-霍畢酚((_)-hopeaphenol)對C型肝炎病毒的抑制作用以實施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET細胞測試(_)_霍畢酚((“)-hopeaphenol)對C型肝炎病毒的抑制活性。比較例5法第苷B(vaticasideB)對C型肝炎病毒的抑制作用以實施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET細胞測試法第苷B(vaticasideB)對C型肝炎病毒的抑制活性。比較例6法第苷C(vaticasideC)對C型肝炎病毒的抑制作用以實施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET細胞測試法第苷C(vaticasideC)對C型肝炎病毒的抑制活性。比較例7漢斯里糖苷AQiemsleyanosideA)對C型肝炎病毒的抑制作用以實施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET細胞測試漢斯里糖苷AQiemsleyanosideΑ)對C型肝炎病毒的抑制活性。比較例8漢斯里糖苷B(hemsleyanosideB)對C型肝炎病毒的抑制作用以實施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET細胞測試漢斯里糖苷B(hemsleyanosideB)對C型肝炎病毒的抑制活性。各化合物對C型肝炎病毒的抑制活性如下表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表1數據可知，法第酚A(Vaticanc)IA)、法第酚B(vaticanolB)、法第酚C(vaticanolC)、及(-)-霍畢酚((-)-hopeaphhenol)具有抑制C型肝炎病毒復制的能力。因此使用取自天然植物的3，4，5_三羥基二苯代乙烯寡聚合物不但副作用少，而且有效對抗C型肝炎。而含糖結構法第酚B(vaticanolB)的法第苷B(vaticasideB)與含糖結構法第酚C(VaticaiK)IC)的法第苷C(vaticasideC)卻無抑制C型肝炎病毒復制的能力，可知抑制C型肝炎病毒復制的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物具有結構性的專一性。雖然本發明已以較佳實施例公開如上，然其并非用以限定本發明，任何熟悉此項技術的人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明的保護范圍當視后附的權利要求書所界定的范圍為準。權利要求一種抗C型肝炎的醫藥組合物，包括以3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物為活性成分。2.根據權利要求1所述的抗C型肝炎的醫藥組合物，其中所述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物為一至六個單體。3.根據權利要求2所述的抗C型肝炎的醫藥組合物，其中所述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物為三或四個單體。4.根據權利要求1所述的抗C型肝炎的醫藥組合物，其中所述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物具有呋喃結構。5.根據權利要求4所述的抗C型肝炎的醫藥組合物，其中所述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物具有12個呋喃結構。6.根據權利要求1所述的抗C型肝炎的醫藥組合物，其中所述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物為法第酚A、法第酚B、法第酚C、或(-)-霍畢酚。7.根據權利要求1所述的抗C型肝炎的醫藥組合物，其中所述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物由羥基二苯代乙烯氧化縮合制造。8.根據權利要求1所述的抗C型肝炎的醫藥組合物，其中所述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物萃取自蓼科、豆科、葡萄科、或桃金娘科的植株。9.根據權利要求1所述的抗C型肝炎的醫藥組合物，其中所述的3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物萃取自蓼科虎杖植株的根及莖。10.一種3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物在制備治療C型肝炎的藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種治療C型肝炎的醫藥組合物，包括以3，4，5-三羥基二苯代乙烯寡聚合物為活性成分。文檔編號A61K36/87GK101810598SQ20091000659公開日2010年8月25日申請日期2009年2月25日優先權日2009年2月25日發明者伊藤哲朗,張秀鳳,李連滋,殷韶禪,飯沼宗和申請人:財團法人工業技術研究院