專利名稱：預防或治療陰道炎的復合乳酸菌潔陰護理液及工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種預防或治療陰道炎的復合乳酸菌潔陰護理液劑，種用于婦女陰 道保健及調整陰道菌群失調的陰道微生態調節劑(消毒劑)，并涉及制備這種制劑的 工藝。
背景技術：
健康婦女，陰道由于解剖組織的特點對病原體的侵入有自然防御功能。如陰道 口的閉合，陰道前后壁緊貼，陰道上皮細胞在雌激素的影響下的增生，和表層細胞 角化，陰道pH值保持在pH4-5,使適應堿性的病原體的繁殖受到抑制，而宮頸管粘 液呈堿性，使適應酸性環境的病原體的繁殖受到抑制等，當陰道的自然防御功能受 到破壞時，病原體易于侵入，導致發生陰道感染性疾病。幼女及絕經后婦女由于陰 道上皮非常薄更易受到感染。寄生于健康婦女陰道中的細菌包括革蘭氏陽性需氧菌， 如乳酸桿菌、棒狀桿菌、非溶血性鏈球菌、腸球菌、表皮葡萄糖球菌，革蘭氏陰性 需氧菌有大腸桿菌、加德納菌。厭氧菌包括梭狀芽胞桿菌、消化鏈球菌、類桿菌及 梭形桿菌等，此外尚有Mobiluncns菌、支原體及念珠菌等。在這些正常陰道菌群中， 以乳酸桿菌占優勢，陰道乳酸桿菌對維持陰道正常菌群起著關鍵作用。陰道上皮的 糖原經乳酸桿菌的作用分解成乳酸，使陰道局部呈弱酸環境，抑制其他寄生菌過度 生長。此外部分乳酸桿菌尚能合成過氧化氬，這些過氧化氫陽性乳酸桿菌通過與其 他氧化物聯合作用可抑制其他細菌。另一方面乳酸桿菌造成的酸性環境又有利于減 少細胞表面負電荷和去除覆蓋于受體表面的糖基，暴露受體而有助于細菌粘附。因 此乳酸桿菌是通過正反兩方面調節正常陰道的菌群。但正如前述，當應用某些藥物 如廣語抗菌素、抗癌藥物及免疫抑制劑，或受到某些感染如淋病、梅毒、艾滋病， 或性激素等影響，都會導致陰道生態系統的平衡破壞。從微生態學的角度出發，通 過生態制劑調整療法，扶正和調節陰道內的正常菌群的組成和比例，恢復其自然的 抵抗外來菌侵擾的能力，促進其本身的生物自凈作用是治療此類疾病的一種必然趨 勢。本發明在已調查大量健康婦女和患病婦女陰道菌群變化以及與婦女陰道保健的 關系的基礎上、開發出 一種用于婦女陰道保健及調整陰道菌群失調的陰道微生態調 節劑(消毒劑)目前國內只有一種乳桿菌活菌陰道制劑應用于臨床，對治療各種陰道菌群失調 性陰道炎、陰道霉菌感染及陰道滴蟲病，均有較好的療效，而且復發率低，無抗生 素固有的耐藥性、引起菌群失調及毒性反應等副作用。但作為活菌制劑本身存在許 多缺點，如細菌存活期短，難于長時間保存，作為固體膠嚢制劑，把本來應發揮自 用的乳桿菌代謝產物如乳酸、醋酸、過氧化氫、細菌素及其他揮發性脂肪酸、 一些 有用的酶、多肽等活性物質全部扔掉。缺少乳桿菌代謝產物的微生態制劑是不完善 的。
發明內容
本發明的目的就是為了解決已有技術中實用，活菌制劑細菌存活期短，難于長 時間保存，固體膠嚢制劑把本來應發揮自用的乳桿菌代謝產物全部扔掉的許多缺點， 提供一種通過生態制劑調整療法，扶正和調節陰道內的正常菌群的組成和比例，恢 復其自然的抵抗外來菌侵擾的能力，促進其本身的生物自凈作用的陰道保健或預防 細菌炎的復合乳酸菌潔陰護理液及工藝。
本發明的陰道保健或預防細菌炎的復合乳酸菌潔陰護理液，含有德氏乳桿菌乳 酸亞種DM8909 (Lactobacillus debrueckii subsp. lactis)(本菌種由中科院孩i生 物研究所鑒定)發酵離心液20-40°/。；赤蘚糖醇1-3%;乳酸1-3%;過氧化氫1-3%; 水片0.2-0.5 °/。；薄荷油1-3%;其余為去離子水。充分混合后分裝。
本發明涉及對德氏乳桿菌的微生物學實驗、微生態學實驗及生產工藝研究實驗。 微生物實驗包括菌種分離、鑒定、生物特性、代謝產物、耐藥性、代謝物、H202產 生及質粒檢測等。生態效應試驗包括正常值調查、粘附、定植、生物拮抗、模型試 驗、安全試驗、穩定試驗和刺激試驗等。生產工藝研究包括種子、發酵和制劑產品 穩定性及工藝穩定性等方面的研究。基礎研究還包括作用機制的研究。
本發明涉及的的德氏乳桿菌制備工藝如下 德氏乳桿菌上清液的制備將德氏乳桿菌菌抹種子液接入已經滅菌后的含有重量 1-3%葡萄糖、0. 5-1. 5%大豆蛋白胨、0. 5-1°/。酵母浸膏、0. 2-0. 5°/ 乙酸鈉、0.2-0.5% 檸檬酸三銨的培養基中，經36。C-39。C厭氧發酵24-48小時后，離心分離，獲得上清 液，即發酵離心液。還可以加入0. 2-0. 5°/。乙酸鈉。
本發明涉及的一種用于調整菌群預防或治療細菌性陰道炎的復合乳酸菌潔陰護 理液制備工藝將德氏乳桿菌菌林種子液接入已經滅菌后的含有重量1-3%葡萄糖、 0. 5-1. 5%大豆蛋白胨、0. 5-1%酵母浸膏、0. 5-1%魚蛋白胨、0. 2-0. 5°/。檸檬酸三銨的培養基中，經36-39。C厭氧發酵后，離心分離獲得離心上清液；將前面所述離心上清 液按重量配比20-40%,赤蘚糖醇1-3°/。，乳酸1-3%,過氧化氫1-3%,冰片0. 2-0. 5 °/。， 薄荷油1-3%,其余為去離子水進行混合。
其中，德氏乳桿菌制備的最佳過程如下 德氏乳桿菌上清液的制備將德氏乳桿菌菌抹種子液接入已經滅菌后的含有重量2% 葡萄糖、1%大豆蛋白胨、0. 5%酵母浸膏、0. 2%乙酸鈉、0. 2%檸檬酸三銨的培養基中， 經37。C厭氧發酵48小時后，離心分離，獲得上清液。 本發明相關研究如下
(1 )本復合乳酸菌潔陰護理液的微生物殺滅試驗 依據《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》(GB15981-19950，參照《消毒技術規范》。 檢驗本復合乳酸菌潔陰護理液對大腸埃希菌(ATCC25922 )、金黃色葡萄球菌 (ATCC25923 )、白色念珠菌(ATCC10231 )、德氏乳桿菌(DM8909)、干酪乳桿菌(DM8121 ) 殺滅效果。結果表明，本復合乳酸菌潔陰護理液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、 白色念^^菌的殺滅率大于99. 9%,對德氏乳桿菌殺滅率為54. 4%、對干酪乳桿菌殺滅 率為67. 4%。
在37°C90天保藏后，對大腸桿菌的殺滅率大于99. 9%。 (2)皮膚刺激試驗
依據《消毒技術規范》第三版第一分冊3. 6皮膚刺激試驗方法進行試驗，結果表明， 本復合乳酸菌潔陰護理液對受試動物大白兔皮膚刺激試驗按刺激輕度分級屬輕刺激性。
(3) 陰道黏膜刺激試驗
依據《消毒技術規范》第三版第一分冊刺激試驗方法進行試驗結果表明，本復合 乳酸菌潔陰護理液對受試動物大白鼠陰道黏膜刺激試驗按皮膚刺激強度評分標準和 分級標準判定為無刺激性。
(4) 對細菌性陰道炎的臨床療效觀察
對患有細菌性陰道炎的24例患者采用復合乳酸菌潔陰護理液進行治療，每晚睡 前取本品10ml力。5 10倍量溫水稀釋后清洗陰道或外陰。炎癥傳染期，可將本品加 量到20ml清洗， 一個療程10天，用藥后3天返回門診，了解病情變化情況，停藥 后3d復查臨床癥狀、實驗室檢查等，與自身對照比較療效及安全性。對照組12例患者在沖洗外陰及陰道后，置陰道后官窿部曱硝唑栓一枚，每晚一次，同時口服曱 硝唑片0. 2g Tid，共7 10天。治療效果如下表1。對照組及治療組治療前后均出 現好轉現象，兩組之間有效率比較，無顯著差異(P〉0. 05)。治療前后陰道分泌物情 況見表2。
表1對24例BV患者治療結果(例數)
類別BV病組(12例)對照組(12例)治療前治療后總有效率(％)治療前治療后總有效率(％)線索細胞24 387.512 191.7
騷癢23 291.712 283.3
A帶多24 291.712 191.7
表2使用本制劑對BV患者陰道分泌物的治療效果比較類別BV病組(12例)對照組(12例)治療前治療后治療前治療后
乳酸桿菌檢出率《)33. 310033. 366. 7
PH4. 87±0. 664. 35±0. 384. 87±0. 664. 51±0. 55
陰道清潔度ir nrI ° II °ir nrI ° 11°
治療前治療后
病例號分泌物PH乳桿菌分泌物乳桿菌
12+5.0++3.03+
2+5. 5——3. 53+
32+5.0一—4. 03+
4+4. 5++3. 53+
5+6,0一—3. 04+
62+5. 0_+3. 04+
7+5. 5_+3. 54+
8+5. 5++3. 52+
9+5.0++4. 03+
10+5,0—4. 0
具體實施例方式
實施例1將德氏乳桿菌菌抹種子液接入已經滅菌后的含有重量比為3°/。葡萄糖、 1°/ 大豆蛋白胨、0. 8酵母浸膏、0. 8%魚蛋白胨、0. 4%檸檬酸三銨的培養基中，經36-39 'C厭氧發酵后，離心分離，獲得離心上清液，即發酵離心液。取400g發酵離心液， 用去離子水加至1000ml,形成復合乳酸菌潔陰護理液。
實施例2德氏乳桿菌發酵離心液300g;赤蘚糖醇20g;乳酸20g;過氧化氫30g; 冰片3g;薄荷油2 g;去離子水加至670ml。充分混合后分裝，制得復合乳酸菌潔陰 護理液。其中德氏乳桿菌發酵理性也制備方法如下將德氏乳桿菌菌林種子液按重量 3%接種量接入已經滅菌后的含有重量3%葡萄糖、0. 5°/。大豆蛋白胨，0. 5%魚蛋白胨、 0. 8%酵母浸膏、0. 35%檸檬酸三銨培養基中，經37。C厭氧發酵后，離心分離出菌體獲 得發酵離心液。
實施例3 —種本發明的陰道保健或預防細菌炎的復合乳酸菌潔陰護理液及制備 工藝如下
將德氏乳桿菌菌林種子液接入已經滅菌后的含有重量2%葡萄糖、r/。大豆蛋白胨、 0. 5%酵母浸膏、0. 2%乙酸鈉、0. 2。/。檸檬酸三銨的培養基中，經37。C厭氧發酵48小時 后，離心分離，獲得的上清液即為發酵離心液。取發酵離心液400g;赤蘚糖醇20g; 乳酸20g;甘油50g;冰片2g;薄荷油3 g;去離子水加至1000ml。充分混合后分 裝。對患有細菌性陰道炎的患者采用實施例2方法制得的復合乳酸菌潔陰護理液進行 治療，每晚睡前取本品10ml加5-10倍量溫水稀釋后清洗陰道或外陰。炎癥傳染期， 可將本品加量到20ml清洗， 一個療程10天。
實施例4按重量比取實施例1的發酵離心液250g;赤蘚糖醇10g;乳酸10g;甘 油50g;水片lg;薄荷油1.2g;;去離子水加至1000ml。充分混合后分裝，制得復 合乳酸菌潔陰護理液。
患者李某某，42歲，患有細菌性陰道炎。陰道分泌物呈灰色均質，粘度低，粘附 于陰道壁偶成泡沫狀，魚腥樣臭味；陰道pH值5. 0-5. 5;陰道分泌物濕涂片檢出線 索細胞。該患者采用實施例2方法制得的復合乳酸菌潔陰護理液進行治療，每晚睡前 取本品10ml加5~10倍量溫水稀釋后清洗陰道或外陰。使用一個療程10天后，患 者陰道騷癢、白帶多癥狀消失；陰道線索細胞轉為陰性，pH〈4. 5, 10°/ KOH實驗陰性。 患者痊愈。
實施例5按重量比取實施例1的發酵離心液350g;赤蘚糖醇30g;乳酸26g;甘油20g;冰片1.6g;薄荷油3. 2g;;去離子水加至lOOOml。充分混合后分裝，制得 復合乳酸菌潔陰護理液。患者張某某，37歲，患有霉菌性陰道炎，主要癥狀外陰瘙 癢并伴有灼痛，白帶增多，可見陰道粘膜上有一層白色粘稠或豆腐渣樣分泌物覆蓋， 粘膜充血紅腫，表淺潰瘍。陰道鏡檢發現霉菌。該患者采用實施例2方法制得的復合 乳酸菌潔陰護理液進行治療，每晚睡前取本品10ml加5 ~ 10倍量溫水稀釋后清洗陰 道或外陰。使用2個療程20天后，患者陰道騷癢、白帶多癥狀消失；陰道分泌物鏡 檢未見念珠菌孢子和菌絲。患者痊愈。
權利要求
1、一種用于調整菌群預防或治療細菌性陰道炎的復合乳酸菌潔陰護理液，其特征在于按重量比含有德氏乳桿菌乳酸亞種發酵離心液20-40％。
2、 如權利要求l所說的復合乳酸菌潔陰護理液，其特征在于按重 量比還含有赤蘚糖醇1-3%;乳酸1-3%;過氧化氫1-3%;冰片0.2-0.5%; 薄荷油1-3°/。；其余為去離子水。
3、 一種用于調整菌群預防或治療細菌性陰道炎的復合乳酸菌潔陰護 理液制備工藝將德氏乳桿菌菌林種子液接入已經滅菌后的含有重量 1-3%葡萄糖、0.5-1. 5%大豆蛋白胨、0. 5-1%酵母浸膏、0. 5-1%魚蛋白胨、 0. 3-0. 5%檸檬酸三銨的培養基中，經36-39。C厭氧發酵后，離心分離獲得 離心上清液；將前面所述離心上清液按重量配比20-40°/ ，赤蘚糖醇1-3%, 乳酸1-3°/。，過氧化氬1-3°/。，冰片0.2-0.5%,薄荷油1-3%,其余為去離 子水進行混合。
4、 如權利要求3所說的復合乳酸菌潔陰護理液制備工藝，加入 0. 2-0. 5°/。乙酸鈉。
5、 如權利要求3所說的復合乳酸菌潔陰護理液制備工藝，將德氏乳 桿菌菌株種子液接入已經滅菌后的含有重量2%葡萄糖、1%大豆蛋白胨、 0. 5%酵母浸膏、0. 2%乙酸鈉、0. 2%檸檬酸三銨的培養基中，經3丌C厭氧 發酵48小時。
全文摘要
預防或治療細菌性陰道炎的復合乳酸菌潔陰護理液及工藝，將德氏乳桿菌菌株種子液接入含有重量1-3％葡萄糖、0.5-1.5％大豆蛋白胨、0.5-1％酵母浸膏、0.5-1％魚蛋白胨、0.3-0.5％檸檬酸三銨的培養基中，經36-39℃厭氧發酵后，按重量取離心分離液20-40％，還可取赤蘚糖醇1-3％、乳酸1-3％、過氧化氫1-3％、冰片0.2-0.5％、薄荷油1-3％，其余為去離子水，充分混合。利用乳桿菌代謝產物如乳酸、醋酸、過氧化氫、細菌素及其他揮發性脂肪酸、有用的酶、多肽等活性物質調節陰道菌群失調，有效抑制外襲菌和過盛繁殖的陰道菌群中的少數種群，恢復其自然的抵抗外來菌侵擾的能力，促進其本身的生物自凈作用來預防和治療細菌性陰道炎。
文檔編號A61K33/40GK101543514SQ20091001147
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月6日 優先權日2009年5月6日
發明者左振軍, 袁杰力 申請人:大連潤生堂生物科技工程有限公司;大連震旦微生態學研究所