專利名稱：：益生菌與病毒偶聯生產藥物的方法
技術領域：
：本發明涉及一種動物用藥物的生產方法，尤其是一種用益生菌與病毒偶聯生產可同時具有抗菌及免疫調節作用、同時治療病毒病和細菌病藥物的方法。
背景技術：
：目前，對于動物體內病毒和細菌混合感染通常都是采用分別用藥且大多為肌肉注射給藥方式。如對于雞的新城疫病毒和大腸桿菌的混合感染，需要分別肌肉注射新城疫病毒高免血清及抗菌素，不僅成本高及給藥頻率高，所產生的應激反應大，而且治愈率最高僅能達到65%，雞患病后的死亡率高。
發明內容本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種用益生菌與病毒偶聯生產可同時具有抗菌及免疫調節作用、同時治療病毒病和細菌病藥物的方法。本發明的技術解決方案是一種益生菌與病毒偶聯生產藥物的方法，其特征在于按以下步驟進行a.取益生菌蛋白；b.將益生菌蛋白與病毒蛋白按質量比為46:l混合并加入與益生菌蛋白及病毒蛋白等質量的EDC偶聯劑偶聯；c.將所得的偶聯物制成免疫原備用；d.用免疫原對個體較本原病毒宿主大的異種動物免疫二次；e.二次免疫后，每隔一周采集被免疫的異種動物血一次，分離血清，以HI試驗檢測抗此病毒和益生菌的抗體效價，待抗體效價達到8Lg2時，從免疫的異種動物靜脈采血并分離血清備用；f.將e步驟所得血清按每毫升血清與含20億的益生菌懸液混合，37t:作用1小時后，4"C保存。所述a步驟是取益生菌培養液離心、去上清，再用與益生菌培養液同體積的已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經三次洗滌離心后去上清、取沉淀。所述d步驟免疫二次的用量分別為第一次0.5ml/kg、第二次0.7ml/kg。本發明是利用蛋白質偶聯技術，將益生菌菌體蛋白與病毒蛋白按比例偶聯在一起，通過免疫異種動物，獲得了抗此益生菌和病毒的抗體，其產量是本原病毒宿主的300500倍。所獲得的抗體與益生菌按比例混合作用后即能達到同時治療病毒和細菌混合感染且能通過口服給藥，治愈率達到了80%以上，降低了患病動物的死亡率，同時也降低了用藥成本，減少了對動物頻繁接種、多次用藥而產生的應激反應。具體實施例方式實施例1:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養基中，37。C培養24h，培養結束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質量。以分光光度計法測新城疫病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與新城疫病毒蛋白按質量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與新城疫病毒蛋白總量等質量的EDC，緩慢攪拌避光反應過夜。b.次日將偶聯物離心(10000r/min，離心5min)，棄上清以去掉未偶聯上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯物，并保存在4。C作為免疫原備用oc.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測新城疫抗體效價，待新城疫抗體效價達到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37匸作用1小時即可，4'C保存備用。實驗例1:取100只SPF雞，分別采用肌肉注射和口服途徑使其新城疫病毒和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現有技術以及本發明實施例1給藥，效果如表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>結果用實施例1的制劑作為新城疫病毒和大腸桿菌混合感染的治療用藥作用于患病雞體，治愈率為82%。實施例2:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養基中，37°C培養24h,培養結束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質量。以分光光度計法測傳染性支氣管炎病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與傳染性支氣管炎病毒蛋白按質量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與傳染性支氣管炎病毒蛋白總量等質量的EDC，緩慢攪拌避光反應過夜。b.次日將偶聯物離心(10000r/min，離心5min),棄上清以去掉未偶聯上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯物，并保存在4'C作為免疫原備用oc.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測傳染性支氣管炎病毒抗體效價，待傳染性支氣管炎病毒抗體效價達到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37'C作用1小時即可，4'C保存備用。實驗例2:取100只SPF雞，分別采用滴鼻和口服途徑使其傳染性支氣管炎和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現有技術以及本發明實施例2給藥，效果如表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結果用實施例2的制劑作為傳染性支氣管炎和大腸桿菌混合感染的治療用藥，作用于患病雞體，治愈率為88%。實施例3:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種己滅菌的MRS液體培養基中，37°C培養24h，培養結束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質量。以分光光度計法測禽法氏囊病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與禽法氏囊病毒蛋白按質量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與禽法氏囊病毒蛋白總量等質量的EDC，緩慢攪拌避光反應過夜。b.次日將偶聯物離心(轉速10000r/min，離心5min)，棄上清以去掉未偶聯上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯物，并保存在4。C作為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測禽法氏囊病毒抗體效價，待禽法氏囊病毒抗體效價達到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37匯作用1小時即可，4t:保存備用。實驗例3:取100只14日齡SPF雞，用點眼和口服途徑分別使其禽法氏囊病毒和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現有技術以及本發明實施例3給藥，效果如表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結果用實施例3的制劑作為禽法氏囊病毒和大腸桿菌混合感染的治療用藥，作用于患病雞體，治愈率為84%。實施例4:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養基中，37°C培養24h，培養結束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質量。以分光光度計法測馬立克病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與馬立克病毒蛋白按質量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與馬立克病毒蛋白總量等質量的EDC,緩慢攪拌避光反應過夜。b.次日將偶聯物離心(轉速10000r/min，離心5min)，棄上清以去掉未偶聯上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯物，并保存在4'C作為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測馬立克病毒抗體效價，待馬立克病毒抗體效價達到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37'C作用1小時即可，4"C保存備用。實驗例4:取100只14日齡SPF雞，分別采用滴鼻和口服方式使其馬立克病毒和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現有技術以及本發明實施例4給藥，效果如表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結果:用實施例3的制劑作為馬立克病毒和大腸桿菌混合感染的治療用藥，作用于患病雞體，治愈率為82%。實施例5:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化雞源糞鏈球菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養基中，37°C培養24h，培養結束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即雞源糞鏈球菌蛋白質量。以分光光度計法測禽腺病毒的蛋白含量，將雞源糞鏈球菌蛋白與禽腺病毒蛋白按質量比5:1比例混合，再加入雞源糞鏈球菌蛋白與禽腺病毒蛋白總量等質量的EDC，緩慢攪拌避光反應過夜。b.次日將偶聯物離心(轉速10000r/min，離心5min)，棄上清以去掉未偶聯上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯物，并保存在4"C作為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測禽腺病毒抗體效價，待禽腺病毒抗體效價達到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與雞源糞鏈球菌按每毫升血清與含20億的糞鏈球菌菌懸液混合后37r作用1小時即可，4'C保存備用。實驗例5:取100只SPF雞，分別采用滴鼻和口服途徑使其禽腺病毒和大腸桿菌混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現有技術以及本發明實施例5給藥，效果如表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果用實施例3的制劑作為禽腺病毒和大腸桿菌混合感染的治療用藥，作用于患病雞體，治愈率為88%。實施例6:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化酵母菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養基中，37°C培養24h，培養結束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即酵母菌蛋白質量。以分光光度計法測新城疫病毒的蛋白含量，將酵母菌蛋白與新城疫病毒蛋白按質量比5:l比例混合，再加入酵母菌蛋白與新城疫病毒蛋白總量等質量的EDC，緩慢攪拌避光反應過夜。b.次日將偶聯物離心(轉速10000r/min，離心5min),棄上清以去掉未偶聯上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯物，并保存在4TM乍為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原還是偶聯物0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進行，每只羊按免疫原還是偶聯物0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測新城疫病毒抗體效價，待新城疫病毒抗體效價達到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與酵母菌按每毫升血清與含20億的酵母菌菌懸液混合后37'C作用1小時即可，4x:保存備用。實驗例6:取100只SPF雞，分別采用滴鼻和口服途徑使其新城疫疫病毒和支原體混合感染，按50只為一組，分為兩組分別按現有技術以及本發明實施例6給藥，效果如表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結果:用實施例3的制劑作為新城疫病毒和沙門氏菌混合感染的治療用藥，用于患病雞體，治愈率為80%。實施例7:a.在無菌超凈工作臺里挑取已純化乳酸菌單菌落(V球)接種已滅菌的MRS液體培養基中，37°C培養24h，培養結束后取500ml菌液(V球)離心(3000r/min)，結束后棄掉上清。再用500ml已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經100ml的pH值8.0的PBS緩沖液三次洗滌離心(3000r/min)后去上清留沉淀，稱取沉淀濕重，即酵母菌蛋白質量。以分光光度計法測新城疫病毒的蛋白含量，將乳酸菌蛋白與新城疫病毒蛋白按質量比5:l比例混合，再加入乳酸菌蛋白與新城疫病毒蛋白總量等質量的EDC，緩慢攪拌避光反應過夜。b.次日將偶聯物離心(轉速10000r/min,離心5min)，棄上清以去掉未偶聯上的病毒，留沉淀并加入100ml的生理鹽水溶解偶聯物，并保存在4'C作為免疫原備用。c.用制備好的免疫原免疫6個月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分點注射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天進行，每只羊按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分離血清，以HI試驗檢測新城疫病毒抗體效價，待新城疫病毒抗體效價達到8Lg2時，從羊頸靜脈采血并分離血清備用。d.將c步驟所得血清與乳酸菌按每毫升血清與含20億的乳酸菌菌懸液混合后37C作用1小時即可，4'C保存備用。實驗例7:取100只SPF雞，分別采用肌肉注射和口服途徑使其新疫病毒和沙門氏菌混合感染，50只為一組，分為兩組分別按現有技術以及本發明實施例6給藥，效果如表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結果用實施例3的制劑作為新城疫病毒和乳酸菌混合感染的治療用藥，用于患病雞體，治愈率為82%。除以上所列益生菌外，還可選用屎腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。實施例中的益生菌糞鏈球菌(CICC20062)、屎腸球菌(CICC20420)、乳酸菌(CICC6002)、酵母菌(CICC1012)、蠟狀芽孢桿菌(CICC10040)、枯草芽孢桿菌(CICC10071)等菌種均購置于中國工業微生物菌種保藏管理中心。病毒新城疫病毒(cec20060254)、傳染性支氣管炎病毒(cec20060118)、傳染性喉氣管炎病毒(cvccAV22)、禽法氏囊病毒(cec20090904)、馬立克氏病毒(cvccAV26)、禽腺病毒(cvccAV176)等均購置于國家獸醫微生物菌種保藏中心。偶聯劑選用的是EDC購置于合肥博美生物科技有限公司。權利要求1.一種益生菌與病毒偶聯生產藥物的方法，其特征在于按以下步驟進行a.取益生菌蛋白；b.將益生菌蛋白與病毒蛋白按質量比為4～6∶1混合并加入與益生菌蛋白及病毒蛋白等質量的EDC偶聯劑偶聯；c.將所得的偶聯物制成免疫原備用；d.用免疫原對個體較本原病毒宿主大的異種動物免疫二次；e.二次免疫后，每隔一周采集被免疫的異種動物血一次，分離血清，以HI試驗檢測抗此病毒和益生菌的抗體效價，待抗體效價達到8Lg2時，從免疫的異種動物靜脈采血并分離血清備用；f.將e步驟所得血清按每毫升血清與含20億的益生菌懸液混合，37℃作用1小時后，4℃保存。2.根據權利要求1所述的益生菌與病毒偶聯生產藥物的方法，其特征在于所述a步驟是取益生菌培養液離心、去上清，再用與益生菌培養液同體積的已滅菌生理鹽水加入離心桶中，將菌泥吹起制成菌懸液后經三次洗滌離心后去上清、取沉淀。3.根據權利要求1或2所述的益生菌與病毒偶聯生產藥物的方法，其特征在于所述c步驟是將所得偶聯物離心去上清、留沉淀；加入生理鹽水溶解偶聯物。根據權利要求1或2所述的益生菌與病毒偶聯生產藥物的方法，其特征在于所述d步驟免疫二次的用量分別為第一次0.5ml/kg、第二次0.7ml/kg。全文摘要本發明公開一種益生菌與病毒偶聯生產藥物的方法，按以下步驟進行a.取益生菌蛋白；b.將益生菌蛋白與病毒蛋白按質量比為4～6∶1混合并加入與益生菌蛋白及病毒蛋白等質量的EDC偶聯劑偶聯；c.將所得的偶聯物制成免疫原備用；d.用免疫原對個體較本原病毒宿主大的異種動物免疫二次；e.二次免疫后，每隔一周采集被免疫的異種動物血一次，分離血清，以HI試驗檢測抗此病毒和益生菌的抗體效價，待抗體效價達到8Lg2時，從免疫的異種動物靜脈采血并分離血清備用；f.將e步驟所得血清按每毫升血清與含20億的益生菌懸液混合，37℃作用1小時后，4℃保存。文檔編號A61P31/00GK101543513SQ20091001146公開日2009年9月30日申請日期2009年5月11日優先權日2009年5月11日發明者李鳳華,江國托,王效禹申請人:大連三儀動物藥品有限公司;江蘇三儀生物工程有限公司