專利名稱：中華絨螯蟹Crustin-1基因及體外重組表達的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，涉及中華絨螯蟹Crustin-l基因序列，具體地說是從中 華絨螯蟹cDNA文庫中篩選出中華絨螯蟹Crustin-l相關的EST序列，并拼接成全序列，并 進行了原核重組表達，還涉及到該基因及其表達產物在藥物生產、飼料添加劑以及防腐劑和 保鮮劑生產中的應用。
背景技術：
抗菌肽是廣泛存在于生物界中的雙親性小分子堿性多肽，是機體固有免疫的關鍵因子。 自Steiner發現天蠶素Cecropin以來，到目前為止，在各種生物中總共發現了 800多種抗菌肽。 根據抗菌肽的序列、二級結構和抗菌特性等，將已發現的抗菌肽分為四大類(1)不含半胱 氨酸的線型抗菌肽，如天蠶素、馬蓋寧等；(2)具有半胱氨酸的環型抗菌肽，如防御素等；
(3)富含某一種或兩種氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗 菌肽等；(4)由前體大分子酶解產生的抗菌肽，如鱟的血藍蛋白。Crustin作為一種針對革蘭 氏陽性菌的抗菌肽，首先是在岸蟹中發現的(Rdfetal., 1999)。隨后的研究發現其氨基酸序 列在在其C一末端有12個Cys，其中8個位置保守，可形成WAP結構域。
中華絨螯蟹(&/(^/^>"^>^">^)又名河蟹，因其營養豐富、味道鮮美而深受人們喜愛，是 我國重要的水產養殖品種之一。自20世紀80年代以來，中華絨螯蟹養殖業發展迅速，到2000 年全國養殖產量已超過100 000t，年產值達120—150億元，已成為水產養殖支柱產業之一(崔 朝霞等，2003)。但隨著中華絨螯蟹養殖規模的不斷擴大，各種疾病日趨嚴重，給養殖產業造 成了巨大損失。養殖河蟹病害的不斷爆發及病因的多樣性迫切要求從河蟹本身的免疫防御因 子入手研究其抗病機制和制定新的疾病防治措施。Crustin作為一種重要的針對革蘭氏陽性菌 的抗菌肽必將在其免疫防御中發揮著非常重要的作用。
發明內容
本發明的目的是從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-l，并對其進行原核重組及重組產物的活 性鑒定，為進一步研究中華絨螯蟹防御機制提供基礎，并為中華絨螯蟹的病害防治、基因輔 助選育及進一步開發為醫藥產品和飼料添加劑奠定基礎。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
利用構建cDNA文庫，釆用RACE技術以及體外重組表達等技術，對中華絨螯蟹Crustin-l進行了研究，首次從中華絨螯蟹中克隆到Cmstin-l，該基因具有序列表中所示的序列。
本發明從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-l基因cDNA全長821bp，有一個315 bp的開放閱 讀框，編碼104個氨基酸，5'非編碼區長239bp， 3'非編碼區長267bp，有多聚腺苷酸加尾信 號和多聚腺苷酸尾巴，該基因在中華絨螯蟹免疫防御方面發揮著重要作用。它具有SEQ ID NO. l所示的序列。利用pET30a(+)表達載體在大腸桿菌origami (DE3)重組表達了該蛋白，表達 產物對藤黃微球菌、四聯球菌、枯草桿菌和蘇云金芽孢桿菌具有明顯的殺菌活性，最小抑菌 濃度分別為0.12 ^M、 0.46 ^M、 0.23 ^M和0.12 而對革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌五.co// 和鰻弧菌P%r/o a"gwz7/aww均未檢測到殺傷活性。
其編碼的蛋白具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列，分子量為11572.58，等電點為8.43， 其中編碼序列的1-21為信號肽序列，成熟肽分子量為9319.71，等電點為8.26。具有典型的 WAP結構域(Lys50-Gln101)。
本發明利用表達序列標簽(EST)技術、cDNA末端快速擴增(RACE)技術從中華絨螯 蟹中克隆到Crustin-l基因cDNA全長序列，通過PCR技術，擴增編碼Crustin-l成熟肽的基 因片段并將其克隆到pET30a(+)表達載體中，在大腸桿菌origami (DE3)實現體外重組表達。 重組產物經HiTmp chelating柱純化和透析后，對藤黃微球菌(Mfo"ococc^ /Wew;y),、枯草芽孢 桿菌(5ac/〃ws st/Z^/to)、 四聯j敖球菌CM;'cracO(Xi^ fc^"gemw)禾口蘇云金芽孢桿菌CSac/〃M //^/"g/e肌力都具有較強的殺菌活力，最小抑菌濃度分別為O.llpM、 0.23pM、 0.46pM和 O.llpM;對革蘭氏陰性菌沒有明顯的殺菌活力。本發明可以為進一步研究中華絨螯蟹免疫防 御機制提供基礎，并為中華絨螯蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑奠定基礎，同時 為進一步開發為醫藥產品奠定基礎。
具體實施例方式
下面的實施例中將本發明作進一步闡述，但本發明不限于此。 實施例1.
一種克隆得到的中華絨螯蟹Crustin-l ，具有SEQ ID NO. 1所示的序列。 本發明中的中華絨螯蟹Crustin-l的cDNA序列克隆包括下列步驟
a) 中華絨螯蟹總RNA的提取及mRNA的純化；
b) 中華絨螯蟹cDNA文庫構建；
c) 中華絨螯蟹cDNA文庫EST序列的大規模測定；
d) 中華絨螯蟹EST序列的同源性分析及Crustin-l基因片段的篩選；
e) EST序列拼接獲得Crustin-l的全序列；
f) 中華絨螯蟹Crustin-l的體外重組表達及活性分具體操作如下
1. 中華絨螯蟹總RNA的提取及mRNA的純化利用Invitrogen.公司的Trizol試劑從感染 了鰻弧菌的中華絨螯蟹血淋巴中提取總RNA,利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA純 化試劑盒純化mRNA。
2. 中華絨螯蟹cDNA文庫構建利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)進行cDNA的合成，雙鏈cDNA經末端補平、EcoR I接頭連 接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit對大于lOObp的酶切片段進行回收，與Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector 載體連接，利用Stratagene公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒進 行文庫包裝，利用Exassist Helper Phage禾Q SOLR菌株從Uni-ZAP XR Vector上體外切 割pBluescript成為質粒文庫。
3. 中華絨螯蟹cDNA文庫EST序列的大規模測定文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用 引物T3在MegaBACE1000測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*.abi， *.abd 文件)數據經Phred程序處理轉化為序列文件(*.seq)和質量文件(*.seq.qual)，依據 質量文件提供的數值確定獲得序列的誤差概率，去除低質量的堿基，用cross-mach程序 屏蔽數據中的載體序列，從得到的數據中選取連續堿基質量大于Q13 (準確率大于95%) 且長度大于lOObp的序列作為EST數據，具體《基因表達序列標簽(EST)數據分析手 冊》(胡松年著，浙江大學出版社，2005年)。
4. 中華絨螯蟹EST序列的同源性分析及Cmstin-l基因片段的篩選將獲得的全部有效的 EST數據進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons,分別將所獲的Contigs與Singletons 在數據庫中進行BLASTn和BLASTx分析，根據相似性分析結果尋找出與Crustin-1基因 同源的EST序列。
5. 中華絨螯蟹Crustin-1基因cDNA全長序列的克隆根據與Crustin-1基因同源的EST 序列設計特異性引物 Fl (5'GCTGCGAAGATGAACGGG3')和 Rl (5'TGACATCCTCCGCCATAGA3')， 分別利用載體通用引物 T3 (5' AATTAACCCTCACTAAAGGG3')禾卩T7 (5' GTAATACGACTCACTATAGGGC)進行3'禾卩5'末端的 擴增。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用膠回收試劑盒(北京博大泰克)進 行PCR產物的回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，然 后轉化大腸桿菌感受態細胞Topl0F'，挑選陽性克隆用載體引物M13-47和RV-M進行測 序，所得結果經CLUSTER分析拼接和得到全長序列。
所篩選的EST序列經CLUSTER分析拼接后得到全長序列。3，RACE擴增所用反應體系及反應條件
25^1反應體系，包含
2.5 pl 10xPCR buffer,
1.5(il MgCl2 (2.5mM),
1.0 jil引物Fl (lOpmol/pl),
1.0 pi引物T7(10pmol/nl),
2.0dNTP (2.5 mM)，
0.15 jal Taq DNA polymerase (Promega),
l.O^dcDNA模板，
15,85 pi PCR-grade water。
反應在PTC-100PCR熱循環儀(MJ Research)中進行，反應條件為94。C預變性5分鐘， 然后進入35個循環94。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸卯秒。最后進行72°C 延伸10分鐘。
5'RACE擴增所用反應體系及反應條件
25 pi反應體系
2.5 pl 10xPCR buffer,
1.5nl MgCl2 (2.5 mM)，
1.0 引物R1 (10 pmol/pl),
1.0 pl引物T3(10pmol爾l),
2.0 pl dNTP (2.5 mM),
0.15 (xl Taq DNA polymerase (Promega)，
1.0pIcDNA模板，
15.85 pl PCR-grade water。
反應在PTC-100PCR熱循環儀(MJ Research)中進行，反應條件為94。C預變性5分鐘， 然后進入35個循環94。C變性30秒，59。C退火30秒，72'C延伸60秒。最后進行72°C 延伸IO分鐘。
陽性克隆的PCR篩選條件為
25 ^反應體系
2.5 pl 10xPCR buffer,
1》1 MgCl2 (2.5mM),
1.0 nl引物M13-47 (10 pmol/pl)，1,0 引物RV-M (10 pmol/nl)，
2.0 pl dNTP (2.5 mM),
0.15 fxl Taq DNA polymerase (Promega),
1.0 ^菌液
15.85 jil PCR-grade water 。
反應在PTC-100 PCR熱循環儀(MJ Research)中進行，反應條件為94。C預變性5分鐘， 然后進入35個循環94。C變性30秒，59'C退火30秒，72t:延伸60秒。最后進行72°C 延伸IO分鐘。
實施實例2.
根據SEQ ID NO. 2對應的cDNA序歹ij，設計含有限制性內切酶Nde I和Xho I酶切位點 的特異性引物F2(5'CATATGTGTCGATACTGGTGCAAGA3')禾口 R2 (5'
增編碼Crustin-l成熟肽的基因片段，反應在PTC-100 Programmable Thermal Controller cycler (MJ Research)中進行，反應條件為94。C預變性5分鐘；然后進行35循環包含94°。變性30 秒，60'C退火30秒，72'C延伸30秒；最后72'C延伸10分鐘。然后將其克隆到pET30表達 載體中，轉化大腸桿菌origami (DE3)，測序確認表達框正確后，接種陽性克隆到LB培養基 中，37'C振蕩培養至O.D.6(W=0.4-0.6，加入IPTG至終濃度為lmM誘導4小時后離心收集菌 體。菌體在冰浴條件下用超聲波200W處理30-60分鐘(每次3秒，間隔3秒)。離心收集上 清，利用Amersham公司的HiTrap chelating柱純化重組產物。純化后的產物利用梯度稀釋法 進行抑菌活性測定。以藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、四聯微球菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿 菌和鰻弧菌作為受試菌株檢驗表達產物的殺菌活性。接種5nl對數生長期受試菌(濃度為 104-105cfu/ml)，在28'C培養24小時后，600nm測定細菌濃度。發現革蘭氏陰性菌在所有 Crustin-l試驗濃度下都能正常生長，而革蘭氏陽性菌只在含低濃度Crustin-l或者不含 Crustin-l的LB培養基中生長。
實施實例3:重組蛋白可為中華絨螯蟹的病害防治、基因輔助選育和詞料添加劑研制奠 定基礎。中華絨螯蟹Crustin-l基因及其體外重組表達.txt SEQUENCE LISTING
<110>中國科學院海洋研究所
〈120〉 中華絨螯蟹Crustin-l基因及體外重組表達
<130〉
<140> 1
<141> 2009-02-24
<160> 2
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211〉 821
<212〉 DNA
〈213〉 中華續螯蟹(Eriocheir sinensis)
〈220〉 <221> CDS 〈222〉 (240).. (554)
<400〉 1 ccccgggctg caggattcga attcctgctt tccacgacgacttttctgct tactcttctt60
cccttgagcg actgaccttt ggagcagcgc犯ggaaaggtccaacaaaac atttcatgea120
cggtggg卿犯cccggccg cgag犯t3ta aggctg財gcaggaagagga actggccaag180
tcttcttgca gcaagagatc gaccactgaa cacacctttcaacttactca ttttcaaag239
atg atg agg cca ctg ctg ctg ctg etc etc gtg Met Met Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10gtg acg etc t3t ggc Val Thr Leu Tyr Gly 化287
gga gga tgt cac gcg acc tgt cga tac tgg tgc Gly Gly Cys His Ala Thr Cys Arg Tyr Trp Cysaag aca cct gaa aac Lys Thr Pro Glu Asn335
20 25 30
cag acg tac tgc tgc gaa gat gaa egg gaa ate cca agt aaa gtg ggt 383 Gin Thr Tyr Cys Cys Glu Asp Glu Arg Glu lie Pro Ser Lys Val Gly 3^ 40 45
ctg aag ccc gga aag tgc cct ccc gtg cgc cct gtg tgt cct cct act 431 Leu Lys Pro Gly Lys Cys Pro Pro Val Arg Pro Val Cys Pro Pro Thr 5b 55 60
agg ggc ttc ttc gaa cca ccc aaa aca tgc tec aac gac ggg tec tgc 479 Arg Gly Phe Phe Glu Pro Pro Lvs Thr Cys Ser Asn Asp Gly Ser Cys 65 70 75 80
tac ggc gcc gac aag tgc tgc ttt gac agg tgt etc ggt gaa cat gtc 527 Tyr Gly Ala Asp Us Cys Cys Phe Asp Arg Cys Leu Gly Glu His Val 8^ 90 95
tgc aag cca ate cag acc aga ggt tga cagtcccatt tttatggctt 574 Cys Lys Pro lie Gin Thr Arg Gly 100
at幼tgtatt"tetceLagtaaataattttcacgaatttccta634
gtattatagaattatatcatacattataaattatgaatatgttgtgtata tcttaagaaa694
cc卿ggccgca3g犯ttttttccggag犯taactacactg犯gatgg犯acsttagcta754
ctctaaactgtagacaataaactgecaaaatt3ttc犯taaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa814 821
<210> 2 <211> 104<212〉 PRT
<213〉 中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis) 〈400> 2
Met Met Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Thr 1 5 10
Leu
Tyr Gly 15
Gly Gly Cys His Ala Thr Cys Arg Tyr Trp Cys Lys Thr Pro Glu Asn
20 25
30
Gin Thr Tyr Cys Cys Glu Asp Glu Arg Glu lie Pro Ser Us Val Gly 3^ 40 45
Leu Lys Pro Gly Lys Cys Pro Pro Val Arg Pro Val Cys Pro Pro Thr 50 55 60
Arg Gly Phe Phe Glu Pro Pro Lys Thr Cys Ser Asn Asp Gly Ser Cys 65 70 75 80
Tyr Gly Ala Asp Lys Cys Cys Phe Asp Arg Cys Leu Gly Glu His Val
85 90
95
Cys Lys Pro lie Gin Thr Arg Gly 100
權利要求
1.一種中華絨螯蟹Crustin-1基因，其特征在于具有序列表SEDIQ No.1中的堿基序列。
2. —種要求1所述的中華絨螯蟹Crustin-l基因編碼蛋白，其特征在于具有序列表SEDIQ No.2中氨基酸序列。
3. —種權利要求2所述中華絨螯蟹Crustin-1的應用，其特征在于中華絨螯蟹Cmstin-l基 因的重組表達產物可作為抗菌劑，應用丁人類相關疾病的治療，還可用于藥物生產、詞料添 加劑以及防腐劑和保鮮劑生產中。
全文摘要
本發明涉及分子生物學技術領域，是中華絨螯蟹Crustin-1的基因克隆及其重組表達技術。本發明利用表達序列標簽(EST)技術、3’和5’末端快速擴增技術(RACE)從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-1基因cDNA全長821bp，有一個315bp的開放閱讀框，編碼104個氨基酸，5’非編碼區長239bp，3’非編碼區長267bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴，該基因在中華絨螯蟹免疫防御方面發揮著重要作用。本發明利用體外重組表達技術獲得了中華絨螯蟹Crustin-1蛋白，該重組蛋白對革蘭氏陽性菌具有較強的抑菌活性，對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、四聯微球菌和蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為0.12μm、0.23μm、0.46μm、0.12μm；而對革蘭氏陰性菌沒有明顯的抑制作用。本發明可為中華絨螯蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑研制奠定基礎。
文檔編號A61P31/00GK101525617SQ20091001456
公開日2009年9月9日 申請日期2009年3月9日 優先權日2009年3月9日
發明者宋林生, 母昌考, 王玲玲, 蓋云超, 趙建民, 邱麗梅, 鄭沛林 申請人:中國科學院海洋研究所