專利名稱：：動物用復方中草藥免疫增強劑及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及免疫增強劑的配方及制備工藝領域，具體涉及一種動物用中草藥免疫增強劑及其制備方法。
背景技術：
：隨著我國畜牧業的快速發展，畜禽飼養模式也發生了明顯變化，規模化和集約化程度越來越高，全球氣候變暖，使動物疾病的發生形式及數量發生了變化，最為嚴重和顯著的特點是各種原因造成的機體免疫機能下降導致疫苗免疫失敗時有發生、條件性傳染性疾病尤其是細菌性疫病經常暴發和流行，一方面養殖場為此不斷增加疫苗的使用劑量和次數，對動物的應激更加頻繁，動物的生長性能受到了限制;另一方面，由于飼料中長期添加各種抗生素誘使細菌性病原體普遍產生了嚴重的耐藥性，養殖場為控制細菌病而超劑量使用或濫用，造成動物產品中出現抗生素殘留越來越重，不僅劉人類的身體健康造成了威脅，而且嚴重阻礙了我國畜產品的出口貿易的健康發展。中草藥可從整體上全面調理人和動物機體的各種功能，部分中草藥具有抗應激、抗病毒、抗菌活性，而且價格低廉，資源豐富，長期使用對機體的毒副作用小，低殘留或無殘留，因此近年來受到了廣大飼養者的青睞。白花蛇舌草、黃芪、黨參等多種中草藥可不同程度地提高或調節機體的免疫功能，復方中草藥免疫增強劑具有更全面或更好的增強效果，但現有的復方制劑組分太多，復雜，產品質量不僅難于控制，而且不穩定，從多種不同配比的組合中篩選出小復方中草藥免疫增強劑，尤其適用于南方熱帶亞熱帶地區，目前未見相關報道。
發明內容針對現有技術中存在的不足之處，本發明的首要目的是提供一種能顯著提高動物的體液免疫、細胞免疫功能等特異性及非特異性免疫功能的復方中草藥免疫增強劑。本發明的另一目的是提供上述免疫增強劑的制備方法。本發明通過以下技術方案達到以上目的一種動物用復方中草藥免疫增強劑，由以下重量份的原料制備得到白花蛇舌草5-15份，黃芪30-50份，黨參30-50份。本發明還提供上述動物用復方中草藥免疫增強劑的制備方法先將所述原料(白花蛇舌草、黃芪和黨參)粉碎，過篩，再按所述的重量配比混勻，加入8-15重量倍去離子水煎煮，趁熱過濾后，合并濾液，真空濃縮后分裝，高壓滅菌即制得。上述制備方法中，優選地，所述篩為40-100目篩。上述制備方法中，優選地，所述煎煮次數為3-5次。上述制備方法中，優選地，所述真空濃縮的溫度為60-7(TC。上述制備方法中，優選地，所述高壓滅菌是在12rc滅菌30分鐘。木發明的技術原理白花蛇舌草具有清熱解毒、增強動物免疫力和抗感染能力、鎮靜、鎮痛和調節胃腸功能等作用，近年來臨床上廣泛應用于胃炎、腸炎、闌尾炎及上呼吸道感染等多種炎癥的治療和多種癌癥的輔助治療；黃芪具有促進機體免疫功能、增加白細胞和淋巴細胞數、提高淋巴細胞轉化率和巨噬細胞活性、誘生干擾素等作用，黨參可增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能，其水煎液低濃度可促進體外培養淋巴細胞的有絲分裂，并促進COnA活化的小鼠脾臟淋巴細胞DNA合成，明顯促進環磷酰胺引起的免疫抑制小鼠的淋巴細胞的轉化，增強抗體產生細胞的功能，提高抗體滴度。通過正交試驗篩選出白花蛇舌草、黃芪、黨參的最佳配方，經禽類(雞)和哺乳類(小鼠)的動物實驗證明，該免疫增強劑可全面增強動物的各種免疫功能，長期使用無任何毒副作用。與現有技術相比，本發明的優點和有益效果如下與現有化學免疫增強劑相比，本發明動物用中草藥免疫增強劑屬天然中草藥產品，無毒副作用，無有害殘留，生產無三廢，對環境無污染；與現有中草藥免疫增強劑比較，比單味中藥免疫增強劑有更全面、更廣泛的免疫調理作用，較現有復方中草藥免疫增強劑不僅組方簡單，質量更易控制，而且功效高，可明顯促進淋巴細胞增殖，顯著提高動物的體液免疫功能、促進血液中IL-2與IFN-Y等細胞因子的分泌，全面增強機體的各種免疫功能。具體實施例方式下面通過實施例進一歩說明本發明，但本發明的實施方式不限于此。4實施例1本實施例中，動物用復方中草藥免疫增強劑由以下重量配比的原料組分制備得到白花蛇舌草10g，黃芪40g,黨參40g。制備方法為先將上述原料組分粉碎，過40目篩，再按所述的重量配比混勻，加入15重量倍去離子水煎煮3次，趁熱過濾后，合并濾液，65。C真空濃縮至lg/ml后分裝，高壓滅菌即制得。本實施例中，動物用復方中草藥免疫增強劑由以下重量配比的原料組分制備得到白花蛇舌草5g，黃芪30g，黨參30g。制備方法為先將上述原料組分粉碎，過100目篩，再按所述的重量配比混勻，加入8重量倍去離子水煎煮5次，趁熱過濾后，合并濾液，6(TC真空濃縮至lg/ml后分裝，高壓滅菌即制得。實施例3本實施例中，動物用復方中草藥免疫增強劑由以下重量配比的原料組分制備得到白花蛇舌草15g，黃芪50g，黨參50g。制備方法為先將上述原料組分粉碎，過60目篩，再按所述的重量配比混勻，加入10重量倍去離子水煎煮4次，趁熱過濾后，合并濾液，7(TC真空濃縮至lg/ml后分裝，高壓滅菌即制得。現以實施例1得到的免疫增強劑為例，以雞和小鼠作為動物模型通過以下實驗來證明其對動物機體的免疫增強作用，實施例2和實施例3經類似的實驗證明具有相近的效果。一、本發明的免疫增強劑對雞的免疫增強作用實驗方法1日齡雛雞150羽，8日齡時隨機分為高(8g/kg)、中(4g/kg)、低(2g/kg)三個劑量實驗組，黃芪對照組(8g/kg)和生理鹽水空白對照組，每組30羽，體重為70.0士5.0g，灌胃給藥，空白對照組灌服等量的生理鹽水，共10d，在9日齡時免疫新城疫疫苗，14日齡時免疫法氏囊中等毒力疫苗，23日齡時再次免疫新城疫疫苗，在二次免疫后7、14、21、28d測以下各項指標外周血淋巴細胞增殖采用MTT法。將抗凝血用D-Hank，s液稀釋1倍，小心加在淋巴細胞分離液上層，2000rpm離心20min，能取中間云霧狀白細胞層，用無血清RPMI-1640營養液洗2遍，1500rpm離心15min臺盼蘭染色，細胞計數活細胞大于95%后，用RPMI-1640培養液調整細胞濃度為lxl(^個/mL(ConA終濃度10ng/mL)，加入到96孔細胞培養板中，10(HiL/孔，每個樣品重復4孔，然后置于39.5。C、5。/。C02條件下培養44h，取出每孔加入MTT10pL，繼續培養4h，然后吸棄上清，加入150^LDMSO，震蕩10min后測OD570。細胞因子含量培養外周血淋巴細胞，取上清，用ELISA試劑盒測定白介素2(IL-2)與y-干擾素(IFN-y)含量。雞新城疫HI抗體滴度每組分別隨機取10只雞，翅下靜脈采血0.5mL，分離血清，用微量血凝抑制法測定雞新城疫抗體滴度。血液生化指標每組取5只，心臟采血(2mL/只)，分離血清，測球蛋白，白蛋白、球蛋白、谷氨酰轉移酶，天門冬氨酸轉氨酶、尿酸。免疫器官指數每組取5只雞，稱重，靜脈放血處死，取脾、胸腺、法氏囊，計算免疫器官指數。實驗結果1、對雞外周血T淋巴細胞增殖的影響如表1所示，在二次免疫后7d、14d、21d，復方中草藥免疫增強劑可極顯著促進雞的外周血淋巴細胞增殖，高劑量組和中劑量組效果與黃芪對照組相比，差異極顯著(pO.Ol);28d，高、中劑量組與黃芪對照組及空白對照組相比，仍能極顯著促進雞外周血淋巴細胞增殖(pO.Ol)。表l本發明動物用復方草藥免疫增強劑對雞外周血T淋巴細胞增殖的影響(OD570)組別7d14d21d28d高劑量組0.683±0.047**AA0.347±0.040**AA0.501土0.088襯^0.564±0.069**AA中劑量組0.773±0.052**AA0.478±0.040**aa0.498±0.137**AA0,507±0.074**AA低劑量組0,576±0細**0.250±0,019**0.340±0.085**0.461±0.087黃芪對照組0.552±0細**0.269±0.026**0.376土0.055"0.425±0.085空白對照組0.375±0扁0.146±0.0280.209±0.0620.43U0.055*:與空白對照組相比，*表示0.01<<0.05，差異顯著，"表示pO.Ol,差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05,差異顯著，AA表示p0.01，差異極顯著2、對IL-2分泌量的影響如表2所示，二次免疫后7d，復方中草藥免疫增強劑各劑量組均明顯促進IL-2的產生，與黃芪對照組及空白對照組相比，差異極顯著(pO.OO，高、中劑量組促進作用最強(p<0.01);14d時，高、中劑量組和黃芪對照組促進作用最強，而高劑量極顯著的促進IL-2的產生(pO.Ol);21d時，各組都促進IL-2的產生(p<0.01)，高劑量組與黃芪對照組相比，差異顯著(p<0.05);28d時，各組促進IL-2的產生，高、中劑量組仍有顯著的促進效果(p<0.05)。表2本發明動物用復方草藥免疫增強劑對IL-2分泌量的影響(單位pg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:與空白對照組相比，*表示0.01<口<0.05,差異顯著，"表示pO.Ol，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05,差異顯著，AA表示pO.Ol，差異極顯著3、對Y-干擾素分泌量的影響如表3所示，二次免疫后7d，各組都極顯著促進IFN-Y的產生；并一直持續至免疫后21d。表3本發明動物用復方草藥免疫增強劑對y-干擾素分泌量的影響(單位pg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:與空白對照組相比，*表示0.01，<0.05，差異顯著，"表示pO.Ol,差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示pO.Ol，差異極顯著4、對雞新城疫抗體滴度的影響如表4所示，二次免疫后7d，高劑量組的抗體效價極顯著高于黃芪組(p<0.01)，顯著高于空白對照組；二免后14d，高、中劑量組的抗體效價極顯著高于對照組(p<0.01)，高劑量組的抗體效價極顯著高于黃芪組(p<0.01);21d時，高、中、低劑量組與黃芪對照組的抗體水平都高于空白對照組，高、中劑量組效果極顯著(p<0.01);28d，除低劑量組提高抗體水平不顯著外，其它各組與對照相比差異顯著，尤其高劑量組效果極顯著。表4本發明動物用復方草藥免疫增強劑對雞新城疫抗體滴度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:與空白對照組相比，*表示0.01勺<0.05，差異顯著，"表示pO.Ol，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示pO.Ol,差異極顯著6、對血清白蛋白的影響結果如表6所示，二次免疫后7d，血清白蛋白含量，中劑量組與空白對照相比，差異顯著(p<0.05)，中劑量組與黃芪對照組相比，差異極顯著(p<0.01);14d時，中、低劑量組、黃芪對照組與空白對照組相比，差異顯著(p<0.05);21d和28d時，各組差異不顯著。表6本發明動物用復方草藥免疫增強劑對血清白蛋ft的影響_組別7d14d21d28d高劑量組17.454±1.359A15.248±3.71516.170±4.17417.738±3.661中劑量組19.134±1.632*AA18.012±1.998*14.576±2,86618.588±3.102低劑量組17.030±1.82117.784±3.798*16.834±1.97121.462±1.162黃芪對照組14.430±2.37217.054i2.094*13.984±4.01421.662±2.363空白對照組15.516±2.53712.922±2.21813.220±3.42018細±4.849*:與空白對照組相比，*表示0.01"<0.05，差異顯著，"表示p〈0.01,差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示pO.Ol，差異極顯著7、對血清球蛋白的影響如表7所示，二次免疫后第7d，血清中球蛋白含量各組差異不顯著；14d時，高、中、劑量組與空白對照組相比，差異極顯著(pO.01);21d時，高、中劑量組與空白對照組相比，差異極顯著(p<0.01)，黃芪對照組與空白對照組相比，差異顯著(p<0.05);28d時，各劑量組和空白對照組相比差異不顯著。表7本發明動物用復方草藥免疫增強劑對血清球蛋白的影響_組別7d14d21d28d高劑量組23,772±4.63823.634±4,509**&'A24.218±7.823**A19.462±4.486**AA中劑量組21.872±5.85319.464±5.635**A17.580±4.261**19.730±5.496**AA低劑量組20.5卯±5-12616.582±2.768**12.208±4.1749.410±3.463黃芪對照組18.845±5.12614.432±2.534*16.324±3.844*11.854±2.644*空白對照組16.3164,5948.380±1.8988.712±1.3156.496±0.917*:與空白對照組相比，*表示0.01"<0.05，差異顯著，"表示pO.Ol，差異極顯著。與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示pO.Ol，差異極顯著。8、對血清谷草轉氨酶和血清谷丙轉氨酶的影響結果如表8和9所示，各用藥組與對照組相比，血清中的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶均沒有明顯升高，說明本發明對雞肝臟無毒副作用。表8本發明動物用復方草藥免疫增強劑對血清谷草轉氨酶的影響組別7d14d21d28d高劑量組376.020±29.311192.898±35.494**A263.740±94.449343.165±49.593中劑量組399.760±59.732234.320±54.020*A215.823±22據303.645±20.311低劑量組339.094±48.738252.623±61.337AA353.620±20.183383.380±65.652黃芪對照組339.625±98.683330.840士53.9S4274.156±58.633337.684±47.639空白對照組303.433±91.973313.謂±39.687278.561±70.635331扁±33.991與空白對照組相比，*表示0.01<口<0.05，差異顯著，**表示<0.01，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示p0.01，差異極顯著表9本發明動物用復方草藥免疫增強劑對血清谷丙轉氨酶的影響組別7d4d21d28d高劑量組4.922±1.529AA13.170±3.2199.129±2.%6A21.107±7細中劑量組6.262±1.12114.520±4.65812.556±3.346AA16.493±2.489低劑量組7.178±2.30914.166±2.36916.182±5.938黃芪對照組8.000±0.96913.551±4.32218.424±3.89516.848±4.631空白對照組7.133土0.91618.214±4.75113.455±2.79416,795±5.063*:與空白對照組相比，*表示0.01，<0.05,差異顯著，"表示pO.Ol，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示p^).01，差異極顯著9、對血清中尿酸的影響結果如表IO所示，各用藥組血清中尿酸含量與空白對照組比較沒有明顯差說明該中藥復方免疫增強劑對動物機體腎臟無毒副作用。表10本發明動物用復方草藥免疫增強劑對血清中尿酸的影響組別7d14d21d28d高劑量組中劑量組低劑量組黃芪對照組1.934±0.5921.814土1.1441.470±0.5302.130±0.2602.252±0.5912.399±0.5932.814±0.5382.749±0.4472細±0.1612.152±0.4082.166土0.6962.361土0.6491.389±0.1661.510±0.4271.399土0.1211.601士0.26S空白對照組1.587士0.3042.434土0.7922.097±0.4451.786士0.293*:與空白對照組相比，4表示0.0KpO.05，差異顯著，"表示pO.Ol，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示pO.Ol，差異極顯著二、本發明的免疫增強劑對小鼠的免疫增強作用實驗方法取小鼠64只，18-22g/只，隨機均分為4組(每組20只)。分為高劑量組(6g/kg)、低劑量組(3g/kg)、黃芪對照組(6g/kg)和生理鹽水對照組，中藥用生理鹽水稀釋相應濃度后，灌胃給藥。給藥組每只0.4mL/d，1次/d，對照組生理鹽水每只0.4mL/d，l次/d，連續10d。測定以下各項指標-巨噬細胞吞噬率和吞噬指數各組小鼠在灌胃第8d，每組取5只，每只小鼠腹腔注射4%蛋白胨溶液0.5mL，連續3d，第1ld腹腔注射20%雞紅細胞懸液lmL，間隔6h，經腹腔注射無菌生理鹽水2mL，輕揉腹部2min，隨即處死小鼠，收集腹腔液，每個載玻片上滴0.2mL(每鼠兩片)；放入37。C溫箱中孵育lh，用pH6.4的PBS液輕輕沖洗玻片。吹干，姬姆薩-瑞特染液染色。油鏡下計數200個巨噬細胞，計算巨噬細胞吞噬率和吞噬指數。血清中IL-2，IFN-Y及免疫球蛋白IgG、IgM含量測定給藥10d后各組小鼠，眼眶采血，分離血清，-2(TC保存。取上述分離到的血清，測血清中IL-2，IFN-Y及免疫球蛋白IgG、IgM含量。脾臟淋巴細胞增殖給藥10d后，每組取4只，處死小鼠，無菌采取脾臟，制成單個脾細胞懸液，調整細胞濃度為5X106/mL，用MTT法測定脾臟淋巴細胞增殖情況。實驗結果1、對小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響實驗結果表明(表ll)，在ConA和LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖中，高劑量組與空白對照組和黃芪對照組相比，差異極顯著(pO.Ol)。表ii本發明動物用復方草藥免疫增強劑對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>生理鹽水對照組_0.346±0.〗9_0.339±0.064_*:與生理鹽水對照組相比，*表示0.01，<0.05，差異顯著，**表示<0.01，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0Kp〈0.05，差異顯著，AA表示pO.Ol,差異極顯著2、對IL-2和IFN-y的影響實驗結果表明(表12)，本發明高劑量組小鼠血清中IL-2含量極顯著高于黃芪對照組和生理鹽水對照組(p<0.01)，IFN-Y的含量極顯著高于對照組(pO.Ol)。表12本發明動物用復方草藥免疫增強劑對小鼠血清中IL-2和IFN-Y的影響(單位pg/mL)組別IL-2IFN-Y高劑量組625.163±122.144**AA8卯.292士109.704**低劑量組258.942±65.586AA788.434±28.809黃芪對照組399.294±68.479**845.183±89.739*生理鹽水對照組206.848±61.103734.110±91.310*:與生理鹽水對照組相比，*表示0.01，<0.05，差異顯著，；w表示pO.Ol，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示pO.(H，差異極顯著3、對血清中免疫球蛋白IgG和IgM的影響實驗結果表明(表13)，小鼠血清中的IgG含量，高、低劑量組和黃芪組與對照組相比，差異極顯著(p<0.01)，高劑量組與黃芪對照組相比，差異顯著(p<0.05)。血清中IgM含量各個組之間沒有顯著性差異。表13本發明動物用復方草藥免疫增強劑對小鼠血清中lgG和lgM的影響(單位ng/mL)__^___高劑量組108.192±6.979**a515.834±16.004低劑量組103.208±6.454**501.375±18,501黃芪對照組100.179±4.030**504.456±29.632生理鹽水對照組_90.132±7.170_488.327±26.623_*:與生理鹽水對照組相比，t表示0.0KpO.05，差異顯著，"表示pO.Ol，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示pO.Ol，差異極顯著4、對腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響實驗結果表明(表14)，對于吞噬百分率，高、低劑量組與對照相比差異極顯著(p<0.01)，高劑量組與黃芪對照組相比，差異顯著(p<0.05);吞噬指數，高、低劑量組、黃芪對照組與生理鹽水對照組相比，差異極顯著(p<0.01)，中劑量組與黃芪對照組相比，差異顯著(p<0.05)。表14本發明動物用復方草藥免疫增強劑對小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響組別吞噬百分率(％)吞噬指數高劑量組78.312土楊2一1.205±0.153**低劑量組68.193±3.5穿*0.996±0.062**A黃芪對照組63.917±8.228*1.145±0.124**生理鹽水對照組54.898±2.9530.742±0.068*:與生理鹽水對照組相比，t表示0.0KpO.05，差異顯著，*f表示p0.01，差異極顯著與黃芪對照組相比，A表示0.0KpO.05，差異顯著，AA表示p〈0.01，差異極顯著以上性能測定實驗充分證明，本發明的動物用復方中草藥免疫增強劑可明顯促進淋巴細胞增殖，顯著提高動物的體液免疫功能、促進血液中IL-2與IFN-y等細胞因子的分泌，全面增強機體的各種免疫功能，并且對動物機體肝、腎臟無毒副作用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。權利要求1、一種動物用復方中草藥免疫增強劑，其特征在于由以下重量份的原料組分制備得到白花蛇舌草5-15份，黃芪30-50份，黨參30-50份。2、一種權利要求1所述動物用復方中草藥免疫增強劑的制備方法，其特征在于先將所述原料組分粉碎，過篩，再按所述的重量份混勻，加入8-15重量倍去離子水煎煮，趁熱過濾后，合并濾液，真空濃縮后分裝，高壓滅菌即制得。3、根據權利要求2所述動物用復方中草藥免疫增強劑的制備方法，其特征在于所述篩為40-100目篩。4、根據權利耍求2所述動物用復方中草藥免疫增強劑的制備方法，其特征在于所述煎煮的次數為3-5次。5、根據權利要求2所述動物用復方中草藥免疫增強劑的制備方法，其特征在于所述真空濃縮的溫度為60-70°C。6、根據權利要求2所述動物用復方中草藥免疫增強劑的制備方法，其特征在于所述高壓滅菌是在12rC滅菌30分鐘。全文摘要本發明公開了一種動物用復方中草藥免疫增強劑的配方及其制備方法。該復方免疫增強劑主要由以下重量份的原料組分制備得到白花蛇舌草5-15份，黃芪30-50份，黨參30-50份。制備方法是先將所述原料組分粉碎，過篩，再按所述的重量份混勻，加入8-15重量倍去離子水煎煮，趁熱過濾后，合并濾液，真空濃縮后分裝，高壓滅菌即制得。該增強劑為純中藥制劑，無毒副作用，無有害殘留，生產無三廢，對環境無污染；不僅配方簡單，而且功效高，可明顯促進淋巴細胞增殖，顯著提高動物的體液免疫功能、促進血液中IL-2與IFN-γ等細胞因子的分泌，全面增強機體的各種免疫功能。文檔編號A61K36/185GK101474272SQ20091003647公開日2009年7月8日申請日期2009年1月8日優先權日2009年1月8日發明者何子雙,孫俊穎,李春玲,王貴平,賈愛卿申請人:廣東省農業科學院獸醫研究所