專利名稱：：一種狹葉木脂素及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種天然藥物，更具體地說，本發明涉及一種從狹葉五味子提取分離得到新的木脂素。同時，本發明還涉及所述木脂素的制備方法和在制藥領域中的應用。
背景技術：
：狹葉五味子[^c力/^"^ra/犯c/尸o7/s(Rehd.etWils.)A.C.Smith]為落葉木質藤本植物，產于四川中南部、云南西部和西北部，生于海拔1000-3000米處。該植物全株可藥用，味微苦、澀、性溫，有止血接骨、去淤消腫之功效，用于趺打損傷、骨折、外傷出血等癥。果實可用于治療神經衰弱。該植物的研究結果表明其化學成分主要為木脂素、三薛、黃酮等。據文獻報道，狹葉五味子藤莖、種子的乙醇提取物，對四氯化碳引起的小鼠肝損傷，有降低血清轉氨酶的作用，尤以種子的作用明顯。最近，孫漢董等對該植物的莖葉化學成分研究發現了一系列新奇的高氧化度的降三薛，并發現該植物具有抗HIV活性。木脂素是五味子中的主要活性成分，五味子中木脂素成分具有對活性氧自由基損傷的拮抗作用、中樞神經的抑制作用，抗炎、抗胃潰瘍、抗癌及抗'HIV等活性。由于五味子科植物木脂素成分結構類型多，立體化學復雜，HI內外對該領域的研究十分活躍。
發明內容本發明通過對狹葉五味子的化學成分進行了深入研究，并對所獲得的一種新化合物進行了抗HIV-1活性和抗氧化活性篩選。在此基礎上，本發明的目的在于提供一種新的有藥用價值的新化合物或先導化合物。本發明的另一目的是提供一種所述新化合物的制備方法。本發明進一步的目的是提供所述新化合物在制備抗愛滋病(HIV)和抗氧化的藥物方面的用途。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。*除非另有說明，本發明中所釆用的百分數均為質量百分數。A.本發明從狹葉五味子中分離出了一種新化合物，該化合物用下述結構式表不HQOH該化合物被命名為狹葉木脂素S(LancifolignansS)。其中，MeO-表示甲氧基、Ac0-表示乙酰基。B.本發明提供了一種所述的狹葉木脂素的制備方法，該法采用下述步驟(1)以狹葉五味子為原料，將其藤莖晾干，粉碎到20-40目；(2)以65%~75%的丙酮用超聲提取3~5次，每次5天，期間每隔3~4小時超聲提取一次，一次0.5-1.5小時；提取液合并、過濾，減壓濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物；'(3)濾液用乙酸乙酯分2~4次萃取；合并乙酸乙酯萃取液并濃縮成浸膏，浸膏用氯仿溶解后用粗硅膠(80~100目)拌樣；(4)用200-300目的硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析粗分，將氯仿甲醇按2(hl-7:3的配比，進行梯度洗脫，收集各個部分洗脫液；洗脫液的7:3部分用高效液相色譜法分離純化，流速為2.5~3.5mL/min，以甲醇/水為流動相，逐步調整二者比例逐級細分，即得到所需的狹葉木脂素。C.對該化合物進行了抗HIV-1活性篩選，化合物顯示出良好的抗HIV-1活性，其治療指數為22.5。D.對該化合物進行了抗氧化活性篩選，化合物顯示出良好的抗氧化活性。其半數清除濃度IC50測定結果為8.22pg/L。與現有技術相比，本發明具有以下突出優點(1)狹葉五味子在我國分布廣泛，原料來源廣；而且本發明化合物在狹葉五味子中含量較高，容易得到。(2)釆用了常規柱層析和高效液相色譜結合的制備方法，化合物制備操作流程簡單，所獲得的本發明化合物純度高，隨后得工業化生產容易實現。(3)本發明化合物展現出良好的抗艾滋病和抗氧化活性，可為醫藥工業提供有藥用價值的新化合物或先導化合物。圖1是本發明化合物高分辨質譜(HRESIMS);圖2是本發明化合物的核磁共振氫譜(^麗R);圖3是本發明化合物的核磁共振炭譜(13C畫R);圖4是本發明化合物的HSQC相關譜；圖5是本發明化合物的C0SY相關譜；圖6是本發明化合物的HMBC相關譜；圖7是本發明化合物的ROESY相關譜。具體實施例方式通過下面的實施例可以使本專業的技術人員更全面地理解本發明，但并不是對本發明保護范圍的限定。實施例1以云南麗江老君山的狹葉五味子(&力"犯&<3/<3/7c//V//a(Rehd.etWUs.)A.C.Smith),為原料。將其藤莖晾千，粉碎到30目，粉碎后以70%的丙酮用超聲提取4次，每次5天，期間每隔3.5小時超聲提取一次，一次l小時；提取液合并、過濾，減壓濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物，濾液用乙酸乙酯分3次萃取；合并乙酸乙酯萃取液并濃縮成浸膏，浸膏用氯仿溶解后用粗硅膠(90目)拌樣，然后用250目的硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析粗分，用氯仿甲醇(20:1—7:3)進行梯度洗脫，收集各個部分洗脫液。洗脫液的7:3部分用高效液相色譜法分離純化，流速為3mL/min,以甲醇/水為流動相，逐步調整二者比例逐級細分，即得到所需狹葉木脂素化合物。實施例2重復實施例1的過程，但有以下不同將原料粉碎到20目；用65%的丙酮用超聲提取5次，每次5天，期間每隔4小時超聲提取一次，一次1.5小時，濾液用乙酸乙酯分4次萃取；用200目的硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析粗分，洗脫液的7:3部分用高效液相色譜法分離純化，流速為2.5mL/min。實施例3重復實施例1的過程，但有以下不同將原料粉碎到40目；用75%的丙酮用超聲提取3次，每次5天，期間每隔3小時超聲提取一次，一次O.5小時，濾液用乙酸乙酯分2次萃取；用300目的硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析粗分，洗脫液的7:3部分用高效液相色譜法分離純化，流速為3.5mL/min。表-l化合物的和13CNMR數據<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例4一一對本發明化合物結構的鑒定該化合物為白色無定形粉末，旋光，[a]2f3+6.98(c0.15,溶劑為甲醇)；紫外光譜(溶劑為甲醇)，L(log280(4.57)，205(5.62)nm;紅外光譜(溴化鉀壓片)vmax2951,2926,2815,1762，1638,1574,1558，1504，1446，，1411,1292,1208，1172，1144,1018,982，872cnf；HRESIMS(附圖-l)顯示其準分子離子峰m/z469.1836[M+Na]+(calcd469.1838)，結合NMR譜確定其分子式為C24H3。08,不飽和度為10。'H和"C應R譜(附圖-2和附圖-3,數據歸屬見表-l)顯示分子中有1個苯環，1個甲氧基(49),l個乙酰基(Sc169.88),1個甲基(S"O.87,3H,d),1個亞甲基(5C39.57),l個次甲基(Sc39.34)l兩個羥基，結合質譜數據可推斷該化合物為全對稱結構。經HSQC相關譜(附圖-4)可在每個碳信號上找到對應得氫信號。經C0SY(附圖-5)和HMBC(附圖-6)相關譜可證實該化合物的平面結構，經ROESY相關譜(附圖-7)可確定該化合物的立體構型，與SCIFINDER查詢和文獻檢索證實該化合物為新化合物。實施例5—一對本發明化合物的抗HIV活性檢測1.HIV-1感染性滴定按Johnson&Byington所述方法改良進行滴定；按Reed&Muench方法計算病毒的TCIDs。(50%TissueCultureInfectionDose)。2.樣品對C8166宿主細胞的細胞毒性檢測4x107mlC8166細胞懸液100ul與待測化合物溶液混合，設三個重復孔。同時設置不含化合物的對照孔，溫度37。C,5%0)2培養三天，釆用MTT比色法檢測細胞毒性。ELx800ELISA儀測定0D值,測定波長為595nm，參考波長為630nm。計算得到CCw值(50%CytotoxicConcentration),即對50%的正常T淋巴細胞系C8166產生毒性時的化合物濃度。3.樣品對HIV-lmB誘導C8166細胞病變(CPE)的抑制試驗將8xl07mLC8166細胞50^L/孔接種到含有100jiL/孔倍比稀釋化合物的96孔細胞培養板上，然后加入50pL的HIV-lmB稀釋上清(M.O.I.0.0016)。設三個重復孔。同時設置不含化合物的正常細胞對照孔。37°C,5%C02培養三天，倒置顯微鏡下(100x)計數合胞體的形成。EC5。(50%EffectiveConcentration)為抑制合胞體形成50%時的化合物濃度。4.樣品對HIV感染細胞的保護作用試驗將8x107mlML細胞50ul/孔接種到含有100pl/孔倍比稀釋化合物的96孔細胞培養板上，培養板的一半孔加入50jil的HIV-lmB稀釋(M.O.1.0.006),另一半孔加入50jul培養基。每個濃度梯度2個重復孔，同時設置不含化合物的對照孔和空白對照孔，37°C，5%(]02培養，第三天每孔補加100yl新鮮培養基，第五天或第六天釆用MTT比色法檢測細胞存活率。ELx800ELISA儀測定OD值,測定波長為595nm,參考波長為630nm。用公式計算出化合物對正常細胞的毒性和對HIV-1，感染細胞的保護作用。5.計算公式根據實驗結果繪制劑量反應曲線，按Reed&Muench法計算出化合物抑制病毒的50%有效濃度(EC5。)，50%抑制細胞生長濃度(CC5。)及抗HIV-1活性的治療指數TI值(Therapeuticindex)為TI=CC50/EC50。細胞生長存活率(%)=實驗孔0D值/對照孔0D值x100細胞生長抑制率(W=(l-實驗孔0D值/對照孔0D值)x100HIV-1致細胞病變的抑制率(W=(l-實驗孔合胞體數/對照孔合胞體數)x100感染細胞的保護率(°/。)=(實驗孔OD值-陽性對照孔OD值)/(陰性對照孔OD值-陽性對照孔OD值)xioo6.實驗結果實驗結果清楚地表明，該化合物顯示出一定的抗HIV-1活性，其治療指數為22.5,揭示了本發明的化合物在制備抗愛滋病的藥物中有良好的應用前景。實施例6一一化合物抗氧化活性檢測抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50pg/mL為初篩濃度，測定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一塊costar96孔板，加入新鮮配制的DPPH乙醇溶液(6.5xl05mol/L)190iuL/孔，加入待測樣品10^L/孔，空白孔加10^L生理鹽水，充分混勻，用封板膜封板后室溫下避光靜置30分鐘，于UV2401分光光度計上測定儀上測定各孔吸光度值，測定波長為517nm;樣品對脂性自由基DPPH清除率按下式計算DPPH清除率(％)=(A空白-A樣品)/A空白xlOO%A空白空白對照組吸光度值；A樣品加樣品組吸光度值。樣品平行5次檢測，計算半數清除濃度IC50,IC50測定結果為8.22pg/L，表明本發明的化合物具有良好的抗氧化活性。權利要求1.具有下述結構式的狹葉木脂素化合物2.—種權利要求l所述化合物的制備方法，其特征在于該方法釆用以下步驟U)以狹葉五味子為原料，將其藤莖晾干，粉碎到2040目；(2)以65%~75%的丙酮用超聲提取3~5次，每次5天，期間每隔3~4小時超聲提取一次，一次0.5-1.5小時；提取液合并、過濾，減壓濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物；(3)濾液用乙酸乙酯分2-4次萃取；合并乙酸乙酯萃取液并濃縮成浸膏，浸膏用氯仿溶解后用粗硅膠拌樣；(4)用200-300目的硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析粗分，將氯仿甲醇按20:1~7:3的配比，進行梯度洗脫，收集各個部分洗脫液；洗脫液的7:3部分用高效液相色譜法分離純化，流速為2.5~3.5mL/min,以甲醇/水為流動相，逐步調整二者比例逐級細分，即得到所需的狹葉木脂素。3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟3所述的粗硅膠為80~100目。4.權利要求1所述的狹葉木脂素化合物在制備治療或預防愛滋病和抗氧化的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種狹葉木脂素化合物及其制備方法和應用。該化合物具有右述結構式。本發明將狹葉五味子藤莖晾干粉碎，粉碎后以丙酮分次用超聲提取，合并提取液，過濾，減壓濃縮提取液至小體積后，靜置后濾除沉淀物，濾液用乙酸乙酯分3次萃取，獲得乙酸乙酯部分萃取液。將萃取液濃縮成浸膏，浸膏用硅膠柱層析初分，然后采用高效液相半制備色譜進一步分離，即可獲得所需化合物，對該化合物進行了抗HIV-1活性篩選，實驗結果顯示化合物顯示出良好的抗HIV-1和抗氧化活性，其HIV-1治療指數為22.5，抗氧化半數清除濃度IC50為8.22μg/L。文檔編號A61P31/00GK101555206SQ20091009435公開日2009年10月14日申請日期2009年4月15日優先權日2009年4月15日發明者云戴,李干鵬,陽楊,楊麗娟,楊海英,鵬范申請人:云南民族大學