當歸-川芎超臨界CO₂提取物中純化的有機酸部位的制備方法

專利名稱：當歸-川芎超臨界CO₂提取物中純化的有機酸部位的制備方法
技術領域：
本發明涉及傳統中草藥領域，具體涉及“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的 有機酸部位的制備方法，以及由該方法制得的有機酸部位。本發明也涉及由該有機酸部位 經冷凍干燥得到的凍干物。本發明還涉及所述有機酸部位或所述凍干物在制備抗心肌缺 血、抗血栓、降血脂和改善動脈粥樣硬化藥物中的應用。
背景技術：
當歸為傘形科植物當歸Angelica sinerisis (Oliv. ) Diels的干燥根。當歸歸肝、 心、脾經，藥性甘、辛、溫，具有補血活血，調經止痛，潤腸通便的作用。用于血虛萎黃，眩暈心 悸，月經不調，閉經痛經，虛寒腹痛，腸燥便秘，風濕痹痛，跌打損傷，癰疽瘡瘍。當歸是傳統 中藥，臨床應用廣泛，有效部位及藥理作用明確。近年來，國內外學者采用了植物化學、分子 生物學、生物化學、藥理學等技術，開展了當歸的化學成分及藥理學研究，取得長足進展，為 當歸的應用提供了依據。川芎為傘形科植物Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，具有行氣活血、祛 風止痛的功效。為活血化瘀常用中藥。其化學成分的研究，國內外報道較多。川芎主要成 分的藥理學研究表明總生物堿為川芎的主要有效部位。當歸、川芎同屬傘形科，具有相似的治療作用和相近的化學成分，臨床上作為藥 對，經常配伍使用。其配伍使用，能增加有效成分的提出，更能有效地發揮藥物功效，并減 低、制約藥物本身的毒性及副作用，符合中醫藥的七情配伍理論，臨床發揮協同作用。含當 歸、川芎配伍的使用在《中華人民共和國藥典》(2005年版一部)收載的中成藥組方達52次， 屬于頻率最高的組合。“當歸-川芎”藥對則主要通過其有苯酞類、有機酸類、生物堿類等化學成分多環 節、多途徑地作用于機體而發揮協同效應，尤其是阿魏酸等有機酸成分具有抗氧化和清除 自由基，抗血栓作用，降血脂和改善動脈粥樣硬化作用，抗菌、抗病毒作用，調節免疫，抑制 肝貯脂細胞(HSC)增殖和合成膠原作用，抗心肌缺血作用及抗肝損傷作用，成為國內、外學 者關注的熱點。目前，文獻中的報道僅局限于對當歸或川芎單味藥中有機酸及阿魏酸的研究，對 “當歸-川芎”藥對中有機酸及阿魏酸的相關研究文獻報道較少。而且，前期研究表明混 合提取所得的提取物其含量高于單獨提取(詳見本課題組之前的學位論文，許玫.復方當 歸有效部位的研究[D].上海醫藥工業研究院學位論文，2007 :58-59)，為“當歸-川芎”藥 對的混合超臨界提供依據。文獻表明具有丙二醛(MDA)生成抑制活性與抗心肌缺血、抗 血栓、降血脂和改善動脈粥樣硬化方面的活性有著密切的聯系，詳見文獻報道(鄭玉云，張 朝，郭曉華，等.超氧化物歧化酶和丙二醛在幾種心血管疾病中的變化[J].包頭醫學院學 報，2002,18(3) :175-176.；王浩，李儒漢.冠心病患者血液脂質過氧化有關酶變化的臨床 意義[J].中華心血管病雜志，1992，2(K2) :104-105.；蘇耀勛，羅顯田，容石嬋，等.心血管病患者SOD和MDA變化及其意義探討[J] ·海軍醫高專學報，1995，17 (3) :233-234.)。

發明內容
為了得到一種具有丙二醛(MDA)生成抑制活性、并且總有機酸、阿魏酸含量較高 的“當歸-川芎”超臨界ω2提取物中有機酸部位，提高現有技術有機酸部位中總有機酸和 阿魏酸的含量，使“當歸-川芎”超臨界ω2提取物中有機酸部位的提取物適合于各種劑型 的應用，本發明人對其進行了深入研究，用超臨界CO2法提取其中的有機酸部位，并用大孔 吸附樹脂富集有機酸部位，制備得到“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位 及其凍干物。本發明的目的通過以下技術方案實現第一方面，本發明提供一種“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位 的制備方法，包括如下步驟a)以“當歸-川芎”超臨界CO2總有機酸部位的提取物為原材料，用有機溶劑萃取， 得到“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位；b)以步驟a)的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位作為上柱液，用洗脫 劑經大孔吸附樹脂進行洗脫，收集含藥洗脫液，回收洗脫劑，得到“當歸-川芎”超臨界CO2 提取物中純化的有機酸部位。根據本發明，步驟a)中所述的“當歸-川芎”超臨界(X)2總有機酸部位的提取物的 制備工藝已申請專利(具體請參見CN200710045681. 3)。該提取物用有機溶劑萃取，目的是 去除小極性部分，以得到“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中的有機酸部位。以上所述的用于萃取“當歸-川芎”超臨界CO2總有機酸部位的提取物的有機溶劑 可以包括石油醚、環己烷或乙醚，優選石油醚，其中石油醚沸程可以是30-60°C或60-90°C。根據本發明，步驟b)中所述大孔吸附樹脂可以選自AB-8或DA201。根據本發明，步驟b)中所述洗脫劑為乙醇。根據本發明，步驟b)中所述上柱液的濃度為總有機酸含量為32% -48% (質量 百分比)。根據本發明，步驟b)中所述上柱液中阿魏酸質量濃度為200-360mg/mL。根據本發明，步驟b)中所述上柱液的pH值為3. 5-5. 5。根據本發明，步驟b)中所述上柱液的上柱流速為2-!3BV/h，所述洗脫劑的洗脫流 速為 0. 5-1. 5BV/h0根據本發明，步驟b)中所述上柱液的洗脫劑的濃度為35%-85% (體積百分比)。第二方面，本發明提供一種根據以上所述制備方法得到的“當歸-川芎”超臨界CO2 提取物中純化的有機酸部位。所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位采用電位滴定法測得 其總有機酸含量為總重量的58% -72%。所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位采用高效液相色譜法 測定的阿魏酸含量為總重量的30%以上。第三方面，本發明提供一種“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位 的凍干物，該凍干物由以上所述的純化的有機酸部位冷凍干燥后得到。
第四方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含根據權利要求以上所述的“當 歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位或“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純 化的有機酸部位凍干物和藥學上可接受的輔料。根據不同需要，所述藥物組合物可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、粉針或注射劑。第五方面，本發明提供所述的“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部 位或“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位凍干物在制備抗心肌缺血、抗血 栓、降血脂和改善動脈粥樣硬化藥物中的應用。因此，本發明以總有機酸、阿魏酸的含量為指標，綜合比較了多種樹脂對“當 歸-川芎”藥對的有機酸部位的吸附性能，遴選出適宜的乙醇洗脫溶液及洗脫體積，采用正 交試驗優化影響樹脂吸附的重要因素，確定了大孔吸附樹脂分離純化“當歸-川芎”超臨界 混合提取物的有機酸部位的工藝流程，并測定了由上述方法得到的“當歸-川芎”超臨界(X)2 提取物中純化的有機酸部位凍干物的MDA生成抑制活性，為進一步研究其相關藥理活性提 供了必要的前提。


圖1為“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的HPLC圖譜。
具體實施例方式以下結合實施例進一步說明本發明。應該理解的是，本發明的實施例是用于說明 本發明而不是對本發明的限制。在本發明中，提取物中的含量的測定有機酸采用電位滴定 法，阿魏酸有機酸采用HPLC法(方法參見許玫.復方當歸有效部位的研究[D].上海醫藥 工業研究院學位論文，2007 :48-50.)，MDA生成抑制活性采用小鼠服藥后的含藥血清體外 抑制肝MDA生成法。“當歸-川芎”超臨界(X)2總有機酸部位的提取物的制備步驟詳見專利申請 CN200710045681. 3，作為進一步研究的樣品。以“當歸-川芎”超臨界CO2總有機酸部位的提取物為原材料，加有機溶劑例如石 油醚、環己烷或乙醚萃取以去除小極性部分，得到“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中有機酸 部位；將其進行大孔吸附樹脂分離純化考察，采用大孔吸附樹脂按最佳條件進行洗脫，收集 洗脫液，較低溫度下回收洗脫劑，得到純化的有機酸部位。將上述有機酸部位冷凍干燥，即 得“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位的凍干物。實施例1 取“當歸-川芎”超臨界CO2總有機酸部位的提取物，加石油醚(沸程30 60°C ) 萃取以去除小極性部分，得到“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位，調節上柱液PH 值3. 5，測得其中總有機酸含量為32%，阿魏酸質量濃度為200mg/mL ；將其上柱大孔吸附樹 脂AB-8、以上柱流速2BV/h上樣、以乙醇的體積濃度35 %、洗脫流速0. 5BV/h洗脫，收集含 藥洗脫液，較低溫度下回收乙醇，得到純化的有機酸部位，電位滴定法測得其總有機酸含量 為58 %，其中，高效液相色譜法測定阿魏酸占30 %。實施例2 將實施例1得到的純化的有機酸部位冷凍干燥，即得“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的凍干物。實施例3 取“當歸-川芎”超臨界CO2總有機酸部位的提取物，加石油醚(沸程60 90°C ) 萃取以去除小極性部分，剩余“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位，調節上柱液PH 值5. 5，測得其中總有機酸含量為48%，阿魏酸質量濃度為360mg/mL ；將其上柱大孔吸附樹 脂DA201、以上柱流速!3BV/h上樣、以乙醇的體積濃度85%、洗脫流速1. 5BV/h洗脫，收集含 藥洗脫液，較低溫度下回收有機溶劑，得到純化的有機酸部位，電位滴定法測得其總有機酸 含量為72%，其中，高效液相色譜法測定阿魏酸占35%。實施例4 將實施例3得到的純化的有機酸部位冷凍干燥，即得“當歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的有機酸部位的凍干物。實施例5:取“當歸-川芎”超臨界CO2總有機酸部位的提取物，加環己烷萃取以去除小極性 部分，得到“當歸-川芎”超臨界ω2提取物中有機酸部位，調節上柱液PH值4. 2，測得其中 總有機酸含量為38%，阿魏酸質量濃度為^Omg/mL ；將其上柱大孔吸附樹脂AB-8、以上柱 流速2. 5BV/h上樣、以乙醇的體積濃度50%、洗脫流速1. OBV/h洗脫，收集含藥洗脫液，較低 溫度下回收乙醇，得到純化的有機酸部位，電位滴定法測得其總有機酸含量為62%，其中， 高效液相色譜法測定阿魏酸占32%。實施例6 將實施例5得到的純化的有機酸部位冷凍干燥，即得“當歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的有機酸部位的凍干物。實施例7 取“當歸-川芎”超臨界(X)2總有機酸部位的提取物，加無水乙醚萃取以去除小極 性部分，得到“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位，調節上柱液pH值4. 8，測得其 中總有機酸含量為40%，阿魏酸質量濃度為320mg/mL ；將其上柱大孔吸附樹脂AB-8、以上 柱流速2. 5BV/h上樣、以乙醇的體積濃度70%、洗脫流速1. OBV/h洗脫，收集含藥洗脫液，較 低溫度下回收乙醇，得到純化的有機酸部位，電位滴定法測得其總有機酸含量為68%，其 中，高效液相色譜法測定阿魏酸占32%。實施例8 將實施例7得到的純化的有機酸部位冷凍干燥，即得“當歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的有機酸部位的凍干物。實施例9 取禁食IOh的小鼠，脫頸椎處死后，快速取肝臟，用4°C生理鹽水沖液血跡后，稱 重，用4°C生理鹽水制成5%的肝勻漿。取0. 6mL肝勻漿加50 μ L待測樣品，混勻后，于37°C 水浴中放置1.證，取出后，快速加0. 6mL 20%三的三氯醋酸終止反應。混勻，3500r · mirT1 離心，取上清液1. OmL, jjp ImL 0. 67%硫代巴比妥酸，95°C水浴加熱lOmin，冷卻后于532nm 處測得吸光值，以四乙氧基丙烷為標準品，折算每克肝組織中丙二醛(MDA)的生成量。小鼠隨機分成若干組，每組動物數10只，禁食IOh后，按0. 3mL · lOg—1體重ig等 生藥量OOg生藥· lkg—1)的不同方法所得的提取物，給藥后45min摘眼球取血，分取血清50μ L，混勻后，于37°C水浴中放置1. 5h，取出后，快速加0. 6mL 20 %三的三氯醋酸終止反 應。混勻，3500r IirT1離心，取上清液1. OmL，加ImL 0. 67%硫代巴比妥酸，95°C水浴加熱 IOmin,冷卻后于532nm處測得吸光值，以四乙氧基丙烷為標準品，折算每g肝組織中丙二醛 (MDA)的生成量，并以生理鹽水組鼠為對照，計算MDA生成抑制活性。結果如下不同提取方法 超聲水提 超聲甲醇提 的提取物法法雙提法超臨界提 法超臨界提-大孔樹脂富 集純化法 (有機酸部 位)超臨界提-大孔樹脂富 集純化法 (凍干物)有機酸含量/% 阿魏酸含量/% MDA生成抑 制活性(nmol / g liver, χ土s’n=5 )6. 3 C^ L 3 245.S 27.939.7 24.944.9 27.560.2 35.162.0 37.331.48±8.79 42.25士 11.60 35.92 土9.26 45.84土8.45 51.83±9.85 53.56士 8.01結論由上表可以得知，相比現有技術得到的“當歸-川芎”提取物，本發明超臨界 CO2提取-大孔樹脂富集純化法得到的“當歸-川芎”提取物中有機酸含量和活性成分阿魏 酸含量均明顯提高。本發明方法得到的“當歸-川芎”提取物對MDA生成抑制活性也比現 有技術得到的提取物明顯提高。實施例10 對實施例1所得的“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位的凍干 物進行HPLC分析，其中8. 140min的峰為阿魏酸，標準品比對及面積歸一化法測定阿魏酸占 35%以上(見附圖1)，并按實施例9對阿魏酸測定其MDA生成抑制活性為45. 51 士6. 49，比 超臨界提-大孔樹脂富集純化法略差，說明超臨界提-大孔樹脂富集純化法所得的有機酸 中的其他有機酸對此也有藥效貢獻，說明各有機酸之間存在協同作用。實施例11 “當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位的一種制劑——片劑“當歸-川芎"超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位5g硬脂酸鎂Ig滑石粉3g微晶纖維素20g淀粉3 Ig1000 片上述組分均過100目篩備用。按上述各物料用量稱量，混勻、直接壓片或制粒干燥 后壓片、包衣、質檢即得到“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的片劑。實施例12 “當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的一種制劑——膠囊劑
權利要求
1.“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位的制備方法，包括如下步驟a)以“當歸-川芎”超臨界CO2總有機酸部位為原材料，用有機溶劑萃取，得到“當 歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位；b)以步驟a)的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位作為上柱液，用洗脫劑 經大孔吸附樹脂進行洗脫，收集含藥洗脫液，回收洗脫劑，得到“當歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的有機酸部位。
2.根據權利要求1所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟a)中所述的有機溶劑為石油醚、環己烷或無水乙醚。
3.根據權利要求2所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟a)中所述的有機溶劑為石油醚。
4.根據權利要求3所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，所述石油醚沸程選自30-60°C或60-90°C。
5.根據權利要求1所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述大孔吸附樹脂選自AB-8或DA201。
6.根據權利要求1所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述洗脫劑為乙醇。
7.根據權利要求1所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述上柱液的濃度為總有機酸含量為總重量的32-48重 量％。
8.根據權利要求1所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述上柱液中阿魏酸質量濃度為200-360mg/mL。
9.根據權利要求1所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述上柱液的pH值為3. 5-5. 5。
10.根據權利要求1所述的“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述上柱液的流速為2-!3BV/h。
11.根據權利要求10所述的“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位的 制備方法，其特征在于，步驟b)中所述洗脫劑的流速為0. 5-1. 5BV/h。
12.根據權利要求1所述的“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述洗脫劑的濃度為35-85體積％。
13.根據權利要求1-12任何一項制備方法得到的“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中 純化的有機酸部位。
14.根據權利要求13所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位，其 特征在于，采用電位滴定法測得其總有機酸含量為總重量的58% -72%。
15.根據權利要求13所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位，其 特征在于，采用高效液相色譜法測定的阿魏酸含量為總重量的30%以上。
16.“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的有機酸部位的凍干物，其特征在于，其由 權利要求13所述的純化的有機酸部位冷凍干燥后得到。
17.藥物組合物，其包含根據權利要求13所述的“當歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純 化的有機酸部位或根據權利要求16所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位凍干物。
18.根據權利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為片劑、膠囊、 顆粒劑、粉針或注射劑。
19.權利要求13所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位或權利 要求16所述的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位凍干物在制備抗心肌 缺血、抗血栓、降血脂和改善動脈粥樣硬化藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開一種“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位的制備方法，包括如下步驟a)以“當歸-川芎”超臨界CO2總有機酸部位的提取物為原材料，用有機溶劑萃取，得到“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位；b)以步驟a)的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中有機酸部位作為上柱液，用洗脫劑經大孔吸附樹脂進行洗脫，收集含藥洗脫液，回收洗脫劑，得到“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位。本發明提供的“當歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的有機酸部位具有含有效成分量高等特點。
文檔編號A61K36/236GK102038726SQ20091019696
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月10日 優先權日2009年10月10日
發明者馮敬騫, 楊義芳 申請人:上海醫藥工業研究院