含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩種的中成藥的檢測方法

專利名稱：含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩種的中成藥的檢測方法
技術領域：
本發明提供了一種藥物中有效成分的檢測方法，其為一種中藥有效成分的檢測方 法，尤其是指含有白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎、當歸中的兩種或兩種以上藥材成分的 中藥制劑中有效成分的檢測方法。
背景技術：
中藥復方是中醫臨床用藥的主要形式和手段，方中各味藥又含有多種化學成分， 這些固有的化學成分是復方發揮藥效作用的物質基礎，但方中任一活性成分又不能全面反 映中醫用藥所體現的整體療效，這是中藥復方與化學合成藥品在制定質量標準過程中的根 本區別，所以宏觀的綜合分析成為中藥復方發展的必然趨勢。中藥復方作為中醫藥的精髓， 已應用了上千年，從現代研究的角度，一個中藥復方具有多成分、多作用、多靶點等特點。在 “素問”至真要大論中記載“主病之謂君，佐君之謂臣，應臣之謂使”。隨著中藥現代化、國 際化的深入發展，迫切需要建立一種對中藥和中藥復方產品從原料到成品進行質量控制以 及對其復雜成分檢出的方法，指紋圖譜應運而生。“指紋”(finger printing)鑒定來源于法醫學，每個人的指紋在微小的細節構造 中各有不同。依據這些差異，通過“比對”方式，可以確定鑒別每個人的特征。隨著現代生 物技術的發展，出現了 DNA指紋圖譜。通過DNA指紋圖譜分析，能對人、動物、植物等生物體 進行鑒別鑒定。植物藥在質量控制方面使用指紋圖譜(尤其是色譜指紋圖譜)發軔于20世紀70 年代。當前的中藥指紋圖譜(fringerprinting)借用DNA指紋圖譜發展而來，是一種綜合 的、可量化的色譜鑒定手段。最先發展起來的是中藥化學成分色譜指紋圖譜，特別是高效液 相色譜(HPLC)指紋圖譜。HPLC具有很高的分離度，可把復雜的化學成分進行分離而形成高 低不同的峰組成一張色譜特，這些色譜峰的高度和峰面積分別代表了各種不同化學成分和 其含量，和藥效研究結果聯系就會產生中藥譜效學。很多中成藥是由多種藥味組成的，例如同仁烏雞白鳳丸由十九味藥材組成，藥材 涉及面廣，化學成分復雜，僅僅靠其十幾個活性成分作為其質量控制指標，難于全面控制中 成藥丸的內在質量狀況，更不能對其真偽優劣做出判斷。因此，利用建立色譜指紋圖譜來控 制其質量比薄層鑒別、含量測定等常規標準更加全面客觀。

發明內容
針對現有技術在中藥成分檢測方面存在的缺陷。發明人經過大量的實驗，研究了 一種中藥制劑中同時鑒別處方多種藥材的檢測方法，結果證明，與傳統的薄層色譜鑒別方 法相比，本發明的方法避免現有方法需要分別制備供試品溶液和對照藥材溶液，再采用不 同的展開劑系統分別實驗的缺點，鑒定結果也更客觀準確。本發明的貢獻在于發明人將指紋圖譜應用于中藥制劑質量的整體分析與評價。
4以同仁烏雞白鳳丸為例，采用HPLC方法建立同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)制劑指紋圖譜，為 中藥指紋圖譜分析提供新的思路。本發明的目的是提供一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩種 成分的中成藥的檢測方法，通過該方法可以得到準確的結果，且盡可能避免了其他雜質干 擾。本發明提供一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩種成分的中 成藥的檢測方法，該方法包括(1).供試品溶液的制備，稱取供試品，加入相當于供試品5-10倍量的甲醇，溶解， 濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加與上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通過大孔樹脂 吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脫，棄去水液，再用15-45% wt的與上述甲醇等量 的乙醇洗脫，棄去洗脫液，繼用75-95% wt的為上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脫，收集洗脫 液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并移至量瓶，加甲醇至刻度，過微孔濾膜，取續濾液，制成供試品 溶液；(2).對照藥材溶液的制備，分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至 少兩種對照藥材各lg，與供試品溶液同法制成對照藥材溶液；(3).色譜條件，以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按照不同比例的A B洗脫； 檢測波長為201-290nm ；(4).測定，吸取上述溶液各10μ L，注入液相色譜儀，測定；(5).結果檢測，在供試品的色譜中，在與對照藥材色譜相同保留時間的位置上，檢 視是否分別有相應的色譜峰。上述步驟(1)中過濾用的微孔濾膜優選為0.2 0.75 μ m的微孔濾膜，更優選 0. 4 0. 5 μ m的微孔濾膜.本發明的檢測方法采用樣品先經過前處理再用高效液相色譜的檢測方法，改變了 通常對液相色譜中含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川彎和當歸中至少兩種藥材的樣品處理 方法，成功地消除了中成藥制劑中待測成分以外的液相圖譜中的雜峰，結果更精確穩定。本發明提供的上述一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩種成 分的中成藥的檢測方法，具體步驟包括1.供試品溶液的制備精密稱取供試品(例如6g)，加入相當于供試品5-10倍量 的甲醇(優選相對于6g供試品，甲醇量為約50mL)，溶解，優選超聲處理(功率300W，頻率 50kHz) 30分鐘，濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加與上述甲醇等量的水使溶解，放冷， 通過DlOl型大孔樹脂吸附柱(裝柱的樹脂約60g，內徑2cm，長12cm)，以大約是上述甲醇 量的2-10倍的水(優選5-7倍于甲醇，例如甲醇量約50mL，則水大約300mL)洗脫，棄去水 液，再用15-45% wt (優選30% wt)的與上述甲醇等量的乙醇(例如300mL)洗脫，棄去洗 脫液，繼用75-95% wt (優選80% wt)的約為上述甲醇量的2-6倍的(優選3_5倍于甲醇) 乙醇(例如甲醇量約50mL，則該乙醇大約200mL)洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解 并轉移至量瓶中(例如供試品為6g，則優選量瓶為4-6mL，更優選5mL量瓶)，加甲醇至刻 度，過微孔濾膜(優選0. 45 μ m的微孔濾膜)，取續濾液，制成供試品溶液；2.對照藥材溶液的制備分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎、當歸中至少 兩種對照藥材各lg，與供試品溶液同法制成對照藥材溶液；
3.色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，進行按照由100% wt的B依次減少B的量增加A的量直至100% wt的A的次序的梯度洗脫；梯度洗脫的時間為100-150分鐘；檢測波長為201-290nm，優選 203-180nm，例如檢測波長約為203nm(當檢測白芍、人參、甘草和/或青蒿時)，檢測波長優 選約280nm(當檢測丹參、川芎和/或當歸時)；4.測定照高效液相色譜法(附錄VI D)試驗，精密吸取上述溶液各10μ L，注入 液相色譜儀，測定；5.結果檢測在供試品的色譜中，在與對照藥材色譜相同保留時間的位置上，檢 視是否分別有相應的色譜峰，且紫外光譜相一致。若供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相同保留時間位置上，分別有相應 的色譜峰，且紫外光譜相一致，則可以判斷該供試品(樣品)中含有對照品的藥材或者藥材 成分；進一步根據峰的面積可以折算該供試品(樣品)中含有對照品的藥材或者藥材成分 的含量。本發明所涉及的供試品是指含有白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少 兩種成分的中成藥(制劑)。本發明上述的檢測方法中，還優選包含另一對照溶液的制備的步驟，即對照品溶 液的制備的步驟，該對照品溶液的制備具體包括稱取與對照藥材相對應的對照品，加甲醇 制成對照品溶液，過0. 45 μ m微孔濾膜，取續濾液再制成對照品溶液；該對照品選自芍藥 苷、甘草苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rf、丹參酮IIA、黃芪甲苷、芒柄花素中至少一種。當上述的檢測方法為檢測含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸的中成藥的 方法時，所述的對照品溶液的制備包括加甲醇制成每ImL分別含芍藥苷0. 06mg/mL、甘草苷 0. 02mg/mL、人參皂苷Rb1O. 2mg/mL、丹參酮II AO. 016mg/mL的溶液作為對照品溶液；將對照 品溶液進行所述步驟⑶和⑷的檢測，得到對照品的指紋圖譜，然后在所述步驟(5)的結 果檢測中，在供試品的色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相同保留時間的位置上，檢視是 否分別有相應的色譜峰。以烏雞白鳳丸為例，商品購自同仁堂公司生產的烏雞白鳳丸(水蜜丸)；該烏雞白 鳳丸(水蜜丸)中成藥中有效成分的檢測方法包括1.供試品溶液的制備精密稱取烏雞白鳳丸(例如6g)，加入相當于供試品5-10 倍量的甲醇(優選50mL)，溶解，優選超聲處理，濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加與 上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通過DlOl型大孔樹脂吸附柱，以約為上述甲醇量的2-10 倍的水洗脫，棄去水液，再用15-45% wt的大約與上述甲醇等量的乙醇洗脫，棄去洗脫液， 繼用75-95% wt的約為上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶 解并轉移至量瓶中(例如優選量瓶為4-6mL)，加甲醇至刻度，過微孔濾膜(0. 25-0. 5 μ m的 微孔濾膜)，取續濾液，制成供試品溶液；2.對照藥材溶液的制備分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川彎、當歸對照藥 材各lg，與供試品溶液同法制成對照藥材溶液；3.色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流 動相A，以水為流動相B，進行按照由100% wt的B依次減少B的量增加A的量直至100% wt的A的次序的梯度洗脫；梯度洗脫的時間為100-150分鐘；檢測波長為201-290nm，優選203-180nm，例如檢測波長約為203nm(當檢測白芍、人參、甘草和青蒿時)，檢測波長優選約 280nm(當檢測丹參、川芎和當歸時)；4.測定照高效液相色譜法(附錄VI D)試驗，精密吸取上述溶液各10μ L，注入 液相色譜儀，測定；5.結果檢測在供試品的色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相同保留時間的位 置上，檢視是否分別有相應的色譜峰，且紫外光譜相一致。若供試品色譜中，在與對照藥材色譜相同保留時間位置上，分別有相應的色譜峰， 且紫外光譜相一致，則可以判斷該供試品(樣品)中含有對照品的藥材或者藥材成分；進一 步根據峰的面積可以折算該供試品(樣品)中含有對照品的藥材或者藥材成分的含量。上述檢測方法的步驟1中，即供試品溶液的制備，在通過DlOl型大孔樹脂吸附柱， 以水洗脫，水液中含有供試品中含有的糖類成分，該糖類成分會對HPLC的圖譜峰造成干 擾，所以本發明選擇棄去水液，再用15-45% wt的乙醇洗脫，本發明的預試驗顯示，這部分 洗脫下來的成分與80% wt乙醇洗脫的流分的指紋圖譜重合，因此不可避免也將對檢測結 果造成干擾，因此本發明選擇棄去15-45% wt的乙醇洗脫的洗脫液，繼用75-95% wt的乙 醇洗脫，多次預試驗的結果顯示，這部分洗脫液的色譜峰最多，因此本發明收集75-95% wt 的乙醇洗脫的洗脫液。以烏雞白鳳丸為例，該烏雞白鳳丸(水蜜丸)中成藥中有效成分的檢測方法基本 同上，同樣可以檢測供試品的中成藥即烏雞白鳳丸(水丸)中是否含有對照品的藥材以及 其在中成藥中的成分含量。本發明主要采用了中成藥中有效成分的對照品藥材以及對照品(相當于純品)用 高效液相的方法制作指紋圖譜，再與含有有效成分的中成藥制劑的高效液相圖譜相比較， 即可對比出該中成藥制劑中是否含有上述有效成分。在本發明的優選實施例中，以烏雞白鳳丸(水蜜丸)為例，該烏雞白鳳丸(水蜜 丸)中成藥中有效成分的檢測方法包括1.供試品溶液的制備取烏雞白鳳丸，研細，精密稱取6g，加入甲醇50mL，超聲處 理(功率300W，頻率50kHz) 30分鐘，放冷，濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水50mL 使溶解，放冷，通過DlOl型大孔樹脂吸附柱約60g(內徑2cm，長12cm)，以水300mL洗脫，棄 去水液，再用30%乙醇300mL洗脫，棄去洗脫液，繼用80%乙醇200mL洗脫，收集洗脫液，蒸 干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，過0. 45 μ m微孔濾膜，取續濾 液，制成供試品溶液；2.對照藥材溶液的制備分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎、當歸對照藥材 各lg，同法制成對照藥材溶液；也可以同時制備對照品溶液的制備分別取對照品適量，加甲醇制成每ImL分別 含芍藥苷 0. 06mg/mL、甘草苷 0. 02mg/mL、人參皂苷 Rb1O. 2mg/mL、丹參酮 II A 0. 016mg/mL 的溶液，作為對照品溶液；例如分別取對照品芍藥苷、甘草苷、人參皂苷Rb1、丹參酮IIA，加甲醇制成每ImL 分別含芍藥苷0. 06mg/mL、甘草苷0. 02mg/mL、人參皂苷Rb1O. 2mg/mL、丹參酮II A 0. 016mg/ mL的溶液，作為對照品溶液；3.色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流
7動相A，以水為流動相B，梯度洗脫的時間為100-150分鐘；按下表進行梯度洗脫；檢測波長 為201-205nm(優選203nm)，該波長下主要檢測白芍、人參、甘草、青蒿等藥材或者藥材成 分，以及波長255-290nm，優選270-285nm，該波長下主要檢測丹參、川芎、當歸等藥材或藥 材成分； 表HPLC流動相梯度
時間(min)流速(ml/min·1) A (乙腈)％B (水)％
0 0100~~
1010100
3011090 7013070
10015050
12017030
12111000 126110004.測定法照高效液相色譜法(附錄VI D)試驗，精密吸取上述溶液各10 μ L，注 入液相色譜儀，測定。5.結果檢測供試品色譜中，在與對照藥材(或同時與對照品)色譜相同保留時 間位置上，分別有相應的色譜峰，且紫外光譜相一致。本發明的同時含有白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎、當歸中的兩種或兩種以上 藥材成分的中藥制劑中有效成分的檢測方法是發明人在大量的實驗摸索和篩選數據的基 礎上建立的，所述的實驗摸索和篩選數據的工作大致如下(以烏雞白鳳丸(同仁堂生產的 水蜜丸)為例)1、分析方法的建立和影響因素的考察。1. 1樣品提取條件的選擇實驗分別考察了不同種類的提取溶劑如甲醇，乙醇、水；不同比例的提取溶劑如 30% wt甲醇、50% wt甲醇、70% wt甲醇；不同的提取方法如超聲，熱回流，索氏提取。結果 表明，不同比例甲醇溶劑提取的色譜圖中甲醇提取法所得色譜峰較多。同時考察了正丁醇 萃取和甲醇提取的供試品溶液，在上述色譜條件下測定指紋圖譜，兩種方法的色譜圖無本 質的區別。故本實驗采用甲醇提取法，確保同仁烏雞白鳳丸中的多種成分能夠體現在指紋 圖譜中。同仁烏雞白鳳丸由19味藥材組成，是一個復雜的復方制劑，甲醇提取物色譜圖峰 多但分離不佳，根據同仁烏雞白鳳丸成品中各主要有效成分極性各不相同，故考察了由高 極性至低極性過大孔樹脂柱，收集不同比例乙醇洗脫物分離各極性部位及由低極性至高極 性采用不同溶劑(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇)索氏提取，收集不同部位提取物兩種分離 方法。不同部位索氏提取物所得色譜圖中色譜峰重疊嚴重，且基線不平，色譜峰不能得到很 好分離。采用過大孔樹脂柱法所得色譜峰多且分離良好。在考察了不同比例乙醇洗脫物的 色譜峰特征后，最終確定了乙醇洗脫液比例。1. 2大孔樹脂類型的選擇采用D-101型大孔樹脂與ΑΒ-8型大孔樹脂分離樣品。后者分離皂苷類化學成分 效果不佳，供試品皂苷類有效成分較多，故選擇D-101型大孔樹脂。1. 3流動相及洗脫方式的優化
同仁烏雞白鳳丸所含成分較多，性質差異較大，采用等度洗脫的方式很難在短 時間內將其有效成分洗脫和分離，因而采用梯度洗脫程序來分離同仁烏雞白鳳丸中的成 分。在流動相系統的選擇中，根據原料藥材有效成分類別及所占比例，大都為乙腈-水、 乙腈_酸系統。于是分別考察了乙腈_水、乙腈-0. 5 %冰醋酸、乙腈-0. 1 %冰醋酸、乙 腈-0. 甲酸梯度洗脫色譜系統。結果表明，在乙腈-酸系統中，色譜峰基線噪音干擾嚴 重；在乙腈-水系統中，色譜峰得到較好的分離，基線平穩。故采用乙腈-水系統作為流動 相。1. 4檢測波長的選擇上述色譜條件下，在200 400nm范圍內對供試品溶液進行光譜掃描，根據樣品 3D色譜圖，以選取能給出最多色譜峰信息的檢測波長。而經試驗發現單一波長下難于保留 該復方的色譜指紋圖譜所有主要指紋峰。在203nm和280nm處色譜峰信息多、較為集中， 基線比較平穩，且此兩個波長下圖譜保留了其他波長的主要指紋峰。故最優選取203nm及 280nm波長作為檢測波長，也根據中成藥的種類、批次不同，以及實驗條件的差異，也可以選 擇201-290nm的波長作為檢測波長。1. 5參照物的選擇在280nm下丹參中的一個成分的色譜峰與其他色譜峰分離良好，保留時間適宜， 峰型穩定；峰純度檢查表明該色譜峰為單一組分，故280nm下選擇此峰作為參照峰，其余各 色譜峰均與其比較計算相對保留時間和相對峰面積比值。在203nm下甘草中的一個成分的 色譜峰與其他色譜峰分離良好，峰型穩定；峰純度檢查表明該色譜峰為單一組分，故203nm 下選擇此峰作為參照峰，其余各色譜峰均與其比較計算相對保留時間和相對峰面積比值。當供試品中不含有丹參和/或甘草時，也可以根據組分單一、分離良好，峰型穩定 等標準進行篩查，挑選出合適的色譜峰作為參照峰。1. 6測定方法吸取供試品溶液10 μ L，注入HPLC色譜儀，另吸取甲醇溶劑10 μ L作為空白溶液注 入HPLC，結果表明在203nm下有溶劑峰但不干擾色譜峰歸屬，280nm下無溶劑峰干擾。2、方法學考察2. 1精密度實驗取同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸，批號4030220)，制備供試品溶液，連續進樣6次，測得 各共有峰相對保留時間和相對峰面積。各共有峰相對保留時間穩定，各共有峰相對峰面積的RSD小于3%。符合《中藥注 射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》精密度試驗的有關規定。2. 2重復性試驗取同一批號(4030220)同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)6份，精密稱定，按“2”項下方 法制備供試品溶液，分別進樣，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積。各共有峰相對保留時間穩定，各共有峰相對峰面積的RSD小于3%，符合《中藥注 射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》重復性試驗的有關規定。2. 3穩定性試驗取同一供試品溶液(同上)，分別在0，4，8，12，16，20，24h進樣，測 得各共有峰相對保留時間和相對峰面積。通過對同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)樣品HPLC指紋圖譜的研究表明，建立同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)HPLC指紋圖譜方法是可行的。該方法穩定、重現性好，可作為同仁烏雞白 鳳丸質量控制的標準之一。3、同仁烏雞白鳳丸HPLC指紋圖譜的繪制與特征色譜峰紫外光譜指認3.1指紋圖譜的繪制。精密吸取同仁烏雞白鳳丸供試品溶液10 μ L，注入HPLC儀，按上述條件測定，記錄 色譜圖。結果見圖1及圖2。其他對照藥材的指紋圖譜暫欠奉。本發明中除了特殊標注和說明外，其他溶劑的濃度(包括百分比濃度％ )均為質 量濃度(％ wt)。本發明所檢測的中成藥為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩種 的中成藥制劑，優選為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸的中成藥制劑，包括烏雞 白鳳丸和/或在烏雞白鳳丸基礎上的改劑型的中藥制劑，該改劑型的中藥制劑包括含有烏 雞白鳳丸的中藥組方的制劑。例如本發明所檢測的中成藥包括烏雞白鳳丸的水蜜丸、烏雞 白鳳丸的水丸、烏雞白鳳膠囊和/或烏雞白鳳口服液。本發明的檢測方法采用樣品先經過前處理再用高效液相色譜的檢測方法，改變了 通常對液相色譜中含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和/或當歸藥材的樣品處理方法， 成功地消除了制劑中待測成分以外的液相圖譜中的雜峰，本發明的創新性技術尤其在于成 功地開發了對含有多位中藥的中成藥制劑進行一次檢測即可對比得到檢測結果的技術，并 且使檢測結果更精確穩定。


圖1 同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)的HPLC指紋圖譜(檢測波長203nm)。圖2 同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)的HPLC指紋圖譜(檢測波長280nm)。其中，圖1和圖2上標注了標號為1 19的共19個峰，該19個峰及其相對與17 號峰的相對保留時間共同組成了同仁烏雞白鳳丸(水蜜丸)的HPLC指紋圖譜。
具體實施例方式以下結合附圖和實施例詳細說明本發明，但不限定本發明的實施范圍。實施例一.同仁烏雞白鳳丸(大蜜丸，同仁堂制藥)的質量檢測方法色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動 相A，以水為流動相B，按下表進行梯度洗脫；檢測波長為203nm(白芍、人參、甘草、青蒿藥 材)，280nm(丹參、川芎、當歸藥材)。表HPLC流動相梯度
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權利要求
1.一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩種的中成藥的檢測方法， 該方法包括(1).供試品溶液的制備，精密稱取供試品，加入相當于供試品5-10倍量的甲醇，溶解， 濾過，濾液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加與上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通過大孔樹脂 吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脫，棄去水液，再用15-45% wt的與上述甲醇等量的 乙醇洗脫，棄去洗脫液，繼用75-95% wt的為上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脫，收集洗脫液， 蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至量瓶中，加甲醇至刻度，過微孔濾膜，取續濾液，制成供試品 溶液；(2).對照藥材溶液的制備，分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩 種對照藥材各lg，與供試品溶液同法制成對照藥材溶液；(3).色譜條件，以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按照不同比例的A:B洗脫；檢測波 長為 201-290nm ；(4).測定，吸取上述溶液各10P L，注入液相色譜儀，測定；(5).結果檢測，在供試品的色譜中，在與對照藥材色譜相同保留時間的位置上，檢視是 否分別有相應的色譜峰。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其中，所述的供試品溶液的濃度為每ml相當于供試 品 0. l-10g。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其中，步驟(3)所述的檢測波長為203-280nm。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其中，步驟(3)所述的流動相為以乙腈為流動相A， 以水為流動相B，按照由100% wt的B依次減少B的量增加A的量直至100% wt的A的次 序進行梯度洗脫。
5.如權利要求1所述的檢測方法，其為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川彎和當歸的 中成藥中有效成分的檢測方法，其中，步驟⑵為分別取白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎 和當歸對照藥材各lg制成對照藥材溶液。
6.如權利要求1所述的檢測方法，其中，該檢測方法還包含對照品溶液的制備的步 驟，該對照品溶液的制備為稱取與對照藥材相對應的對照品，加甲醇制成對照品溶液，過 0. 45um微孔濾膜，取續濾液再制成對照品溶液；該對照品選自芍藥苷、甘草苷、人參皂苷 Rh、人參皂苷Rf、丹參酮IIA、黃芪甲苷、芒柄花素中至少一種。
7.如權利要求6所述的檢測方法，其為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川彎和當歸的 中成藥的檢測方法，其中，所述的對照品溶液的制備中，包括加甲醇制成每lmL分別含芍藥 苷 0. 06mg/mL、甘草苷 0. 02mg/mL、人參皂苷 RbA 2mg/mL、丹參酮 II A 0. 016mg/mL 的溶液 作為對照品溶液；將對照品溶液進行所述步驟(3)和(4)的檢測，得到對照品的指紋圖譜， 然后在所述步驟(5)中，在供試品的色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相同保留時間的 位置上，檢視是否分別有相應的色譜峰。
8.如權利要求1-7任一項所述的檢測方法，其為含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎 和當歸的中成藥的檢測方法，其中，步驟(4)是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈 為流動相A，以水為流動相B，梯度洗脫的時間為100-150分鐘；檢測波長在201-205nm下檢 測白芍、人參、甘草、青蒿，檢測波長在255-290nm檢測丹參、川芎、當歸。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其中，所檢測的中成藥包括在烏雞白鳳丸和/或含有烏雞白鳳丸的中藥組方的中藥制劑。
10.如權利要求9所述的檢測方法，其中，所檢測的中成藥包括烏雞白鳳丸的水蜜丸、 烏雞白鳳丸的水丸、烏雞白鳳膠囊和/或烏雞白鳳口服液。
全文摘要
本發明提供了一種含白芍、人參、丹參、青蒿、甘草、川芎和當歸中至少兩種的中成藥的檢測方法，包括制備供試品溶液、對照品藥材溶液，以乙腈∶水作為流動相，檢測波長為201-290nm，進行HPLC的測定；結果檢測是在供試品的色譜中，在與對照藥材色譜相同保留時間的位置上，檢視是否有相應的色譜峰；本發明的檢測方法與傳統的薄層色譜鑒別方法相比，改變了通常對液相色譜中含多種藥材的樣品處理方法，成功地消除了中成藥制劑中待測成分以外的液相圖譜中的雜峰，結果更精確穩定。
文檔編號A61P15/00GK101991661SQ200910166478
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月19日 優先權日2009年8月19日
發明者李志猛, 林瑞超, 王鋼力, 聶黎行, 范國強, 陳佳 申請人:中國藥品生物制品檢定所