Rna干涉效果強的雙鏈脂質修飾rna的制作方法

專利名稱：Rna干涉效果強的雙鏈脂質修飾rna的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠有效地抑制靶基因表達的雙鏈脂質修飾RNA。更具體而言，本 發明涉及一種核酸酶抗性及細胞內導入率高、并且能夠產生優異的RNA干涉效果的雙鏈脂 質修飾RNA。并且，本發明涉及利用該雙鏈脂質修飾RNA的藥物組合物及抑制靶基因表達的 方法。
背景技術：
有效地治療癌癥和AIDS等難治疾病的藥物開發是生命科學領域中的一個重大課 題。作為能夠攻克上述課題的一種有效的方法，是使用只作用于特定基因的基因藥物。上 述基因藥物中，特別是利用21個堿基的短雙鏈RNA(small interfering RNA :siRNA)的RNA 干涉(RNAinterference =RNAi)法最近受到關注。上述RNAi法在1998年由Fire等人首次 報道(參見非專利文獻1)。根據Fire等人的報道，通過將與欲抑制功能的基因的特定區域 同源的100個堿基對左右的雙鏈RNA導入細胞內，在細胞質內通過切酶(Dicer)的作用被 分解成20 25個堿基對左右的雙鏈RNA，之后與多種蛋白質復合，形成RNA/蛋白質復合 體(該復合體稱作RICS RNA誘導沉默復合體)，所述的復合物與由靶基因產生的mRNA的 同源位點結合，從而強力地抑制基因表達。但是，據報道當將約30個堿基對以上的長雙鏈 RNA導入哺乳細胞中時，作為抗病毒應答反應的干擾素應答被誘導，結果導致細胞凋亡的現 象。認為RNA法難以適用于哺乳動物細胞系。因此，Tuschl等人化學合成了在雙鏈RNA的 兩個3’末端具有懸端(dangling end)的21個堿基長度的雙鏈RNA，并且報道當將上述雙 鏈RNA直接導入哺乳動物細胞內時，該雙鏈RNA能夠避免干擾素應答，顯示出序列特異性地 強的基因表達抑制能力(參見非專利文獻2)。另外，Tuschl等人合成了雙鏈區域為19個 堿基對、在3’末端或5’末端具有各種長度的懸端鏈的短雙鏈RNA，并且研究了它們的RNA 干涉效果。結果觀察到在兩個3’末端具有2個堿基的懸端的21個堿基長度的siRNA顯示 出非常高的RNA干涉效果，而在除此之外的所有類型的短雙鏈RNA中，沒有觀察到顯著的 RNA干涉效果。根據上述報道，目前通常采用下述RNA干涉法，其使用21個堿基長度、在兩 個3’末端具有2個堿基懸端的雙鏈RNA。此處為了與RNAi法相區別，將使用21個堿基長 度的短雙鏈RNA來抑制靶基因表達的方法稱作“siRNA法”。由于上述siRNA法使用合成的RNA，所以也比較容易制備樣品，處理操作也簡單， 并且能夠顯示非常強的效果，因此，siRNA法不僅在生命科學領域，在生物技術商業領域也 廣泛受到關注。但是，上述優異的siRNA法也存在必須要解決的問題。如上所述，siRNA由RNA分 子構成，因細胞內及培養基中含有的核酸酶的作用而被迅速地分解。另外，雙鏈RNA區域與 單鏈RNA相比，顯示出比較高的核酸酶抗性，但由19個堿基對組成的雙鏈RNA幾乎不顯示 已知的RNA干涉效果。因此，有報道稱，當被導入含有靶基因序列的細胞內后，雖然合成的 siRNA在大約2天 4天的時間里顯示強基因表達抑制效果，但之后其RNA干涉效果急劇減 弱，到7天左右RNA干涉效果幾乎完全消失。
最近，為了使合成的siRNA中獲得優異的細胞導入率和長時間高活性的RNA干 涉效果，報道了各種化學修飾型siRNA。例如，為了獲得對核酸外切酶消化的抗性，合成了 siRNA的末端用氨基、巰基或脫堿基位點等修飾的siRNA。但是，已經有報道稱，大部分修飾 了末端的21個堿基長度的siRNA具有顯著減弱的RNA干涉效果。另一方面，近年來根據J. Rossi等人的報道，可知27個堿基對組成的雙鏈RNA與 21個堿基長度的siRNA相比顯示出高100倍左右的RNA干涉效果(參見非專利文獻3)。一 般認為這是由于由27個堿基對組成的RNA被RNase III樣酶的切酶切割成21個堿長度的 siRNA后，被蛋白質復合體RISC直接識別，可以高效地發揮siRNA效果。如上所述，由于27個堿基長度的RNA可以產生優異的RNA干涉效果，所以今后更 加期待其作為基因藥物的應用。但是，完全不清楚何種技術方法對進一步增強27個堿基長 度的RNA產生的RNA干涉效果有效。此外，也不清楚何種技術方法可提高具有RNA干涉效 果的27個堿基長度的RNA或其他堿基長度的RNA的RNA干涉效果。另外，具有RNA干涉效果的雙鏈RNA，通常采用末端具有懸端的結構，對末端不具 有懸端的結構(即，具有平滑末端的結構)也進行了 RNA干涉效果的研究。但是結果表明， 在有義鏈RNA的5’末端側為平滑末端的結構與在有義鏈RNA的5’末端側具有懸端的結構 相比，RNA干涉效果幾乎沒有變化或RNA干涉效果較低(參見非專利文獻4)。另一方面，已知脂質對細胞膜的親和性及透過性高，對向細胞內轉運藥物有用。期 待通過將此脂質與具有RNA干涉效果的雙鏈RNA連接，可提高細胞內導入率，更有效地產生 RNA干涉效果。但是，已知具有RNA干涉效果的雙鏈RNA與脂質簡單地連接時，會導致RNA 干涉效果的顯著減弱。目前的現狀是，在現有技術中尚未構建兼有優異的RNA干涉效果與 基于脂質的有用效果的脂質修飾的RNA。非專利文獻1 iFire et al.，Nature，391，806-811 (1998)非專利文獻2 :Tuschl et al.，EMBO Journal, 20,6877-6888 (2001)非專利文獻 3 J. Rossi et al. Nature Biotech.，23，222-226 (2005)非專利文獻 4 :J. Τ. Marques, et al.，Nature Biotech.，24，559—565 (2006)

發明內容
本發明的目的在于提供一種核酸酶抗性及細胞內導入率高、并且能夠產生優異的 RNA干涉效果的新型雙鏈RNA。本發明的另一個目的在于提供利用該新型雙鏈RNA的藥物 組合物及抑制靶基因表達的方法。本發明人等為了解決上述課題，進行了深入研究，結果發現，通過在雙鏈RNA中使 雙鏈脂質直接或通過連接體連接到有義鏈RNA的從5’末端側起第1 6個核苷酸的至少 一個上，能夠構建顯著提高核酸酶抗性、細胞內導入率及RNA干涉效果的RNA，所述雙鏈RNA 包含具有與靶基因中的靶序列互補的堿基序列的有義鏈RNA及具有與該有義鏈RNA互補的 堿基序列的反義鏈RNA，且能夠抑制靶基因的表達。本發明是基于上述發現，通過進一步反 復改良而完成的。S卩，本發明提供下述給出的雙鏈脂質修飾RNA、藥物組合物、應用及抑制靶基因表 達的方法。項1. 一種雙鏈脂質修飾RNA，其特征在于，所述雙鏈脂質修飾RNA為雙鏈RNA，包含具有與靶基因中的靶序列互補的堿基序列的有義鏈RNA及具有與該有義鏈RNA互補的堿 基序列的反義鏈RNA，并且能夠抑制上述靶基因的表達，雙鏈脂質直接或通過連接體連接到 該有義鏈RNA的從5’末端起第1 6個核苷酸的至少一個上。項2.如項1所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述有義鏈RNA的5’末端側為平滑 末端，并且上述有義鏈RNA的3’末端側具有平滑末端或懸端。項3.如項1所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述有義鏈RNA的5’末端側及3’末 端側均具有懸端。項4.如項1 3中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，構成上述有義鏈RNA的 核苷酸的數量為21 27個。項5.如項2所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述有義鏈RNA的5’末端側及3’末 端側均為平滑末端，上述有義鏈RNA及上述反義鏈分別由27個核苷酸構成。項6.如項2所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述有義鏈RNA的5’末端側及3’末 端側均為平滑末端，上述有義鏈RNA及上述反義鏈分別由23個核苷酸構成。項7.如項2所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述有義鏈RNA的5’末端側為平滑 末端，上述有義鏈RNA由25個核苷酸構成，并且上述反義鏈由23個核苷酸構成。項8.如項3所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述有義鏈RNA及上述反義鏈分別由 21個核苷酸構成。項9.如項1 8中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，構成上述雙鏈脂質的2 個疏水基相同或者不同，為碳原子數為6 50的飽和脂肪酸殘基或不飽和脂肪酸殘基。項10.如項1 9中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述雙鏈脂質為甘油 磷脂(Glycerophospholipid)、甘油糖脂(Glyceroglycolipid)、二酰基甘油或神經酰胺。項11.如項1 9中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述雙鏈脂質為甘油 磷脂。項12.如項11所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述雙鏈脂質為磷脂酰乙醇胺。項13.如項12所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，上述雙鏈脂質為選自二肉豆蔻酰磷 脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、1-棕櫚酰-2-油基-磷脂酰乙醇胺及二油酰基磷脂酰 乙醇胺中的至少一種。項14.如項1 13中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，脂質通過連接體與上 述有義鏈RNA的從5’末端起第1 6個核苷酸的至少一個連接，所述連接體的結構由下述 通式(L-27)表示。 -CO- (CH2) n3-C0-NH- (CH2) n4_ (L-27)[式中，n3及n4相同或者不同，表示1 20的整數。]項15. —種藥物組合物，含有項1 14中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA和藥學 上允許的載體。項16.項1 14中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA在制備用于抑制靶基因表達 的藥物中的應用。項17. —種抑制靶基因表達的方法，包括將項1 14中任一項所述的雙鏈脂質修 飾RNA導入細胞內的步驟。本發明的雙鏈脂質修飾RNA的有義鏈RNA的5’末端側被雙鏈脂質修飾，由此顯著
5提高了 RNA干涉效果。特別是本發明的雙鏈脂質修RNA，通過在特定位點連接雙鏈脂質，核 酸酶抗性及RNA干涉效果顯著提高，且不妨礙切酶的加工或與RISC形成復合體的能力，因 此對藥物用途的應用有很大的貢獻。進而，本發明的雙鏈脂質修飾RNA即使單獨使用也顯示出優異的細胞內遞送能 力，因此不另外使用已知的基因導入試劑，或者減少已知的基因導入試劑的使用量，也可以 將雙鏈脂質修飾RNA導入細胞內。因此，本發明的雙鏈脂質修飾RNA可以抑制因使用已知 的基因導入試劑所導致的細胞毒性的表達，可以確保臨床應用中高度的安全性。因此，通過利用本發明的雙鏈脂質修飾RNA的藥物組合物或抑制靶基因表達的方 法，可以在臨床上更有效地抑制或阻礙靶基因的表達。


[圖1]為表示實施例1中對雙鏈脂質修飾的有義鏈RNA進行HPLC分析的結果的 圖。[圖2]為表示實施例1中，確認雙鏈脂質修飾RNA的雙鏈RNA形成的結果的圖。 圖2的A中，(1)表示21nt siRNA的結果、(2)表示DPPE L21A/L21B的RNA的結果、(3)表 示 POPE L21A/L21B 的 RNA 的結果、(4)表示 DOPE L21A/L21B 的 RNA 的結果、(5)表示 DMPE L21A/L21B的RNA的結果。圖2的B中，(1)表示27nt dsRNA的結果、(2)表示DPPE L27A/ L27B 的 RNA 的結果、(3)表示 POPE L27A/L27B 的 RNA 的結果、(4)表示 DOPE L27A/L27B 的 RNA的結果、(5)表示DMPE L27A/L27B的RNA的結果。[圖3]為表示實施例1中雙鏈脂質修飾RNA的核酸酶抗性結果的圖。[圖4]為表示實施例1中研究雙鏈脂質修飾RNA使用切酶加工的結果的圖。[圖5]為表示實施例1中濃度為2nM時的雙鏈脂質修飾27ntdsRNA的RNA干涉效 果的結果的圖。[圖6]為表示實施例2中對雙鏈脂質修飾有義鏈RNA進行HPLC分析的結果的圖。[圖7]為表示實施例2中確認雙鏈脂質修飾RNA的雙鏈形成的結果的圖。圖7的 A中，A-I中(1)表示21nt siRNA的結果、(2)表示DPPE v21A/v21B的RNA的結果，A-2中 (1)表示 21ntsiRNA 的結果、(2)表示 POPE v27A/v27B 的 RNA 的結果、(3)表示 DOPE v27A/ v27B的RNA的結果、(4)表示DMPE v27A/v27B的RNA的結果。圖7的B中，(1)表示27nt dsRNA 的結果、(2)表示 DPPE v27A/v27B 的 RNA 的結果、(3)表示 POPE v27A/v27B 的 RNA 的結果、(4)表示DOPE v27A/v27B的RNA的結果、(5)表示DMPE v27A/v27B的RNA結果。[圖8]為表示實施例2中雙鏈脂質修飾RNA的核酸酶抗性結果的圖。[圖9]為表示實施例2中研究雙鏈脂質修飾RNA使用切酶加工的結果的圖。[圖10]為表示實施例2中雙鏈脂質修飾RNA對HeLa、A549細胞中VEGF基因的 RNA干涉效果的結果的圖。[圖11-1]為表示實施例2中雙鏈脂質修飾RNA對HeLa細胞中VEGF基因的細胞 導入率的結果的圖。圖中，FL表示用熒光顯微鏡拍攝的圖像，trans表示用相差顯微鏡拍攝 的與上述FL同一視野的圖像，merge表示重疊上述FL圖像與trans圖像得到的圖像。[圖11-2]為表示實施例2中雙鏈脂質修飾RNA對A549細胞中VEGF基因的細胞 導入率的結果的圖。圖中，FL表示用熒光顯微鏡拍攝的圖像，trans表示用相差顯微鏡拍攝的與上述FL同一視野的圖像，merge表示重疊上述FL圖像與trans圖像得到的圖像。[圖12]為表示實施例3中，用HPLC分析雙鏈脂質修飾RNA的結果圖。[圖13]為實施例3中確認雙鏈脂質修飾RNA合成的結果的圖。
具體實施例方式本說明書中，所謂“平滑末端”，是指在雙鏈RNA的末端部分，有義鏈的末端區域及 與其配對的反義鏈的末端區域配對的結構，不形成單鏈部分(即，不形成突出部)。另外，所 謂“懸端”，是指也稱作突出端的結構，表示下述堿基序列(突出部)，即在雙鏈RNA末端部 分的有義鏈的末端區域或與其配對的反義鏈的末端區域中，因不存在配對的堿基，所以不 能形成雙鏈，故存在單鏈。另外，本說明書中，所謂“雙鏈脂質修飾RNA”，是指連接有雙鏈脂 質的雙鏈(double strand) RNA分子。本發明的雙鏈脂質修飾RNA包含與靶基因中的靶序列互補的堿基序列即有義鏈 RNA。此處，所謂“靶基因”，是指RNA干涉效果抑制其表達的基因。本發明的雙鏈脂質修 飾RNA中，對靶對象基因沒有特殊的限制，可以基于該雙鏈脂質修飾RNA的用途適當選擇。對靶基因中的靶序列沒有特別的限制，只要該基因的表達可以被RNA干涉效果抑 制即可。可以采用公知的方法，具體而言，使用NCBI的BLAST搜索等適當確定。例如靶序 列可以是由19 30個堿基組成的區域，所述堿基在位于靶基因編碼區(ORF)起始密碼子 50 100個堿基下游的外顯子部分中的堿基”AA”之后，是GC含量約為50%的區域。本領 域技術人員根據經驗可知，通過采用與上述靶序列互補的鏈，可以獲得優異的RNA干涉效 果。另外，例如上述靶序列可以按照IDT公司(Integrated DNA Technologies, INC)的說 明(Dicer Substrate RNAi Design)來確定。另外，最近有報道指出通過構建如下雙鏈RNA 可以產生具有高RNA干涉效果的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA (i)在反義鏈RNA的5’末端為A/ U對；(ii)在有義鏈RNA的5’末端為G/C對；(iii)在反義鏈RNA的5’末端側具有5個左 右的A/U對；且(vi)在雙鏈中不存在9個以上的G/C對。(Ui-Tei et al.，Nucleic Acids Res. ，32，936-948(2004))。本發明的雙鏈脂質修飾RNA的有義鏈中不存在懸端時，該有義鏈由與靶序列互補 的堿基序列組成。另外，有義鏈在5’末端及/或3’末端存在懸端時，該有義鏈由下述堿基 序列構成，所述堿基序列在與靶序列互補的堿基序列的5’末端及/或3’末端上連接有構 成懸端的堿基序列。本發明的雙鏈脂質修飾RNA中，對構成上述有義鏈RNA的核苷酸數量，沒有特別的 限制，只要可以發揮RNA干涉效果即可，可以根據該雙鏈脂質修飾RNA具備的結構等適當地 確定，可以舉出通常為21 27個，優選為21個、23個、25個或27個，更優選為21個或27 個。需要說明的是，此處所謂構成有義鏈RNA的核苷酸的數量，是指在該有義鏈中不存在懸 端時，構成與靶序列互補的堿基序列的核苷酸的總數，在該有義鏈中存在懸端時，是指構成 該懸端的核苷酸的數量和構成與靶序列互補的堿基序列的核苷酸的數量的總和。另外，雙鏈脂質修飾RNA具有包含與上述有義鏈互補的堿基序列的反義鏈。本發明的雙鏈脂質修飾RNA中，在反義鏈中不存在懸端時，該反義鏈由與上述有 義鏈的“與靶序列互補的堿基序列”的一部分或全部互補的堿基序列組成。另外，在反義鏈的5’末端及/或3’末端存在懸端時，該反義鏈由下述堿基序列組成，所述堿基序列在與上 述有義鏈的“與靶序列互補的堿基序列”的一部分或全部互補的堿基序列的5’末端及/或 3’末端上連接有構成懸端的堿基序列。本發明的雙鏈脂質修飾RNA中，對于構成上述反義鏈RNA的核苷酸數量沒有特別 的限制，只要可以發揮RNA干涉效果即可，可以根據該雙鏈RNA具備的雙鏈RNA結構等適當 確定，可以舉出通常為21 27個，優選為21個、23個、25個或27個，更優選為21個、23個 或27個。另外，此處所謂構成反義鏈RNA的核苷酸的數量，在該反義鏈不存在懸端時，是指 構成與靶序列互補的堿基序列的核苷酸的總數，在該反義鏈存在懸端時，是指構成該懸端 的核苷酸數量和構成與靶序列互補的堿基序列的核苷酸數量的總和。本發明的雙鏈脂質修飾RNA中，構成上述有義鏈RNA和上述反義鏈RNA的核苷酸 基本為核糖核苷酸，為了提高分解酶抗性，RNA序列中也可以包含2’ -0-甲基修飾型、2’ -F 修飾型、LNA(鎖定核酸(Locked Nucleic Acid))等各種化學修飾型核苷酸或脫氧核糖核 苷酸等。特別是，本發明的雙鏈脂質修飾RNA具有懸端結構時，上述有義鏈RNA及/或上述 反義鏈RNA中的該懸端的構成部分也可以由脫氧核糖核苷酸組成。作為上述化學修飾型核 苷酸，具體而言，可以舉出硫代磷酸型DNA/RNA、硼磷酸型DNA/RNA等磷酸骨架修飾的核苷 酸等；2’ -OMe修飾RNA、2’ -F修飾RNA等2’修飾核苷酸；LNA (鎖定核酸)和ENA (2’ -0， 4’ -C-亞乙基-橋聯核酸)等將核苷酸的糖分子交聯得到的修飾核苷酸；PNA (肽核酸)、 嗎啉核苷酸等基本骨架不同的修飾核苷酸；5-氟尿苷和5-丙基尿苷等堿基修飾型核苷酸；寸。本發明的雙鏈脂質修飾RNA在結構上沒有特別的限制，只要上述有義鏈RNA與上 述反義鏈RNA雜交形成雙鏈即可。作為優選的結構，可以舉出㈧上述有義鏈RNA的5’末 端側為平滑末端(bland end)、且上述有義鏈RNA的3’末端側為平滑末端或具有懸端(單 鏈區域，突出部)的結構，以及⑶上述有義鏈RNA的5’末端側及3’末端側均具有懸端的 結構。如上所述，通過形成上述結構(A)或(B)，雖然用雙鏈脂質修飾，但也不會導致RNA干 涉效果的減弱，可以進一步顯著地提高細胞內導入效率。此處，有義鏈RNA的3’末端側具 有懸端的結構包括下述情況有義鏈RNA的3’末端區域構成懸端的情況，和反義鏈RNA的 5’末端區域構成懸端的情況。另外，有義鏈RNA的5’末端側具有懸端的結構包括下述情 況有義鏈RNA的5’末端區域構成懸端的情況，和反義鏈RNA的3’末端區域構成懸端的情 況。構成本發明的雙鏈脂質修飾RNA的雙鏈RNA中，特別是從為了表達優異的RNA干 涉效果的觀點考慮，作為特別優選的結構，可以舉出下述結構(A-I) (A-3)作為上述結構 (A)中包含的結構，可以舉出下述結構(B-I)作為上述結構(B)中包含的結構結構(A-I) 為上述有義鏈RNA的5’末端側及3’末端側均為平滑末端，該有義鏈RNA及該反義鏈RNA 分別由27個核苷酸構成的結構；結構(A-2)為上述有義鏈RNA的5’末端側及3’末端側均 為平滑末端，該有義鏈RNA及該反義鏈RNA分別由23個核苷酸構成的結構；結構(A-3)為 上述有義鏈RNA的5’末端側為平滑末端，該有義鏈RNA由25個核苷酸構成，并且上述反義 鏈RNA由23個核苷酸構成的結構；結構(B-I)為在上述有義鏈RNA的3’末端及上述反義 鏈RNA的3’末端分別形成由2個核苷酸組成的懸端，該有義鏈RNA及該反義鏈分別由21 個核苷酸構成的結構。
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即，上述結構(A-I)及(A-2)，是有義鏈RNA及反義鏈RNA在兩末端不形成懸端而 形成為雜交的結構。另外，上述結構(A-3)為有義鏈RNA及反義鏈RNA雜交使有義鏈RNA的 5’末端側為平滑末端、且從有義鏈RNA 3’末端起第1 2個核苷酸形成懸端的結構。另 外，上述結構(B-I)為如下結構，有義鏈的從5’末端起第1 19個核苷酸與反義鏈RNA的 從3’末端起第3 21個核苷酸雜交，有義鏈RNA的從3’末端起第1 2個核苷酸和反義 鏈RNA的從3’末端起第1 2個核苷酸分別形成懸端。本發明的雙鏈脂質修飾RNA，脂質連接到上述有義鏈RNA的從5’末端側起第1 6個核苷酸的至少一個上。本發明的雙鏈脂質修飾RNA在除上述有義鏈RNA的5’末端側 之外的部分沒有連接其他取代基。即，除上述有義鏈RNA的5’末端側之外的部分及反義鏈 RNA部分沒有被其他取代基取代，僅由核苷酸構成。如上所述，通過僅雙鏈脂質與上述有義 鏈RNA的5’末端側連接，可以提高細胞內導入率，并且可以發揮非常優異的RNA干涉效果。 即，本發明的雙鏈脂質修飾RNA中，雙鏈RNA的結構、選擇雙鏈脂質作為修飾脂質，及該雙鏈 脂質的連接部位等結構上的特征為不可分割的關系，使其具備高細胞內導入率的同時，具 備核酸酶抗性，并且也可以發揮非常優異的RNA干涉效果。本發明的雙鏈脂質修飾RNA中，作為與上述有義鏈RNA連接的雙鏈脂質沒有特別 的限制，只要是具有2個疏水基的脂質即可，作為一個例子，可以舉出具有選自碳原子數 6 50的飽和脂肪酸殘基及不飽和脂肪酸殘基中的至少2個疏水基的脂質。作為上述飽和 脂肪酸殘基及不飽和脂肪酸殘基的碳原子數，可以舉出優選為8 30，更優選為10 24。 更具體而言，作為構成脂質的疏水基，例如可以舉出癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂 酸、花生酸、山崳酸、木蠟酸、肉豆蔻烯酸、棕櫚油酸、油酸、反油酸、1-十八碳烯酸、芥子酸、 二十碳-9-烯酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等的脂肪酸殘基。從進一步顯著地發揮上述 本發明的效果的觀點考慮，本發明中使用的雙鏈脂質的2個疏水基優選為選自肉豆蔻酸、 棕櫚酸、硬脂酸及油酸中的至少1種的脂肪酸殘基。作為本發明中使用的雙鏈脂質的具體例，可以舉出甘油磷脂、甘油糖脂、二酰基甘 油、神經酰胺等。其中，從進一步提高核酸酶抗性、細胞內導入率及RNA干涉效果的觀點考 慮，可以舉出優選甘油磷脂。作為本發明中使用的甘油磷脂，沒有特別的限制，可以任意地使用磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇等。作為本發明中使用的磷脂的具體例子，可以舉出二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉 豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基 磷脂酰乙醇胺、1-棕櫚酰基-2-油基-磷脂酰乙醇胺、1-油基-2-棕櫚酰基-磷脂酰乙醇 胺、二芥酸酰基磷脂酰乙醇胺等磷脂酰乙醇胺；二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂 酰甘油、二棕櫚酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、1-棕櫚酰 基-2-油基-磷脂酰甘油、1-油基-2-棕櫚酰基-磷脂酰甘油、二芥酸酰基磷脂酰甘油等 磷脂酰甘油；二月桂酰基磷脂酰絲氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰基磷脂酰絲 氨酸、二硬脂酰基磷脂酰絲氨酸、二油酰基磷脂酰絲氨酸、I"棕櫚酰基-2-油基_磷脂酰絲 氨酸、I"油基-2-棕櫚酰基-磷脂酰絲氨酸、二芥酸酰基磷脂酰絲氨酸等磷脂酰絲氨酸；二 月桂酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕櫚酰基磷脂酸、二硬脂酰基磷脂酸、二油酰基 磷脂酸、I"棕櫚酰基-2-油基-磷脂酸、1-油基-2-棕櫚酰基-磷脂酸、二芥酸酰基磷脂酸等磷脂酸；二月桂酰基磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇、二棕櫚酰基磷脂酰肌醇、二 硬脂酰基磷脂酰絲氨酸、二油酰基磷脂酰肌醇、1-棕櫚酰基-2-油基_磷脂酰肌醇、1-油 基-2-棕櫚酰基_磷脂酰肌醇、二芥酸酰基磷脂酰肌醇等磷脂酰肌醇。其中，從進一步顯著 提高核酸酶耐性、細胞內導入率及RNA干涉效果的觀點考慮，可以優選舉出磷脂酰乙醇胺、 更優選為二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕櫚酰基-2-油基-磷 脂酰乙醇胺、及二油酰基磷脂酰乙醇胺。本發明的雙鏈脂質修飾RNA中，對上述雙鏈脂質與上述有義鏈的連接方式沒有特 別的限制，上述脂質雙鏈可以與其直接連接，或者也可以通過連接體(連接區域)與其連 接。但是，本發明中，連接上述雙鏈脂質與上述有義鏈的連接體中不包含由核酸構成的物 質。此處，作為連接體，只要可以連接上述脂質與上述有義鏈即可，沒有特別的限制， 具體而言，作為上述連接體，可以舉出下述結構。-0-C0-0-(L-I)
-NH--co-o-(L-2)
-NH--CO-NH-(L-3)
-NH-"(CH2)nl-(L-4)
-S-(CH2)nl-(L-5)
-CO--(CH2)nl-CO-(L-6)
-CO--(CH2)nl-NH-(L-7)
-NH--(CH2)nl-NH-(L-8)
-CO--NH- (CH2)n「NH-C0-(L-9)
-C (=S)-NH-(CH2) n「NH-C0-(L-IO)
-C(=S) -NH- (CH2) nl-NH-C(=s)-(L-Il)
-CO--0- (CH2)nl-O-CO-(L-12)
-C (=S) -0- (CH2)nl-O-CO-(L-13)
-C(=S)-O-(CH2)nl-O-C (=S)-(L-14)
-co--NH- (CH2)nl-O-CO-(L-15)
-C (=S)-NH-(CH2) n「0-C0-(L-16)
-C(=S)-NH-(CH2)nl-O-C (=S)-(L-17)
-co--NH- (CH2)nl-O-CO-(L-18)
-C (=S)-NH-(CH2) n「0-C0-(L-19)
-C(=S)-O-(CH2) n「NH-C0-(L-20)
-C(=S)-NH-(CH2)nl-O-C (=S)-(L-21)
-NH--(CH2CH2O)n2-CH(CH2OH)-(L-22)
-NH--(CH2CH2O)n2-CH2-(L-23)
-NH--(CH2CH2O)n2-CH2-CO-(L-24)
-o-(CH2)n3-S-S-(CH2) n4-0-P(= 0)2-(L-25)
-co--(CH2)n3-O-CO-NH-(CH2)n4-(L-26)
-co--(CH2)n3-CO-NH-(CH2)n4-(L-27)
10
此處，上述通式(L-4) (L-21)中，nl表示為1 40的整數，優選為2 20的 整數，更優選為2 12的整數。另外，上述通式(L-22) (L-24)中，n2表示1 20的整數，優選為1 10的整 數，更優選為1 6的整數。另外，上述通式(L-25) (L-27)中，η3及η4相同或不同，表示1 20的整數， 優選為1 10的整數，更優選為1 6的整數。上述通式(L-I) (L-27)表示的連接體可以在其右側或左側的任一側連接單鏈 DNA。優選如下構成在左側連接雙鏈脂質，在右側連接上述雙鏈RNA的有義鏈RNA5’末端 區域。另外，對上述連接體與上述雙鏈脂質的的連接部位，根據雙鏈脂質的種類和連接 體的種類適當地設定，也可以將除雙鏈脂質的疏水基之外的部位與上述連接體通過化學鍵 進行連接。例如，如果使用磷脂酰乙醇胺時，則其氨基可以通過與上述連接體形成酰胺鍵等 進行連接。另外，如果使用磷脂酰甘油時，則其甘油殘基中的羥基可以通過與上述連接體形 成酯鍵或醚鍵等進行連接。另外，如果使用磷脂酰絲氨酸時，則其絲氨酸殘基中的氨基或羧 基可以通過與上述連接體形成酰胺鍵或酯鍵等進行連接。進而，如果使用磷脂酸時，則其磷 酸殘基可以通過與上述連接體形成磷酸酯鍵等進行連接。進而，如果使用磷脂酰肌醇時，則 其肌醇殘基中的羥基可以通過與上述連接體形成酯鍵或醚鍵等進行連接。上述連接體根據所連接的脂質的種類適當地選擇，例如，使用具有氨基的磷脂 (即，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等)或具有羥基的磷脂(即，磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇 等)作為雙鏈脂質時，作為上述連接體，優選為通式(L-6)、(L-7)、(L-9)、(L-10)、(L-18)、 (L-26)及(L-27)的連接體。另外，除上述連接體之外，例如也可以使用N-琥珀酰亞胺基=3-(2_吡啶基二硫 基)丙酸酯、Ν-4-馬來酰亞胺丁酸、S-(2-吡啶基二硫基)巰基乙胺、碘代乙酸琥珀酰亞胺 酯、N-(4-馬來酰亞胺丁氧基)琥珀酰亞胺、N-[5-(3’_馬來酰亞胺丙酰胺)-l-羧基戊基] 亞氨基二乙酸、N- (5-氨基戊基)-亞氨基二乙酸等雙官能連接體(含有2個官能基的連接 體)。上述有義鏈RNA中，作為雙鏈脂質或連接雙鏈脂質的連接體的連接對象即核苷 酸，只要是從上述有義鏈RNA的5’末端側起第1 6個核苷酸即可，沒有特別的限制，優選 為從5’末端側起第1 4個核苷酸，更優選為從5’末端側起第1及/或第2個核苷酸，特 別優選為在5’末端(從5’末端側起第1個)的核苷酸。另外，上述有義鏈RNA中，對雙鏈脂質或連接雙鏈脂質的連接體的連接部位，沒有 特別的限制，雙鏈脂質或連接雙鏈脂質的連接體，優選通過取代構成羥基的氫原子進行連 接，所述羥基是上述有義鏈RNA的規定的核苷酸中的磷酸部分的羥基。作為與本發明的雙鏈脂質修飾RNA連接的雙鏈脂質的數量，沒有特別的限制，例 如可以舉出1 3個，優選為1個或2個，更優選為1個。本發明的雙鏈脂質修飾RNA可以如下制備分別合成連接有雙鏈脂質的上述有義 鏈RNA及上述反義鏈RNA，按照公知的方法使上述有義鏈RNA及反義鏈RNA雜交，由此制備。 需要說明的是，連接有雙鏈脂質的上述有義鏈RNA，也可以采用公知的合成技術進行制備。進而，本發明的雙鏈脂質修飾RNA，可以通過如下方法制備按照公知的方法合成上述有義鏈RNA及上述反義鏈RNA、使兩者雜交制備雙鏈RNA后，采用雙鏈脂質公知的合成 技術將雙鏈脂質連接在該雙鏈RNA的有義鏈RNA的5’末端。本發明的雙鏈脂質修飾RNA，通過導入細胞內，可以抑制或阻礙靶基因的表達，因 此可以用作以抑制靶基因的表達為目的的藥物或基因治療用的藥物，或用于評價抑制靶基 因表達的效果的實驗材料。對成為本發明雙鏈脂質修飾RNA導入對象的細胞，可以為來自人、非人哺乳動物、 鳥類、昆蟲等任一種動物中的細胞，優選可以舉出來自人及非人哺乳動物的細胞。對本發明的雙鏈脂質修飾RNA向細胞內的導入方法，與現有SiRNA的情況相同，只 要使有效量的該雙鏈脂質修飾RNA與成為導入對象的細胞接觸即可。本發明的雙鏈脂質修 飾RNA向細胞內的導入，可以在體內、體外進行。例如在體外將本發明的雙鏈脂質修飾RNA導入細胞內時，可以舉出下述方法在 該細胞的培養時在預先使適當量的該雙鏈脂質修飾RNA存在的狀態下培養細胞。另外，在 體外或體內向培養細胞、從生物體提取的細胞、從生物體提取的組織中導入本發明的雙鏈 脂質修飾RNA時，在該雙鏈脂質修飾RNA的存在下，也可以培養培養細胞、從生物體提取的 細胞或從生物體提取的組織。進而，在體內將本發明的雙鏈脂質修飾RNA導入細胞內時，可 以通過以下方法給與本發明的雙鏈脂質修飾RNA，所述方法包括直接注射到組織內；向靜 脈、皮下、肌肉、腹腔、目艮內、消化器官內、牙齒內等注射；向鼻腔、口腔、肺等吸入給與；口服 給與；通過皮膚的經皮給與；及通過口腔粘膜、陰道粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜的經 粘膜給與等。另外，將本發明的雙鏈脂質修飾RNA導入細胞內時，對該雙鏈脂質修飾RNA相對 于導入對象的細胞的適用量，只要是用于導入細胞內的有效量即可，具體而言，可以舉出相 對于每1個細胞，該雙鏈脂質修飾RNA的適用量在0. 001 IOpmol (pM)的范圍內，優選在 0. 001 Ipmol的范圍內，更優選在0. 01 0. Ipmol的范圍內。本發明的雙鏈脂質修飾RNA，即使單獨給與也能顯示出優異的細胞內遞送能力，所 以導入細胞內時可以不使用用于向細胞內導入siRNA的現有基因導入試劑，或者也可以降 低現有基因導入試劑的使用量。本發明的雙鏈脂質修飾RNA，通過被導入細胞內，可以抑制或阻礙靶基因的表達， 因此該雙鏈脂質修飾RNA，例如，在藥物領域中，可以用于預防、減輕或治療由該靶基因的表 達引起的疾病。在藥物領域中使用本發明的雙鏈脂質修飾RNA時，該雙鏈脂質修飾RNA與 藥學上允許的載體共同配合，以藥物組合物的形式提供。作為該藥物組合物中使用的藥學上允許的載體，可以根據藥物組合物的使用形態 適當選擇，沒有特別的限制，例如，可以舉出精制水、糖水溶液、緩沖液、生理鹽水、聚合物水 溶液、不含RNase的水等水性載體、賦形劑等。對該藥物組合物中的雙鏈脂質修飾RNA的配合比例，只要適當設定使其能夠滿足 上述該雙鏈脂質修飾RNA的適用量即可。例如可以舉出相對于該藥物組合物的總量，該雙 鏈脂質修飾RNA為0. 001 50重量％，優選為0. 01 10重量％，更優選為0. 1 1重量％ 的比例。另外，對該藥物組合物的制劑形態，只要能夠將雙鏈脂質修飾RNA導入細胞內即 可，沒有特別的限制，例如可以舉出溶液劑(包括糖漿等)、滴劑、注射劑等液體制劑；凍干
12制劑、干糖漿劑、片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑(包括軟膠囊)等固體制劑。另外，本發 明的藥物組合物為固體制劑時，可以在使用時加入注射用蒸餾水、無菌水等，再次溶解后使用。另外，該藥物組合物適用的疾病或癥狀，只要與靶基因的表達有關即可，沒有特別 的限制。對于靶基因與疾病的關系在該技術領域中是公知的。另外，該藥物組合物為了治療人的疾病，可以用于來自人的細胞，另外，還可以用 于治療除人之外的動物(特別是除人之外的哺乳動物)。
實施例以下，基于實施例詳細地說明本發明，但本發明并不限定于這些實施例。實施例1 5’雙鏈脂質修飾RNA對熒光素酶基因表達的抑制效果1.針對熒光素_某因的雙鏈脂質修飾RNA的合成1-1.有義鏈RNA及反義鏈RNA的序列設計含有21個及27個堿基長度的有義鏈RNA和21個及27個堿基長度的反義 鏈RNA的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA具有與海腎(renilla)熒光素酶相同的序列，且能夠抑制 海腎熒光素酶的基因表達。該雙鏈RNA使用21個堿基長度的反義鏈和有義鏈時，可以形成 在3’末端具有2個堿基的懸端的21個堿基長度的雙鏈RNA，該雙鏈RNA使用27個堿基長 度的反義鏈和有義鏈時，可以形成兩末端為平滑末端的27個堿基長度的雙鏈RNA。使用的 RNA的序列如下所述。27nt dsRNA 有義鏈 L27A :5，-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3，(序列號 1)反義鏈L27B :3，-GACCGGAAA⑶GAUGAGGAUGCUCGUG-5，(序列號 2)21nt siRNA 有義鏈 L21A :5，-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3，(序列號 3)反義鏈L2IB 3，-GACCGGAAA⑶GAUGAGGAUG-5，(序列號 4)使用上述有義鏈RNA及反義鏈制作雙鏈RNA。S卩，在universal buffer (林化成株 式會社)中混合等摩爾的有義鏈及反義鏈單鏈RNA、在92°C下加熱2分鐘后，緩慢降低溫度 至4°C，由此制作雙鏈RNA。合成的各種雙鏈RNA如下進行確認使用20%聚丙烯酰胺凝膠， 在250V的條件下進行電泳60分鐘，之后，用銀染色試劑盒(GE Health Care Bioscience) 對雙鏈RNA進行染色，由此確認。該雙鏈RNA中，將在3’末端具有2個堿基的懸端的21個堿基長度的雙鏈RNA作 為si L21A/L21B，將作為平滑末端的27個堿基長度的雙鏈RNA作為Ds L27A/L27B。1-2.針對熒光素酶基因的雙鏈脂質修飾RNA的合成合成能夠抑制熒光素酶基因表達的、在雙鏈RNA的有義鏈的5’末端鍵合雙鏈脂質 的雙鏈脂質修飾有義鏈RNA。在該雙鏈脂質修飾有義鏈RNA中，雙鏈脂質通過連接在上述有 義鏈RNA5，末端的氨烷基(氨基修飾劑C6 (Amino Modifier C6) ；Glen Research)以共價鍵 連接。通過在液相中使具有活性酯基的脂質化合物(以下稱作“活性酯化的脂質化合物”) 與對5’末端進行氨基化修飾的有義鏈RNA進行反應，合成雙鏈脂質修飾有義鏈RNA (下述 反應式1) ο反應式1
1權利要求
一種雙鏈脂質修飾RNA，其特征在于，所述雙鏈脂質修飾RNA為雙鏈RNA，包含具有與靶基因中的靶序列互補的堿基序列的有義鏈RNA及具有與所述有義鏈RNA互補的堿基序列的反義鏈RNA，并且能夠抑制所述靶基因的表達，雙鏈脂質直接或通過連接體連接到所述有義鏈RNA的從5’末端起第1～6個核苷酸中的至少一個核苷酸上。
2.如權利要求1所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述有義鏈RNA的5’末端側為平滑 末端，并且所述有義鏈RNA的3’末端側具有平滑末端或懸端。
3.如權利要求1所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述有義鏈RNA的5’末端側及3’末 端側均具有懸端。
4.如權利要求1 3中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，構成所述有義鏈RNA的 核苷酸的數量為21 27個。
5.如權利要求2所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述有義鏈RNA的5’末端側及3’末 端側均為平滑末端，所述有義鏈RNA及所述反義鏈分別由27個核苷酸構成。
6.如權利要求2所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述有義鏈RNA的5’末端側及3’末 端側均為平滑末端，所述有義鏈RNA及所述反義鏈分別由23個核苷酸 構成。
7.如權利要求2所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述有義鏈RNA的5’末端側為平滑 末端，所述有義鏈RNA由25個核苷酸構成，并且所述反義鏈由23個核苷酸構成。
8.如權利要求3所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述有義鏈RNA及所述反義鏈分別由 21個核苷酸構成。
9.如權利要求1所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，構成所述雙鏈脂質的2個疏水基相同 或者不同，為碳原子數為6 50的飽和脂肪酸殘基或不飽和脂肪酸殘基。
10.如權利要求1所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述雙鏈脂質為甘油磷脂、甘油糖 脂、二酰基甘油、或神經酰胺。
11.如權利要求1所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述雙鏈脂質為甘油磷脂。
12.如權利要求11所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述雙鏈脂質為磷脂酰乙醇胺。
13.如權利要求12所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，所述雙鏈脂質為選自二肉豆蔻酰磷 脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、1-棕櫚酰-2-油基-磷脂酰乙醇胺及二油酰基磷脂酰 乙醇胺中的至少一種。
14.如權利要求1所述的雙鏈脂質修飾RNA，其中，脂質通過連接體連接到所述有義鏈 RNA的從5’末端起第1 6個核苷酸的至少一個核苷酸上，所述連接體的結構由下述通式 (L-27)表示，-CO- (CH2) n3-C0-NH- (CH2) n4- (L-27)式中，n3及n4相同或者不同，表示1 20的整數。
15.一種藥物組合物，含有權利要求1 14中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA和藥學 上允許的載體。
16.權利要求1 14中任一項所述的雙鏈脂質修飾RNA在制備用于抑制靶基因表達的 藥物中的應用。
17.—種抑制靶基因表達的方法，包括將權利要求1 14中任一項所述的雙鏈脂質修 飾RNA導入細胞內的步驟。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種核酸酶抗性及細胞內導入率高、并且能夠產生優異的RNA干涉效果的新型雙鏈RNA。本發明提供了一種雙鏈脂質修飾RNA，該雙鏈脂質修飾RNA包含具有與靶基因中的靶序列互補的堿基序列的有義鏈RNA，及具有與該有義鏈RNA互補的堿基序列的反義鏈RNA，能夠抑制靶基因表達，其中，雙鏈脂質直接或通過連接體連接到該有義鏈RNA的從5’末端起第1～6個核苷酸中的至少一個核苷酸上。
文檔編號A61K31/7088GK101981185SQ20098011148
公開日2011年2月23日 申請日期2009年3月31日 優先權日2008年3月31日
發明者豐福秀一, 久保貴紀, 大庭英樹, 林宏剛 申請人:獨立行政法人產業技術綜合研究所;大塚制藥株式會社