雙鏈rna或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應用的制作方法

雙鏈rna或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應用。本發明所提供的雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應用，所述雙鏈RNA的一條鏈序列為序列表中SEQ?ID?No.1，所述雙鏈RNA的另一條鏈序列為序列表中SEQ?ID?No.2；所述雙鏈RNA的修飾物是經過下述A1)或A2)或A3)修飾得到的雙鏈RNA修飾物：A1)對所述雙鏈RNA的核糖的2′-OH進行修飾；A2)對所述雙鏈RNA的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾；A3)對所述雙鏈RNA的核糖的5′端連上膽固醇的修飾。實驗證明，本申請的2′-OMe-dsRNA21或其修飾物能有效抑制腫瘤和腫瘤細胞。
【專利說明】雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】中雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑中的應用。

【背景技術】
[0002] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是一種分子生物學上與祀基因序列同源的短 雙鏈RNA(dsRNA)誘導的序列特異性的特別有效的轉錄后基因沉默現象（Fire，1998)，其機 制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。當細胞中導入與內源性mRNA編碼 區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默。RNAi是真核細胞特有的一 種基因沉默機制，在決定細胞命運、細胞分化方向及存留等方面起著極為重要的作用。由 于RNAi具有鎖定任何引起疾病或疾病相關蛋白表達的能力，且RNAi技術特異性高，作用迅 速，副反應小，在有效地沉默靶基因的同時，對細胞本身的調控系統沒有影響。目前RNAi已 作為一種高效的序列特異性基因剔除技術在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領域發展極 為迅速。
[0003] 微小核酸（miRNA)是一種內源的、在體內廣泛表達的包含21?25個核苷酸的內 源性非編碼小RNA，是引起RNA干擾現象直接原因的物質之一。miRNA由具有發夾結構的約 70?90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，在進化上高度保守，通過翻 譯抑制調控基因表達而不影響轉錄本的穩定性。每個miRNA可以有多個調控（靶）基因， 而幾個miRNA也可以調節同一個基因，據推測，miRNA調節著人類三分之一的基因 。miRNA 調節機體重要的生理與病理過程，在細胞分化，生物發育及疾病發生發展過程中發揮巨大 作用，且具有很強的組織特異性，已經引起越來越多的研究人員的關注。
[0004] 周期蛋白依賴性激酶4 (cyclin dependent kinase 4，Q)K4)作為一種重要的周 期蛋白。研究表明腫瘤細胞惡性增殖主要是由于細胞周期的失調所導致，Cyclin D-CDK4/ ⑶K6是調控細胞周期由G1向S期的過渡關鍵因子。⑶K4基因己被證實是一種癌基因，與 腫瘤的發生、發展及患者的預后密切相關。在多種腫瘤細胞如胃癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、 子宮內膜癌、肝癌和癌變組織中都發現伴隨有CDK4的過度表達和過度活化現象，因此CDK4 可做為腫瘤基因治療中的一個潛在祀點。
[0005] 此外G1期是增殖細胞唯一能接受從外界傳入的增殖或抑制增殖信號的時期，作 用在G1期或G1/S交界期,啟動細胞周期和促進DNA合成的cyclin D是一個比其它cyclins 更加敏感的指標。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是如何抑制腫瘤細胞和/或抑制腫瘤。所述抑制腫瘤 細胞可為抑制腫瘤細胞增殖，所述抑制腫瘤可為抑制腫瘤的發生和/或抑制腫瘤的生長。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑 制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用，所述雙鏈RNA，其名稱為dsRNA21，所述dsRNA21的一條鏈 的從5'端至3'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 1，所述dsRNA21的另一條鏈的從 3'端至5'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 2。
[0008] 其中，SEQ ID No. 1由21個核糖核苷酸組成，SEQ ID No. 2由21個核糖核苷酸組 成，SEQ ID No. 1的第1-19位核糖核苷酸與SEQ ID No. 2的第3-21位核糖核苷酸反向互 補，將二者形成的雙鏈RNA命名為dsRNA21。
[0009] 上述應用中，所述修飾物具體可為對所述dsRNA21進行修飾得到的雙鏈RNA修飾 物，其名稱為dsRNA21-mimic。所述雙鏈RNA修飾物中，各種修飾方法均可選用，包括選自核 糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合等。如可對所述dsRNA21進行下 述A1)或A2)或A3)的修飾得到所述雙鏈RNA修飾物：
[0010] A1)對所述dsRNA21的核糖的W -0H進行修飾；
[0011] A2)對所述dsRNA21的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾；
[0012] A3)對所述dsRNA21的核糖的Y端連上膽固醇的修飾。
[0013] 上述應用中，所述對所述dsRNA21的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾為將所 述磷酸二酯鍵的氧用硫取代；所述對所述dsRNA21的核糖的2' -0H進行修飾為將所述 2' -0H用甲氧基或氟取代或者對所述2' -0H進行脫氧修飾。
[0014] 在本發明的一個實施例中，所述雙鏈RNA修飾物是將所述dsRNA21的SEQ ID No. 2 所示鏈中所有胞苷酸的2' -0H均取代為甲氧基且SEQ ID No. 1所示鏈未進行修飾得到的 修飾物，其名稱為2' -0Me-dsRNA21。
[0015] 上述應用中，所述腫瘤細胞抑制劑可為抑制腫瘤細胞增殖的產品（如藥物）和/ 或促進腫瘤細胞凋亡的產品（如藥物或疫苗），所述腫瘤抑制劑可為抑制腫瘤發生的產品 (如藥物或疫苗）和/或抑制腫瘤生長的產品（如藥物或疫苗）。
[0016] 上述應用中，所述腫瘤可為鼻咽癌、腸癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 細胞肺癌或子宮內膜癌。
[0017] 上述應用中，所述抑制腫瘤細胞增殖可為抑制腫瘤細胞增殖的G1期。
[0018] 為解決上述技術問題，本發明還提供了與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑 制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用。
[0019] 本發明所提供的與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制 劑中的應用中，所述生物材料為下述Bl)-B12)中的任一種：
[0020] B1)編碼所述dsRNA21的DNA分子；
[0021] B2)含有B1)所述DNA分子的表達盒；
[0022] B3)含有B1)所述DNA分子的重組載體；
[0023] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0024] B5)含有B1)所述DNA分子的重組微生物；
[0025] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0026] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0027] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0028] B9)含有B1)所述DNA分子的轉基因動物細胞系；
[0029] B10)含有B2)所述表達盒的轉基因動物細胞系；
[0030] B11)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0031] B12)含有M)所述重組載體的轉基因動物細胞系。
[0032] 上述與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用 中，所述腫瘤可為腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小細胞肺癌或子宮內 膜癌。
[0033] 上述與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用 中，B2)所述的含有編碼dsRNA21的DNA分子的表達盒（dsRNA21表達盒）是指能夠在宿主 細胞中表達dsRNA21的DNA，該DNA不但可包括啟動dsRNA21轉錄的啟動子，還可包括終止 dsRNA21轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。
[0034] 可用現有的表達載體構建含有所述dsRNA21表達盒的重組載體。
[0035] 上述與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用 中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。
[0036] 上述與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用 中，B5)_B8)所述的微生物可為酵母、細菌、藻或真菌。
[0037] 上述與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用 中，B9)_B12)所述的轉基因動物細胞系不包括繁殖材料。
[0038] 上述與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用 中，所述腫瘤抑制劑可為抑制腫瘤發生的抑制劑和/或抑制腫瘤生長的抑制劑。
[0039] 上述與dsRNA21相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用 中，所述腫瘤細胞抑制劑為抑制腫瘤細胞增殖的產品和/或促進腫瘤細胞凋亡的產品。
[0040] 上述應用中，所述抑制腫瘤細胞增殖可為抑制腫瘤細胞增殖的G1期。
[0041] 下述Ml)或M2)的用途，也屬于本發明的保護范圍：
[0042] Ml)所述dsRNA21或所述dsRNA21-mimic在制備抑制腫瘤細胞周期蛋白D表達試 劑中的應用；
[0043] M2)所述dsRNA21或所述dsRNA21-mimic在制備抑制腫瘤細胞周期蛋白依賴性激 酶4表達試劑中的應用。
[0044] 上述用途中，所述腫瘤可為腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 細胞肺癌或子宮內膜癌。
[0045] 上述用途中，所述細胞周期蛋白D可為細胞周期蛋白D3。
[0046] 下述M3)或M4)的用途，也屬于本發明的保護范圍：
[0047] M3)上述生物材料Bl)-B12)在制備抑制腫瘤細胞周期蛋白D表達試劑中的應用；
[0048] M4)上述生物材料Bl)-B12)在制備抑制腫瘤細胞周期蛋白依賴性激酶4表達試劑 中的應用。
[0049] 上述用途中，所述腫瘤可為腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 細胞肺癌或子宮內膜癌。
[0050] 上述用途中，所述細胞周期蛋白D可為細胞周期蛋白D3。
[0051] 為解決上述技術問題，本發明還提供了治療和/或預防腫瘤的產品（如藥物或疫 苗）。
[0052] 本發明所提供的治療和/或預防腫瘤的產品（如藥物或疫苗），其活性成分為所述 dsRNA21或所述dsRNA21-mimic或上述生物材料Bl)-B12)中任一種。
[0053] 上述治療和/或預防腫瘤的產品（如藥物或疫苗）中，所述治療和/或預防腫瘤 的產品可為治療和/或預防腫瘤的藥物，所述藥物的劑型可為粉針劑。
[0054] 上述治療和/或預防腫瘤的產品（如藥物或疫苗）中，所述腫瘤為腸癌、鼻咽癌、 宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小細胞肺癌或子宮內膜癌。
[0055] 上述治療和/或預防腫瘤的產品（如藥物或疫苗）中，所述藥物還可以包含其 它藥學上可接受的載體。本文所用的"藥學上可接受的載體"應當與本發明藥物中的雙 鏈RNA分子相容。所述"藥學上可接受的載體"是指體內轉染試劑，如聚乙烯亞胺（PEI)， jetPEI (線性聚乙烯亞胺），脂質體，轉鐵蛋白，葉酸、納米乳、納米粒等。可作為藥學上可 接受的載體或其組分的一些物質的其他例子是凍干保護劑糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀 粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬 脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如 甘油、甘露糖醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ;磷脂，如卵磷脂，大豆磷脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂 酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，硬脂酰胺；膽固醇；大分子高聚物，如聚乙烯亞胺，殼 聚糖，透明質酸；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防 腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等；生理鹽水、甘油和磷酸鹽緩沖鹽水。
[0056] 上述治療和/或預防腫瘤的產品（如藥物或疫苗）中，所述粉針劑可以生理鹽水 或者等滲葡萄糖水溶液為溶劑。
[0057] 上述治療和/或預防腫瘤的產品（如藥物或疫苗）中，所述粉針劑可以甘露醇為 凍干保護劑。
[0058] 上述粉針劑的制備方法，也屬于本發明的保護范圍。
[0059] 上述粉針劑的制備方法，包括樣品準備、預凍、一次干燥（升華干燥）、二次干燥 (解吸干燥）和密封保存五個步驟。
[0060] 實驗結果顯示，本申請的dsRNA21或其修飾物能顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖：鼻 咽癌細胞在經V -0Me-dsRNA21處理48h時，2' -0Me-dsRNA21抑制了 27.7%的鼻咽癌 細胞增殖；在經W -0Me-dsRNA21處理72h時，2' -0Me-dsRNA21抑制了 33. 7%的鼻咽癌 細胞增殖；在經，-0116-(181?隱21處理9611時，2'-016-(181?隱21抑制了30.7%的鼻咽癌 細胞增殖；在經W -0Me-dsRNA21處理10天時，鼻咽癌細胞的克隆數為320個± 13個，經 2' -OMe-NC處理的鼻咽癌細胞的克隆數為147個±14個。
[0061] 本申請的dsRNA21或其修飾物能抑制細胞從G1期向S期的過渡：經 2' -0Me-dsRNA21處理的S期鼻咽癌細胞中含有Edu細胞的百分比為21.94±3. 08%， 經2' -〇Me-NC處理的S期鼻咽癌細胞中含有Edu細胞的百分比為37. 5±4. 49%，調控細 胞周期的關鍵因子⑶K4基因在經V -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細胞中的表達為在經 2' -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞中的表達的74. 3%，CCND3基因在經W -0Me-dsRNA21處 理的鼻咽癌細胞中的表達為在經2' -OMe-NC處理的鼻咽癌細胞中的表達的60. 8%。
[0062] 本申請的dsRNA21或其修飾物能抑制腫瘤重量、腫瘤體積的增加：NC組裸鼠腫瘤 的平均重量為0. 043g±0. 015g，dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均重量為0. 023g±0. 0084g ;注 射針劑兩天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為30. 74mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為 20. 53mm3 ;注射針劑四天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為37. 74mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的 平均體積為30. 41mm3 ;注射針劑六天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為65. 20mm3, dsRNA21組 裸鼠腫瘤的平均體積為45. 27mm3 ;注射針劑八天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為75. 21mm3， dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為51. 94mm3 ;注射針劑十天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積 為93. 97mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為73. 05mm3。
[0063] 實驗表明，本申請的2' -0Me-dsRNA21或其修飾物能夠有效抑制腫瘤和腫瘤細 胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0064] 圖1為分別經W -0Me_dsRNA21和W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞個數。其中， dsRNA21表示V -0Me-dsRNA21，miR-NC表示V -〇Me-NC，圖A為鼻咽癌細胞在分別經 2 ^ -0Me-dsRNA21和W -〇Me-NC處理96小時細胞個數變化情況；圖B為鼻咽癌細胞在經 2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC處理96h內細胞個數的變化曲線；圖C為鼻咽癌細胞在 分別經W -0Me-dsRNA21和V -〇Me-NC處理72小時的外觀圖；圖D為鼻咽癌細胞在經 2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC處理10天后的細胞個數。
[0065] 圖2為經W -0Me-dsRNA21和2' -〇Me_NC處理的S期鼻咽癌細胞中含有Edu的 細胞。其中，NC表示W -0Me-NC，dsRNA21表示W -0Me-dsRNA21。左圖為共聚焦顯微鏡 下W -0Me-dsRNA21或W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞中Edu陽性的細胞；右圖為統計計 算W -0Me-dsRNA21或W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞中含有Edu的細胞占總細胞的百分 比。
[0066] 圖3為經2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞中CCND3和CDK4的 表達情況。其中，圖A為CCND3和⑶K4的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，圖B為CCND3和⑶K4 的實時熒光定量檢測結果，Cyclin D3表示CCND3，dsRNA21表示W -0Me-dsRNA21，miR-NC 表示 W -〇Me-NC。
[0067] 圖4為分別經W -0Me_dsRNA21和W -〇Me-NC處理的裸鼠腫瘤重量、體積及外 觀。其中，圖A為裸鼠的腫瘤體積，圖A中的"D"表示"天"，"MM3"表示"立方毫米";圖B為 第5次注射針劑的兩天后（即實驗的第10天）裸鼠的腫瘤重量；圖C為第5次注射針劑的 兩天后（即實驗的第10天）裸鼠的腫瘤外觀。dsRNA21表示V -0Me-dsRNA21，NC表示 2， -〇Me-NC。

【具體實施方式】
[0068] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0069] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0070] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0071] 下述實施例中的BALB/C裸鼠為廣東省實驗動物中心產品。
[0072] 下述實施例中的鼻咽癌細胞均為鼻咽癌細胞系（CNE細胞系），CNE細胞系為昆明 細胞庫產品，保藏編號為KCB 86019YJ。
[0073] 實施例 1、2' -0Me_dsRNA21 的制備
[0074] dsRNA21的一條鏈的從5'端至3'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 1，所述 dsRNA21的另一條鏈的從3'端至5'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 2。其中，SEQ ID No. 1由21個核糖核苷酸組成，SEQ ID No. 2由21個核糖核苷酸組成，SEQ ID No. 1的 第1-19位核糖核苷酸與SEQ ID No. 2的第3-21位核糖核苷酸反向互補，將二者形成的雙 鏈RNA命名為dsRNA21。本發明選擇隨機雙鏈RNA作為陰性對照，該隨機雙鏈RNA的名稱為 NC，NC的一條鏈的從5'端至3'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 3，NC的一條鏈的從 3'端至5'端的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 4。將dsRNA21的SEQ ID No. 2所示鏈中 所有胞苷酸的2' -OH均取代為甲氧基且SEQ ID No. 1所示鏈未進行修飾得到的dsRNA21 的修飾物命名為2' -0Me-dsRNA21。將NC的SEQ ID No. 4所示鏈中所有胞苷酸的2' -OH 均取代為甲氧基且SEQ ID No. 3所示鏈未進行修飾得到的NC的修飾物命名為W -OMe-NC。
[0075] 2 ^ -0Me_dsRNA21 和 Y -〇Me-NC 委托上海吉瑪（GenePharma)制藥技術有限 公司合成(ffincott F, DiRenzo A, Shaffer C, GrimmS, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C,Scaringe S and Usman N.Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res. 1995, 23:2677-84) 〇
[0076] 實施例2』-0Me_dsRNA21對腫瘤細胞增殖的影響
[0077] 實驗重復三次，每次實驗的方法如下：
[0078] 將實施例1得到的2 ' -0Me-dsRNA21粉末溶解于無 RNA酶的無菌水中，使其 終濃度為 20pmol/L，得到 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液。分別取 5 μ L 該 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液和5μ L的lipofectamine 2000(Invitrogen)，將其分別稀釋于245μ L的無血清 培養基（Opti-ΜΕΜ)中，分別得到V -0Me-dsRNA21無血清培養液和lipofectamine 2000無血清培養液，將lipofectamine 2000無血清培養液在室溫下孵育5分鐘，然后 將2 ' -0Me-dsRNA21無血清培養液與lipofectamine 2000無血清培養液混合，得到 2 ^ -0Me-dsRNA21-脂質體復合物培養液500 μ L，并將該W -0Me-dsRNA21-脂質體復合物 培養液于室溫靜置20分鐘。
[0079] 用含10%胎牛血清的DMEM液體培養基（10% FBS-DMEM液體培養基，GIBC0產品） 培養鼻咽癌細胞（CNE，昆明細胞庫，保藏編號為KCB 86019YJ)，收集處于對數生長期的鼻 咽癌細胞培養液，用上述含10%胎牛血清的DMEM液體培養基調整處于對數生長期的鼻咽 癌細胞培養液中細胞濃度，使細胞終濃度為30000個/mL，得到稀釋鼻咽癌細胞培養液，向6 孔板中分別加入100 μ L該稀釋鼻咽癌細胞培養液，使每孔中細胞含量為3000個，并用上述 含10%胎牛血清的DMEM液體培養基將每孔中培養液的體積補至2mL，得到含有鼻咽癌細胞 液的6孔板。將該含有鼻咽癌細胞液的6孔板置于含5% C02的37°C的孵箱中培養12小 時，使細胞貼壁。
[0080] 分別向上述細胞貼壁后的6孔板的每孔中加入500μ L上述W -0Me-dsRNA21-脂 質體復合物培養液及1500 μ L無血清DMEM培養基（Opti-MEM)進行轉染，得到 2' -0Me-dsRNA21細胞培養液。將2' -0Me-dsRNA21細胞培養液置于含5%0)2的37°〇的 孵箱中培養6小時后，將培養基更換為10% FBS-DMEM液體培養基，正常條件下繼續培養，在 培養過程中每3天按照上述方法轉染一次，培養10天后，得到經W -0Me-dsRNA21處理的 鼻咽癌細胞。
[0081] 按照上述方法，2' -0Me_dsRNA21替換為Y -〇Me-NC，其余步驟不變，得到經 2' -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞。
[0082] 將經2' -0Me_dsRNA21處理的鼻咽癌細胞和經2' -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞分 別用冷甲醇固定，并分別用結晶紫染色，而后用Gel-Pro計數器分別對經2' -0Me-dsRNA21 處理的鼻咽癌細胞克隆數和經2 ' -OMe-NC處理的鼻咽癌細胞克隆數進行計數，計算鼻 咽癌細胞增殖抑制率（鼻咽癌細胞增殖抑制率=C -OMe-NC處理的鼻咽癌細胞克隆 數-2' -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細胞克隆數）/2^ -OMe-NC處理的鼻咽癌細胞克隆 數），結果如圖1所示。
[0083] 結果顯示，鼻咽癌細胞在經V -0Me-dsRNA21處理48h時，2，-0Me-dsRNA21抑 制了27.7%的鼻咽癌細胞增殖；在經2 /-0116-(181?隱21處理7211時，2/-016-(181?隱21抑 制了33.7%的鼻咽癌細胞增殖 ；在經2^-016-(181?隱21處理9611時，2/-016-(181?隱21 抑制了 30. 7%的鼻咽癌細胞增殖；在經Y -0Me-dsRNA21處理10天時，鼻咽癌細胞 的克隆數為147個±14個，經Y -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞的克隆數為320個±13 個，2 ' -0Me-dsRNA21抑制了 54. 1 %的鼻咽癌細胞增殖。表明和經2 ' -〇Me-NC處理 的鼻咽癌細胞相比，經2' -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細胞的克隆數明顯減少，說明 2' -0Me-dsRNA21能顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖。
[0084] 實施例3、2' -0Me_dsRNA21對細胞周期的影響
[0085] 實驗重復三次，每次實驗的方法如下：
[0086] 用含10%胎牛血清的DMEM液體培養基（10% FBS-DMEM液體培養基，GIBC0產品） 培養鼻咽癌細胞培養18小時，得到DMEM細胞培養液。將DMEM細胞培養液在4°C 5000轉/ 分鐘下離心，得到鼻咽癌細胞。用不加青霉素和鏈霉素的含10%胎牛血清的DMEM液體培養 基重懸鼻咽癌細胞，用移液槍吹打均勻，得到鼻咽癌細胞FBS-DMEM培養液。用不加青霉素 和鏈霉素的含10%胎牛血清的DMEM液體培養基調整鼻咽癌細胞培養液中細胞濃度，得到 細胞濃度為2,000,000個細胞/mL的鼻咽癌細胞細胞液，將該細胞液分種于6孔板中，每孔 100 μ L，即每孔中含200,000個鼻咽癌細胞，得到含有鼻咽癌細胞液的6孔板。
[0087] 分別取 lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5 μ L、實施例 2 中的 2' -〇Me_dsRNA21 溶液10 μ L，分別稀釋于250 μ L無血清培養基（Opti-MEM)中，分別得到2' -0Me-dsRNA21 無血清培養液和lipofectamine 2000無血清培養液，將lipofectamine 2000無血清培養 液在室溫下孵育5分鐘，然后將2' -0Me-dsRNA21無血清培養液與lipofectamine 2000無 血清培養液混合，得到2' -0Me-dsRNA21-脂質體復合物培養液。將2' -0Me-dsRNA21-脂 質體復合物培養液于室溫靜置20分鐘。將上述W -0Me-dsRNA21-脂質體復合物培養液 與無血清的DMEM培養液按照體積比為1:3的比例混合后取2mL，加到上述鼻咽癌細胞液 的6孔板中，得到V -0Me-dsRNA21細胞培養液。將V -0Me-dsRNA21細胞培養液在細 胞培養板上在5% C0237°C的培養箱中培養6小時，得到2' -0Me-dsRNA21轉染細胞液，將 2' -0Me-dsRNA21轉染細胞液在4°C 5000轉/分鐘下離心，得到W -0Me-dsRNA21轉染后 的細胞，將2' -0Me-dsRNA21轉染后的細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸鼻咽癌 細胞，用移液槍吹打均勻，得到W -0Me-dsRNA21轉染的細胞培養液，將W -0Me-dsRNA21 轉染的細胞培養液于含5% C02的37°C的孵箱中繼續培養48小時，得到W -0Me-dsRNA21 鼻咽癌細胞FBS-DMEM培養液。
[0088] 按照上述方法，將W -0Me_dsRNA21替換為W -〇Me-NC，其他操作步驟不變，得到 2 ^ -〇Me-NC鼻咽癌細胞FBS-DMEM培養液。
[0089] 48小時后，分別用羥基脲同步處理V -0Me-dsRNA21鼻咽癌細胞FBS-DMEM培 養液中的鼻咽癌細胞和2' -OMe-NC鼻咽癌細胞FBS-DMEM培養液中的鼻咽癌細胞，使鼻 咽癌細胞處于G1期，其他操作均按照Click-iT EdU Alexa Fluor 488熒光試劑盒（Life Technologies，C10337)說明書進行。
[0090] 激光共聚焦顯微鏡下觀察2' -0Me-dSRNA21鼻咽癌細胞FBS-DMEM培養液中的鼻 咽癌細胞和2' -OMe-NC鼻咽癌細胞FBS-DMEM培養液中的鼻咽癌細胞，并用成像軟件定量 計算，結果如圖2所示。
[0091] 結果顯示，經V -0Me_dsRNA21處理的S期鼻咽癌細胞中含有Edu細胞的百分 比為21.94±3. 08%，經2' -〇Me-NC處理的S期鼻咽癌細胞中含有Edu細胞的百分比為 37. 5±4. 49%，表明與轉染2' -〇Me-NC的鼻咽癌細胞相比，轉染2' -0Me-dsRNA21的鼻咽 癌細胞S期含有Edu的細胞顯著減少。
[0092] 實施例4、2< -0Me_dsRNA21對靶基因表達的抑制作用
[0093] 取實施例3中的V -0Me_dsRNA21鼻咽癌細胞FBS-DMEM培養液和W -〇Me-NC 鼻咽癌細胞FBS-DMEM培養液，培養42小時后，分別收集2' -0Me-dsRNA21轉染的鼻咽癌細 胞和W -〇Me-NC轉染的鼻咽癌細胞，分別進行周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)基因和細胞周期蛋白D3(cyclin D3, CCND3)基因的表達檢測。
[0094] 實驗重復三次，每次重復實驗的步驟如下：
[0095] 按照TRIzol提取RNA的方法提取2' -0Me-dsRNA21轉染的鼻咽癌細胞的總RNA， 得到含有 DNA 的 2' -0Me-dsRNA21 總 RNA。用 DNase I(RNase-free) (TaKaRa)于 37°C 下消化 處理含有DNA的W -0Me-dsRNA21總RNA 30分鐘，降解含有DNA的W -0Me-dsRNA21總RNA 中的DNA，得到DNA降解后的含有DNA的2' -0Me-dsRNA21總RNA。按照DNase I產品說明重 新提取DNA降解后的含有DNA的W -0Me-dsRNA21總RNA中的RNA，得到W -0Me-dsRNA21 總 RNA。將 1 μ g 的 2，-0Me-dsRNA21 總 RNA 與 0· 5 μ g 的 50 μ M Oligo dT (16-18) (Takara 公司產品）混合，加熱5分鐘，迅速冷卻至0°C得到。按TaKaRa公司的M-MLV逆轉錄酶體系 分別加入緩沖液，并于42°C孵育1小時，得到W -0Me-dsRNA21 cDNA。
[0096] 按照上述方法，將W -0Me_dsRNA21轉染的鼻咽癌細胞替換為W -〇Me-NC轉染 的鼻咽癌細胞，其他步驟不變，得到W -〇Me-NC cDNA。
[0097] 以2 ' -0Me-dsRNA21cDNA為PCR反應的模板對靶基因 CCND3 (CCND3的引物 為：CCND3F:TACCCGCCATCCATGATCG，CCND3R:AGGCAGTCCACTTCAGTGC)和 CDK4(CDK4 的 引物為：⑶K4F :CCTACCTTTATATTTGGGGTCCT，CDK4R :GGCCCTGTAATTTAACCAGT)進行半定 量 PCR 檢測，內參為 GAPDH(GAPDH 的引物為：GAPDHF :GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，GAPDHR : GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG)，PCR反應完成后，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3 中A所示。結果表明，經W -0Me-dsRNA21和經W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞中的⑶K4 基因和CCND3基因均有表達，經W -0Me-dsRNA21處理后的鼻咽癌細胞中的⑶K4基因和 CCND3基因的表達均有所降低。與轉染小核酸的陰性對照組比較，轉染W -0Me-dsRNA21 明顯抑制腫瘤細胞的CCND3和⑶K4的表達。
[0098] 分別以上述 W -0Me-dsRNA21cDNA 和上述 W -〇Me_NC cDNA 為模板，以 GAPDH 為 內參（GAPDH 的引物為：GAPDHF :GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，GAPDHR :
[0099] GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG)，按照 Syb 試劑盒使用說明進行 CDK4 基因和 CCND3 基因表達的實時熒光定量檢測，CDK4基因的引物為：CDK4F:CCTACCTTTATATTTGGGGTCCT， CDK4R :GGCCCTGTAAITTAACCAGT，CCND3 基因的引物對為：CCND3F :
[0100] TACCCGCCATCCATGATCG，CCND3R :AGGCAGTCCACTTCAGTGC，結果如圖 3 中 B 所示。結果 顯示，經2' -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細胞中⑶K4基因的表達量為經2' -〇Me-NC處理 的鼻咽癌細胞中⑶K4基因的表達量的74. 3%，經W -0Me-dsRNA21處理的鼻咽癌細胞中 CCND3基因的表達量為經W -〇Me-NC處理的鼻咽癌細胞中CCND3基因的表達量的60. 8 %， 表明經W -0Me-dsRNA21處理后的鼻咽癌細胞中的⑶K4基因和CCND3基因的表達量均有 所降低。
[0101] 實施例5、2' -0Me-dsRNA21凍干粉針劑的制備
[0102] 1、配液
[0103] 將實施例1中的2 ' -0Me-dsRNA21用無 RNA酶的注射用水溶解，得到無 RNA酶 的 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液，該無 RNA 酶的 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液中 2 ' -0Me-dsRNA21 的 含量為2. 29 μ g/ μ L ;將凍干保護劑甘露醇4. 4g用無 RNA酶的注射用水溶解，并用氫氧化 鈉溶液和鹽酸溶液調節其pH為6-7,補加注射用水至100mL，得到凍干保護劑溶液；按照 lmL無 RNA酶的2 ' -0Me-dsRNA21溶液與50mL凍干保護劑溶液的體積比進行混合，得到 2 ^ -0Me-dsRNA21保護劑混合液。
[0104] 2、凍干
[0105] 預凍：將上述2' -0Me-dsRNA21保護劑混合液分裝好于西林瓶中，于-80°C冰箱中 預冷凍過夜。冷凍干燥：將預冷凍的2' -0Me-dsRNA21保護劑混合液抽真空，然后在避光 條件下冷凍干燥，得到W -0Me-dsRNA21凍干粉針劑。
[0106] 按照上述方法，將W -0Me_dsRNA21替換為實施例1中的W -〇Me-NC，其他均不 變，得到W -〇Me-NC凍干粉針劑。
[0107] 將W -0Me_dsRNA21凍干粉針劑與W -〇Me-NC凍干粉針劑密封，低溫保存。
[0108] 實施例6、2< -0Me_dsRNA21對腫瘤生長的抑制作用
[0109] 取4周齡的雄性BALB/C裸鼠10只，分別在每只裸鼠的背側翼部皮下注射0. lmL 鼻咽癌細胞懸液（鼻咽癌細胞懸液中鼻咽癌細胞含量為3 X 105個細胞/mL)，10天后成瘤， 共得到10只背側翼部皮下形成移植瘤的BALB/C裸鼠。將上述10只背側翼部皮下形成移 植瘤的BALB/C裸鼠隨機分為兩組，每組5只，分別為NC組裸鼠和dsRNA21組裸鼠。
[0110] 用無 RNA酶的無菌水11. 3μ L溶解20μ g實施例5中的2' -0Me-dsRNA21凍干 粉針劑，并加入轉染試劑jetPEI (Polyplus公司產品）L 2 μ L，得到V -0Me-dsRNA21和 jetPEI的混合溶液，向2' -0Me-dsRNA21和jetPEI的混合溶液中加入是該溶液等體積的 10%葡萄糖溶液，混合均勻，得到總體積為25μ 1的2' -0Me-dsRNA21針劑。按照上述方 法，將實施例5中的2' -0Me-dsRNA21凍干粉針劑替換為實施例5中的2' -OMe-NC凍干 粉針劑，其他均不變，得到總體積為25 μ 1的W -〇Me-NC針劑。
[0111] 向NC組裸鼠中每只裸鼠的移植瘤內注射上述2' -OMe-NC針劑25μ 1，注射 當天記為實驗的第0天，每只裸鼠每隔1天注射一次上述含有20yg2' -OMe-NC的 2' -OMe-NC針劑25 μ 1，共注射5次；向dsRNA21組裸鼠中每只裸鼠的移植瘤內注射上述 2' -0Me-dsRNA21針劑25μ 1，注射當天記為實驗的第0天，每只裸鼠每隔1天注射一次上 述含有20 μ g2' -0Me-dsRNA21的W -0Me-dsRNA21針劑25 μ 1，共注射5次。每次注射針 劑前（即實驗的第0天、第2天、第4天、第6天、第8天）和第5次注射針劑的兩天后（即 實驗的第10天）用游標卡尺測量分別測量NC組裸鼠和dsRNA21組裸鼠的腫瘤最長徑（L) 和橫徑（S)，并計算腫瘤的近似體積。計算公式為：V(mm3) =0.5XLXS2。在每組的裸鼠第 5次注射針劑的兩天后（即實驗的第10天），取出每組中每只裸鼠的腫瘤，并測量腫瘤體 積、稱量腫瘤重量、拍照記錄，結果如圖4所示。
[0112] 實驗結果顯示，NC組裸鼠腫瘤的平均重量為0. 043g±0. 015g，dsRNA21組裸鼠 腫瘤的平均重量為〇. 〇23g±0. 0084g。注射針劑兩天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為 30. 74mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為20. 53mm3 ;注射針劑四天時，NC組裸鼠腫瘤的 平均體積為37. 74mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為30. 41mm3 ;注射針劑六天時，NC組 裸鼠腫瘤的平均體積為65. 20mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為45. 27mm3 ;注射針劑八 天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為75. 21mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積為51. 94mm3 ; 注射針劑十天時，NC組裸鼠腫瘤的平均體積為93. 97mm3, dsRNA21組裸鼠腫瘤的平均體積 為73. 05mm3。結果表明，與NC組裸鼠相比，dsRNA21組裸鼠腫瘤重量、腫瘤體積的增加明顯 小，2' -0Me-dsRNA21針劑明顯抑制了裸鼠腫瘤的生長。
【權利要求】
1. 雙鏈RNA或其修飾物在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑制劑中的應用，所述雙鏈RNA 的一條鏈序列為序列表中SEQ ID No. 1，所述雙鏈RNA的另一條鏈序列為序列表中SEQ ID No. 2。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述雙鏈RNA的修飾物是經過下述A1)或 A2)或A3)修飾得到的雙鏈RNA修飾物： A1)對所述雙鏈RNA的核糖的2' -0H進行修飾； A2)對所述雙鏈RNA的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾； A3)對所述雙鏈RNA的核糖的5'端連上膽固醇的修飾。
3. 與權利要求1或2中所述雙鏈RNA相關的生物材料在制備腫瘤抑制劑或腫瘤細胞抑 制劑中的應用，所述生物材料為下述Bl)-B12)中的任一種： B1)編碼權利要求1或2中所述雙鏈RNA的DNA分子； B2)含有B1)所述DNA分子的表達盒； B3)含有B1)所述DNA分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達盒的重組載體； B5)含有B1)所述DNA分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物； B9)含有B1)所述DNA分子的轉基因動物細胞系； B10)含有B2)所述表達盒的轉基因動物細胞系； B11)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系； B12)含有M)所述重組載體的轉基因動物細胞系； B13)含有B1)所述DNA分子的轉基因植物細胞系。
4. 根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于：所述腫瘤抑制劑為抑制腫瘤發 生的抑制劑和/或抑制腫瘤生長的抑制劑。
5. 根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于：所述腫瘤細胞抑制劑為抑制腫 瘤細胞增殖的產品和/或促進腫瘤細胞凋亡的產品。
6. 下述Ml)或M2)的用途： Ml)權利要求1或2中所述的雙鏈RNA或所述雙鏈RNA的修飾物在制備抑制腫瘤細胞 周期蛋白D表達試劑中的應用； M2)權利要求1或2中所述的雙鏈RNA或所述雙鏈RNA的修飾物在制備抑制腫瘤細胞 周期蛋白依賴性激酶4表達試劑中的應用。
7. 下述M3)或M4)的用途： M3)權利要求3中所述的生物材料在制備抑制腫瘤細胞周期蛋白D表達試劑中的應 用； M4)權利要求3中所述的生物材料在制備抑制腫瘤細胞周期蛋白依賴性激酶4表達試 劑中的應用。
8. 治療和/或預防腫瘤的產品，其活性成分為權利要求1或2中所述的雙鏈RNA或所 述雙鏈RNA的修飾物。
9. 治療和/或預防腫瘤的產品，其活性成分為權利要求3中所述的生物材料。
10. 根據權利要求8或9所述的產品，其特征在于：所述治療和/或預防腫瘤的產品為 治療和/或預防腫瘤的藥物，所述藥物的劑型為粉針劑。
【文檔編號】A61K39/00GK104147616SQ201410383877
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月6日 優先權日:2014年8月6日
【發明者】王糾, 張雅鷗, 吳江斌, 何杰, 許乃寒, 謝偉東 申請人:清華大學深圳研究生院