治療的制作方法

專利名稱：治療的制作方法
治療本發明涉及以炎性成分為特征之病癥的治療，特別是用來源于可食用植物的提取物和可來源于這些植物的活性劑的治療。許多醫學病癥的特征為具有炎性成分，其可表現為白細胞、血小板或內皮細胞不適當地分泌炎癥介質(例如高毒性活性氧中間體(reactive oxygen intermediate, ROI) 或顆粒酶或細胞因子)進入受影響組織中。炎癥是有助于許多癌癥(例如腸癌、前列腺癌和白血病)的發展和病變的主要因素，并且其是糖尿病(1型和2型)和動脈粥樣硬化疾病的特征。具有炎癥特征的其它病癥的實例包括但不限于炎性腸病(IBD)、類風濕性關節炎 (RA)、貝切特氏病、ANCA相關性血管炎、系統性血管炎、囊性纖維化、哮喘、皮炎和銀屑病。炎性腸病(IBD)是用于描述胃腸道的特發性慢性炎癥的術語，其包括兩種主要表型克羅恩病(CD)和潰瘍性結腸炎(UC)。克羅恩病的特征是肉芽腫性炎癥，其影響胃腸道的任何部分，尤其是回盲區。潰瘍性結腸炎是結腸特異性的，并且伴有廣泛的上皮損傷、隱窩膿腫和大量的粘膜嗜中性粒細胞。患有廣泛UC或結腸克羅恩病的患者發生結腸直腸癌的風險增加約10倍，結腸直腸癌代表IBD相關死亡的主要原因。考慮到IBD的使人虛弱的性質，以及與IBD相關的死亡，需要提供這些病癥的新的和改進的治療。作為其它實例，類風濕性關節炎(RA)是一種特征為關節滑膜發炎的炎性病癥，關節滑膜發炎導致組織損傷，并最終導致關節破壞。減少炎性損傷的能力是有吸引力的。然而，目前對于RA的治療無論是在充分抑制疾病活性的能力方面還是在其不可接受的副作用方面都是不夠的。當今的治療可以認為是傳統(常規)治療和生物治療。“傳統”藥物一般而言是意外發現的，其中發現為完全不同的病癥而研發的藥物對于RA也有益。生物治療劑的生產昂貴，并且生物制品的生產能力不能滿足需要。異硫氰酸酯(ITC)是來源于植物的有機分子，其包含化學基團N = C = S。ITC是通過用硫替代異氰酸酯基中的氧而形成的。異硫氰酸烯丙酯是ITC的一個實例，其發現于芥子油中，決定了芥子油的辛辣味。蕓苔屬(Brassica)植物可富含ITC。例如，花椰菜在其小花中積聚4_甲基亞磺酰基丁基和3-甲基亞磺酰基丙基葡糖異硫氰酸酯。這些葡糖異硫氰酸酯分別在組織損傷后被植物硫葡糖苷酶(“黑芥子酶”，myrosinase)轉化為ITC 萊菔硫烷(sulforaphane，SF)、 芥酸精(erucin，ER)和iberin (IB)，或者，如果該黑芥子酶已在冷凍之前通過烹煮或漂白而變性，則通過已攝入所述植物的對象結腸中的微生物硫葡糖苷酶進行上述轉化(參見圖 1)。SF和IB被腸細胞被動吸收，與谷胱甘肽綴合，并經由巰基尿酸途徑被轉運至體循環進行代謝，主要作為N-乙酰半胱氨酸綴合物在尿中排泄。在攝入花椰菜之后，血漿中45%的 SF作為游離SF存在而不是硫醇綴合物，SF及其硫醇綴合物的峰濃度低于2 μ Μ,在幾小時內下降至低(ηΜ)水平。ITC(比如異硫氰酸苯乙基酯(PEITC)和SF)已經顯示出抑制癌發生和腫瘤發生， 因此可用作對抗癌癥發生和增殖的化學預防劑。它們可以在多種水平上起作用。最值得注意的是，它們已經顯示出通過抑制細胞色素Ρ450酶來抑制癌發生，細胞色素Ρ450酶將化合物(如苯并[a]芘及其它多環芳烴(PAH))氧化成極性更高的環氧二醇，其隨后可引起突變和誘導癌癥發生。在某些癌細胞系中，PEITC還顯示出誘導凋亡，并且在某些情況下，甚至能夠誘導對某些目前使用的化療藥物有抗性的細胞發生凋亡。仍需要開發可用于預防或治療具有炎性成分的醫學病癥的新的和改進的組合物， 滿足這一需要是本發明的一個目的。根據本發明的第一個方面，提供了一種用于預防或治療以具有炎性成分為特征的醫學病癥的組合物，其包含治療有效量的異硫氰酸酯(ITC)或其前體。根據本發明的第二個方面，提供了治療有效量的異硫氰酸酯(ITC)或其前體，用作用于預防或治療以具有炎性成分為特征的醫學病癥的藥物。根據本發明的第三個方面，提供了一種用于治療以具有炎性成分為特征的醫學病癥的方法，包括向需要此治療的對象施用治療有效量的ITC或其前體。“以具有炎性成分為特征的醫學病癥”意指至少部分特征為不適當地分泌炎癥介質(例如高毒性活性氧中間體(ROI)或顆粒酶或細胞因子)的任何醫學病癥。這些病癥的實例包括但不限于炎性腸病(IBD)、類風濕性關節炎(RA)、貝切特氏病、ANCA相關性血管炎、系統性血管炎、囊性纖維化病、哮喘、皮炎和銀屑病。炎癥也是有助于許多癌癥的發生和病變的主要因素。因此，具有炎性成分的癌癥(例如，腸癌、前列腺癌和白血病)也包括在所述醫學病癥的定義之內。炎癥也是糖尿病(1型和2型)和動脈粥樣硬化疾病的特征，這些病癥也涵蓋在所述術語中。“異硫氰酸酯(ITC)，，意指包含化學基團N = C = S的可來源于植物的有機分子。 ITC是通過用硫替代異氰酸酯基中的氧而形成的。“ITC”還包括可容易地代謝而形成ITC 的葡糖異硫氰酸酯前體。優選的ITC可來源于蕓苔(例如花椰菜或芝麻菜(rocket))，包括萊菔硫烷(SF)Uberin(IB)和芥酸精(ER，4_甲基硫丁基異硫氰酸酯)。優選的ITC (比如 SF和IB)不具有與某些飲食性ITC (例如來自芥菜的異硫氰酸烯丙酯)相關的刺激性味覺性質。“其前體”意指可以由植物天然產生的植物化學物質，其可以轉化為活性ITC。特別地，我們意指可以在蕓苔(比如芝麻菜或花椰菜)中發現的葡糖異硫氰酸酯和葡糖異硫氰酸酯衍生物(例如葡糖異硫氰酸酯的吲哚衍生物)，其可以被植物硫葡糖苷酶(例如在植物組織損傷后)或已攝入了包含所述前體之組合物的對象結腸中的微生物硫葡糖苷酶轉化為ITCoITC的來源應當理解，根據本發明使用的ITC可以是化學合成的，或者可以來源于任何天然或非天然(例如遺傳修飾的微生物或細胞系)來源。然而，根據本發明的一個優選實施方案，所述ITC或其前體來源于植物，優選十字花科(Brassicaceae)或山柑科(Capparaceae)的植物。優選地，所述ITC可來源于蕓苔屬 (Brassica)植物，更優選地，所述ITC來源于芥菜、花椰菜或芝麻菜。最優選地，所述ITC可來源于芝麻菜(例如Eruca和Diplotaxis spp)。應當理解，當ITC來源于蕓苔時，可以從植物中分離并純化該化合物。在某些情況下(例如當活性ITC需要藥物級純度時)，這樣的純化可能是所期望的。然而，在許多情況下，比如在食品、飲料或營養品中，制備富含ITC的植物提取物可能是優選的。植物提取物代表本發明的一個重要實施方案，根據本發明的第四個方面，提供了一種用于預防或治療以具有炎性成分為特征的醫學病癥的植物提取物，其中所述植物提取物富含ITC或其前體。根據本發明的第五個方面，提供了富含ITC或其前體的植物提取物，用作用于預防或治療以具有炎性成分為特征的醫學病癥的藥物。根據本發明的第六個方面，提供了一種用于預防或治療以具有炎性成分為特征的醫學病癥的方法，包括向需要此預防或治療的對象施用治療有效量的富含ITC或其前體的植物提取物。“富含ITC的植物提取物”意指植物已經過處理，從而使ITC和其前體在所述提取物中保持活性形式。可以將所述植物進行處理，使得與未處理的植物中的濃度相比，提取物中ITC的濃度升高。或者，所述提取物可以包含基本上為活性的ITC或其前體，其濃度可以與未處理的植物中的約相同(或者如果進行了實質性稀釋，則其濃度甚至更低)。盡管我們不希望受到任何假說的束縛，但是基于對這一科學領域的理解，特別是考慮到實施例1中的研究工作，本發明人認為本發明的化合物、提取物和組合物可用于治療和預防以具有炎性成分為特征的醫學病癥。發明人證實了 ITC與細胞因子結合；促進抗炎信號傳導通路(例如Smad活化)；和減少促炎細胞因子IL-6的表達。這證實了 ITC及其前體、以及富含ITC和/或其前體的植物提取物可用于調節本發明的病癥。富含ITC的棺物提取物的制備優選地，所述富含ITC的植物提取物是基于十字花科或山柑科的植物(包含葡糖異硫氰酸酯的植物)。優選地，所述植物提取物來自十字花科蕓苔屬。優選的提取物來源于植物比如芥菜、花椰菜或芝麻菜。最優選地，所述植物提取物為芝麻菜(例如Eruca和Diplotaxis spp)提取物。應當理解，可以通過壓碎植物葉、莖或種子(優選地在最高25°C的溫度下)來制備植物粗提取物。然后，可以在水溶液中將壓碎的葉勻漿，以形成本發明的液體植物提取物。 可以通過離心使植物固體沉淀，并且可以使用上清液(包含ITC)作為本發明的提取物。優選地，從來自幼小植物(例如觀-42天的芝麻菜植物)和/或幼苗(例如至多 14天的芝麻菜植物)的鮮葉制備所述植物提取物。包含ITC的優選提取物來源于干燥的鮮葉或幼苗(例如通過風干或急速冷凍 (snap freezing)干燥和冷凍干燥)。然后可以通過如下方法加工所述干燥的物質(a)研磨成細粉。(b)通過用水或其它水溶液混合粉末而制備該磨碎粉末的懸浮液，得到含有最少 10%固體和最多50%固體的混合物。(c)然后從該懸浮液中提取ITC。這可以使用逆流提取器或索氏(Soxhlet)型提取器來實現，所述逆流提取器裝有用于使萃取的揮發物保持在溶液中的蒸汽捕集器，所述索氏型提取器在減壓下操作并裝有回流冷凝器。提取應進行直到來自芝麻菜的最少50%、 優選> 70%的天然葡糖異硫氰酸酯在天然酶的作用下已轉化成ITC。(d) —旦提取完成，就可以通過離心分離或傾析從所述懸浮液中除去固體。可以通過化學或酶方法、或者過濾(例如超濾)使富含ITC的上清液脫蛋白，并通過低溫高真空蒸發進行濃縮，或者通過反滲透除去水。(e)最終提取物可以作為液體冷凍貯存，或者噴霧干燥得到粉末，或者包囊(例如，包囊在脂肪基質中，或多糖基質中，或聚合物基質中)以提高穩定性。在另一個優選的實施方案中，可以使用種子(例如芥菜或芝麻菜種子)作為起始原料。在種子的情形下，風干是足夠的制備方法，然后，在水的存在下將干種子(例如，使用封閉式壓機)壓碎，得到高固體糊狀物(例如，75%至90%之間的固體)。壓碎應進行直到形成均勻的糊狀物；此后可如上所述進行提取(參見(c)-(e))。應當理解，可以使用幼苗/葉/種子的混合物作為起始原料，以確保制備包含多種結構的ITC提取物。葉和幼苗包含比種子更高水平的4-巰基丁基GLS，種子中的4-甲基硫丁基GLS更高。本發明的另一種優選植物提取物可以富含葡糖異硫氰酸酯(即，根據本發明的 ITC前體)。起始原料可以是如上所述的種子、幼苗或葉子(優選在提取前干燥的)。然后， 可以在乙醇溶液(例如70%-85%的乙醇)中制備經干燥研磨的起始原料的懸浮液，得到含有最少10%固體、最多50%固體的混合物。使用的乙醇優選為食品級的。然后，在反應器(優選裝有捕集揮發物的冷凝器的連續逆流提取器或索氏型提取器)中在約70°C下加熱該乙醇溶液，直到70%至90%的天然葡糖異硫氰酸酯已被提取到乙醇溶液中。然后可以通過離心分離或傾析從所述懸浮液中除去固體，并通過例如減壓蒸發或者通過首先將上清液稀釋至乙醇<40%然后進行反滲透(使用滲濾法)而從上清液中除去乙醇。最終溶液應當包含< 5%的乙醇。該富含葡糖異硫氰酸酯的溶液可以冷凍貯存，或者可以將其噴霧干燥， 以得到不含乙醇的粉末。為了將葡糖異硫氰酸酯轉化成ITC，可以將該富含葡糖異硫氰酸酯的提取物溶于20-30°C的水中，并通過加入純化形式或作為粗芝麻菜種子/芥菜種子糊狀物的一部分的黑芥子酶來進行該轉化。該混合物應孵育直到最少50%、優選> 70%的天然葡糖異硫氰酸酯已經轉化為ITC。可以通過過濾(例如微濾或超濾)從富含ITC的溶液中除去固體物質和蛋白質，然后可以如前所述濃縮提取物。本發明組合物的制劑臨床需要可能決定了上述植物提取物有可能需要基本上“純的”或甚至僅僅稀釋在水溶液中使用。當情況如此時，可將上清液(無論稀釋與否)與多種其它試劑混合，所述其它試劑可因營養原因、醫學原因或甚至用于調節所治療對象攝入之該提取物的可口性的目的而加入。例如，可以將該提取物與奶制品(例如牛奶、奶昔或酸奶)或果汁(例如葡萄汁、 橘子汁等)一起配制，以得到包含ITC或其前體的具有這一額外益處的適口飲料，因此，其作為炎性病癥患者的點心是高度合適的。或者，可以將該植物提取物包含在用于腸道進食的營養液中。例如，可以將上清液與鹽水或水溶液(可以包含其它維生素、礦物質和營養素)混合用于對象的腸道進食。優選地，包含ITC的液體具有的ITC的濃度在1至1000 μ M之間，優選地在10至 100 μ M之間。本發明組合物可以配制成用于摻入到膠囊中的粉末、顆粒或半固體。對于半固體形式而言，可以將ITC或富含ITC的植物提取物溶解或懸浮在粘性液體或半固體賦形劑 (如聚乙二醇)或液體載體(如二醇例如丙二醇、或甘油或植物油或魚油，例如選自橄欖油、 葵花油、紅花油、月見草油、豆油、冷肝油(cold liver oil)、鯡魚油等的油)中。然后可以將其填充到硬明膠或軟明膠類型的膠囊中，或者由硬明膠或軟明膠等同物制備的膠囊中，對于粘性液體或半固體填充物而言，軟明膠或凝膠化等同物的膠囊是優選的。根據本發明，包含ITC或富含ITC的植物提取物的粉末劑特別地可用于制備可用于預防或治療至少部分特征為炎癥之病癥的藥物或營養品。冷凍干燥或噴霧干燥代表了用于制備本發明粉末的優選方法。噴霧干燥產生自由流動的顆粒狀粉末混合物，其具有良好的流動性和快速溶解特征。應當理解，通過上述方案制備的噴霧干燥的或冷凍干燥的粉末代表了根據本發明的優選粉末組合物。一種優選的粉末來自富含ITC的重構植物提取物，其隨后被冷凍干燥或噴霧干燥。粉末組合物可以重構成澄清的/半透明的低粘度飲料。可以重構在水中或上述奶制品或果汁中。應當理解，粉末劑可以包裝扁藥囊(sachet)中，并且當需要或者期望時，由對象重構成飲料。粉末混合物代表著本發明的優選實施方案。這些混合物包括粉末狀ITC或粉末狀的富含ITC的植物提取物與其它成分的混合物。為了營養或醫學原因或者為了改善可口性，可以加入這些成分。所述粉末組合物可以與不同粒徑的砂糖混合，得到不同甜度的自由流動的粉末混合物。或者，可以將天然甜味料或人工甜味料(例如阿司帕坦、糖精等)與所述粉末組合物混合，用于重構成低熱量/熱量降低的甜味飲料。所述粉末混合物可以包含礦物質補充劑。所述礦物質可以是鈣、鎂、鉀、鋅、鈉、鐵及其不同組合中的任一種。粉末混合物還可包含緩沖劑(比如檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖劑)和由碳酸鹽(例如碳酸氫鹽，比如碳酸氫鈉或碳酸氫銨)和固體酸(例如檸檬酸或檸檬酸鹽)形成的泡騰劑。ITC或富含ITC的植物提取物可以作為食品補充劑或食品添加劑存在，或者可以摻入到食品(例如功能食品或營養品)中。這樣的產品可用作主食以及可能是臨床需要的環境下的食品。可以將所述粉末劑加入到點心塊(snack food bar)中，例如水果塊、堅果塊和谷物塊。對于點心塊形式而言，可以將所述粉末與任一種或多種選自干果(比如曬干的番茄、 葡萄干和無籽葡萄干、磨碎的堅果)或谷類(比如燕麥和小麥)的成分混合。應當理解，根據本發明的組合物可以有利地配制成用作藥物的藥品(需要處方或者不需要)。還可以將富含ITC的粉末組合物或濃縮液體提取物摻入到用于口服攝取的片劑、 錠劑、甜味劑或其它食品材料中。還應當理解，可以將這樣的粉末組合物或濃縮液體提取物摻入到可以攝取且能夠長時間將ITC釋放到腸中的緩釋膠囊或裝置中。還可將本發明的組合物微囊化。例如，可以通過藻酸鈣凝膠包囊形成來進行包囊。 κ-角叉菜膠、結冷膠、明膠和淀粉可以用作微囊化的賦形劑。聯合治療應當理解，根據本發明的組合物、藥物和提取物可以單獨使用，或者還可以與其它提取物、組合物或化合物混合(前提是那些化合物不抑制本發明ITC的抗炎性質)。因此， 本發明還包括含有有效量的ITC和其它活性劑的組合物。本發明的組合物、藥物和提取物可以與用于治療本發明醫學病癥的已知治療劑聯合。因而，所述組合物可用于非常有效的聯合治療中。應當理解，所述組合物溶液可以作為用于治療所述病癥的其它治療劑的理想載體。可以與本發明的組合物、藥物和提取物聯合的其它活性劑的實例包括非留體抗炎藥(NSAID)和皮質類固醇。所述組合物、藥物和提取物還可以與靶向特定病癥的其它治療劑聯合。例如，當根據本發明預防或治療RA時，聯合治療可以包括口服活性“改善疾病的” 抗風濕藥物(DMARD)或用于治療RA的生物物質(例如，抗細胞因子抗體和細胞因子受體拮抗劑)。ITC或富含ITC的植物提取物也可以包括在包含益生菌(probiotic)部分的組合 /合成生物治療劑中。在本發明的一個最優選的實施方案中，可以將包含ITC或富含ITC或其前體的植物提取物的組合物與多酚組合。本發明人出乎意料地發現ITC和多酚在用于治療本發明的醫學病癥的聯合治療中非常有效(參見實施例4)。包含ITC和多酚的組合物、或者富含ITC 的植物提取物和多酚代表著本發明的一個重要特征。因此，根據本發明的第七個方面，提供了一種包含治療有效量的ITC和多酚的組合物。這樣的組合物特別地可用于治療本文所述的醫學病癥。所述多酚優選地可來源于水果，更優選地可來源于果皮或果實種子。優選地，所述果品為Vinus spp.。因此，多酚的一個優選的來源可以是葡萄皮或葡萄籽，多酚的最優選的來源是已經過加工使得將來自葡萄皮和籽中的多酚保留在汁液中的葡萄汁。所述多酚優選為原花青素(procyanadin)。或者，所述多酚可以是黃酮類化合物 (例如黃烷醇(flaVan3ol))。最優選的組合治療包含富含ITC的芝麻菜提取物和富含多酚的葡萄提取物。包含多酚的優選植物提取物包含原花青素并且來源于葡萄皮和/或葡萄籽。可以使用本領域已知的方法制備粉末化葡萄皮/籽提取物。在根據本發明使用之前，可以將這些粉末進一步加工。例如，可以將粉末化葡萄皮/籽提取物溶于MeOH中；加熱到約70°C (例如10-30分鐘)；離心(例如在約4500rpm下15分鐘)；并過濾至0. 45 μ。這得到了包含原花青素(procyanidin)的溶液，可以將其濃縮、粉末化或稀釋(根據需要)，并根據本發明使用。包含多酚的最優選植物提取物是使用紅或白葡萄皮(理想地與其籽和莖一起)作為提取起始原料制備的。葡萄釀酒加工固體廢物代表理想的起始原料。新鮮的葡萄(優選結實的)是另一種合適的起始原料。最理想的起始原料包含比皮比例更多的籽和莖。如果是新鮮獲得的，例如葡萄釀酒固體廢物，則可以通過風干(例如在熱帶式干燥機上)干燥葡萄皮/籽混合物。然后，應當將干燥的起始原料細細研磨，得到粒徑<250 微米的粉末。可以通過連續提取，優選地通過逆流提取器在乙醇/水混合物或丙酮/乙醇 /水混合物中進行包含高比例原花青素的高級多酚提取物的制備。如果存在高比例的葡萄皮，則可以通過加入例如鹽酸、檸檬酸或酒石酸來酸化提取物，使得pH范圍在1. 5至4之間，以提高回收率。這并不總是必需的，特別是如果籽的比例高的話。所述提取物應當包含 45%至65%的乙醇，并且可以另外包含至多15%的丙酮。提取可以進行一次，但優選地可以進行兩次或三次連續的提取過程，以使回收率最大。一旦提取完成，可以通過離心分離或傾析從所述懸浮液中除去固體。可以通過化學或酶方法，或者通過過濾(例如超濾)使富含原花青素的上清液脫蛋白，并通過低溫高真空蒸發進行濃縮，或者通過反滲透除去水。最終提取物可作為液體冷凍貯存，或者噴霧干燥得到粉末，或者包囊(例如，包囊在脂肪基質中，或多糖基質中，或聚合物基質中)以提高穩定性。包含多酚的優選提取物中原花青素的濃度為0. 1至10g/l，優選為0. 5至1. 5g/l。根據本發明的第七個方面，一種優選的組合物包含富含多酚(如原花青素)的葡萄汁和富含SF或ER的芝麻菜提取物。本發明人發現這樣的組合物對于預防或減少炎癥反應特別有效。或者，可以根據本發明的第七個方面開發包含多酚的液體制劑和粉末。根據本發明的第七個方面的最優選組合物包含治療有效量的原花青素(來源于葡萄皮或葡萄籽)和治療有效量的ITC(例如來源于芝麻菜)。這樣的組合物可以包括含有粉末的食品或飲料，所述粉末包含原花青素和ITC。然而，最優選的組合物包含含有原花青素和ITC的包囊液體、半固體或粉末(如上所述)。最優選地，所述組合物是包含ITC和原花青素的明膠包囊的液體，ITC的濃度在1至1000 μ M之間，優選在10至100 μ M之間，原花青素的濃度在0. 1至10g/l之間，優選地在0. 5至1. 5g/l之間。可以進行富含ITC的提取物/富含原花青素的提取物的包囊，以便a)通過防止暴露于氧化而提高所述提取物的穩定性，和b)改變所述提取物/混合物的感覺特征(例如減少臭味)。可以通過首先制備所述提取物在乙醇溶液中的溶液(濃度為在50%至70%的干物質)來進行包囊。乙醇的濃度可以為0%至10%。ITC提取物與原花青素提取物的比例可以是3 1或5 1或10 1。應當將制備的溶液與合適的包囊用殼基質等體積混合。 例如，脂肪混合物、或多糖(如藻酸鹽)的溶液、或聚合物材料(如殼聚糖)的溶液。該混合物應當在不超過90°C的溫度下充分地勻漿化，并通過噴霧干燥、或通過形成氣霧劑和冷卻，或通過其它已知的包囊技術形成顆粒。最終粒徑應當不超過100微米。得到的膠囊可以是硬殼的或軟殼的，應當包含最少10% w/w的提取物，優選20%至50% w/w的提取物。劑量方案本發明的組合物可以以單位劑型的形式存在，所述單位劑型包含(a)確定濃度的ITC(或其前體)或包含ITC或其前體的植物提取物，如在本發明的第一至第六個方面中所定義的；或(b)確定濃度的ITC (或其前體)或包含ITC或其前體的植物提取物，和確定濃度的多酚或包含多酚的植物提取物，所述多酚或包含多酚的植物提取物如在本發明的第七個方面所限定的。可以選擇這樣的單位劑型，從而獲得期望水平的生物活性。對象所需的本發明組合物的量由生物活性和生物利用度決定，所述生物活性和生物利用度進而取決于劑型、施用方式、ITC或植物提取物的物理化學性質以及ITC或提取物是作為單一治療還是聯合治療(例如，與根據本發明的第七個方面的多酚)使用。通常，成年人的日劑量應當為0. Ig至IOOg冷凍干燥的或噴霧干燥的粉末(無論以何種方式制備的)，更優選地，所述日劑量為Ig至30g (例如約5g、IOg或15g，根據需要而定)。本發明的固體或半固體劑型可以包含多達約IOOOmg的包含ITC或其前體的干提取物。施用頻率還受到上述因素的影響，特別是所述ITC或其前體在所治療對象體內的半衰期、以及所述多酚(如果使用)在所治療對象體內的半衰期。例如，半衰期將受到對象的健康狀態、腸運動及其它因素的影響。本發明的組合物可以包含在藥物制劑(比如片劑或膠囊)中。這樣的劑型可能需要包腸衣，如果生物利用度需要如此的話。可以使用已知的方法，比如制藥工業常規采用的那些(例如體內實驗、臨床試驗等)來確定藥物組合物的具體劑型和確切治療方案(比如日劑量和施用頻率)。應當理解，可以采用常規營養學方法制備包含所述組合物的液體飲料、粉末混合物和食品。日劑量可以作為單次施用(例如，口服攝入的每日片劑或作為單次液體飲料)給予。或者，可能需要在一天期間施用兩次或更多次。作為一個實例，可以在一整天期間以固定間隔使用包含0. l_20g噴霧干燥的植物提取物(優選0. 3-10g噴霧干燥的芝麻菜提取物，更優選0.5-3. Og)的IOOml橙飲料或葡萄飲料，從而遞送推薦劑量。應當理解，葡萄和芝麻菜提取物的組合將代表根據本發明第七個方面的最優選組合物。應當理解，補充有本發明ITC(和/或多酚)或植物提取物的營養品代表著給患有具有炎性成分之醫學病癥、或處于發生該醫學病癥之風險中的對象提供保護性或治療有效量的ITC的理想方式。因此，根據本發明的第八個方面，提供了一種用于預防或治療以具有炎性成分為特征的醫學病癥的營養品，其中所述營養品補充有ITC或其前體；或富含ITC或其前體的植物提取物。所述營養品可以包含(a)澄清、低粘度、水樣、穩定的、即用、瓶裝的碳酸飲料或非碳酸飲料；或用于重構的濃澄清液體，其包含根據本發明第四個方面的植物提取物；(b)用水或任何其它口服可攝取液體重構成可飲用液體的粉末/顆粒混合物，其包含根據本發明第四個方面的植物提取物；或(c)混合到食品中的粉末/顆粒混合物(例如巧克力塊、錠劑等)。所述營養品可以是如上所述的，可以包含或不包含水溶性維生素、其它礦物補充劑、營養化合物、抗氧劑或調味劑。優選的營養品可以包含本發明的第七個方面定義的活性成分。本發明將通過實施例并參照附圖進一步舉例說明，在附圖中

圖1為闡明4-甲基亞磺酰基丁基葡糖異硫氰酸酯和萊菔硫烷的代謝的示意圖。當進入腸細胞時，萊菔硫烷(SF)快速綴合谷胱甘肽，輸出進入體循環中，并通過硫醚氨酸途徑代謝。在血漿的低谷胱甘肽環境中，SF-谷胱甘肽綴合物可以裂解(可能由GSTMl介導)， 導致游離SF在血漿中循環。該游離SF可以修飾血漿蛋白，包括信號分子，比如TGFi3、EGF 和胰島素。圖2為顯示獨立前列腺微陣列數據集的線性判別分析(LDA)的曲線圖，使用實施例1所述的良性(B)和惡性(M)TURP前列腺組織作為訓練樣品以分類激光俘獲顯微切割 (LCD)上皮前列腺細胞樣品(GEO Accession ⑶S1439)，其由良性(Be)、原發癌(PCa)和轉移癌(MCa)樣品組成。在判別實施例1的方法部分中所述的良性和惡性TURP樣品的基因列表上進行LDA。在此，顯示第一個線性判別式(LDl)。圖3為代表飲食介入對基因轉錄的影響的圖，如在實施例1中所述。a，在來自良性(Ben)和惡性(MaI)前列腺的TURP組織中，以及來自介入前(Pre)、富含椰菜的飲食(Broc)6個月后和富含豌豆的飲食(Peas)6個月后的志愿者的TRUS導引的活檢組織中，在 GSTMl陽性和空白基因型之間不同(P彡0.005，Welch修正的兩樣品t檢驗)的探針的數目，b，在預介入TRUS導引的活檢樣品和富含椰菜的飲食6個月后(6B)、富含豌豆的飲食6 個月后(6P)、富含椰菜的飲食12個月后(12B)、富含豌豆的飲食12個月后(12P)之間不同 (P < 0.005，Welch修正的兩樣品配對t檢驗)的探針的數目。陰影表示如實施例1所述采用的不同倍數截斷值(cutoff)。圖4代表在與或不與人血漿中SF —起孵育下的胰島素的LC-MS譜圖，如實施例 1中所述。在(A)人血漿對照中未修飾的胰島素(20yg/ml)和(B)在37°C下與胰島素 (20 μ g/ml)和50 μ M SF 一起孵育4小時的人血漿的兩種情況下，胰島素-SF MH55+的提取離子LC-MS色譜(m/z 1183. 6-1184. 1)表明存在保留時間為6. 46和7. 08分鐘的兩種不同的胰島素-SF綴合物。這兩種胰島素-SF綴合物的增強產物離子(EPI)-MS光譜顯示在圖 5中。圖5代表實施例1中所述的兩種胰島素-SF綴合物的增強產物離子(EPI) -MS光譜。來自在37°C下與牛胰島素和50 μ M SF —起孵育4小時的人血漿的LC-MS分析的峰值保留時間為(Α)6. 46分鐘和(B) 7. 08分鐘的MS2產物離子光譜。在(A)和(B)中，m/z 1183.9 對應于胰島素-SF MH55+,在(A)中，m/z 235. 0對應于胰島素A鏈的N末端氨基酸Gly-SF， 在(B)中，m/z 325. 2對應于胰島素B鏈的N末端氨基酸Wie-SF。圖6圖解與或不與SF —起孵育的TGF β 1的LC-MS，如實施例1所述。前體物質的提取離子色譜(MS)代表TGF β 1的未修飾的N末端肽(m/z 768. 5)和經修飾的N末端肽 (m/z 877. 2)。A 來自 DMSO 處理的 TGF β 1 的 m/z768. 2-769. 2，B 來自 SF 處理的 TGF β 1 的 m/z 768. 2-769. 2，C 來自 DMSO 處理的 TGF β 1 的 m/z 876. 7-877. 7，和 D 來自 SF 處理的 TGF β 1 的 m/z876. 7-877. 7。圖7圖解SF對TGF β 1的N末端修飾。m/z 768. 7的MS/MS光譜代表保留時間為 23. 43分鐘的TGFi3 1的未修飾的N末端肽㈧，m/z 877. 2代表僅在SF處理的樣品中看到的保留時間為30. 85分鐘的TGFi3 1的經修飾形式(B)。注意y離子系列保持不變，而b離子系列遷移(Δ)，指示質量為217 士 0. SDa的N末端修飾。圖S2提供質量增加217而不是 177的說明。圖8圖解如實施例1所述的SF對TGFi3 1/Smad所介導轉錄的活化。用單獨的 TGF^ U TGF^ 1+lOmM DTT (其破壞活性 TGF β 1 二聚物)、或 TGF β 1+2 μ M SF 處理包含 CAGA12-luc質粒的ΝΙΗ3Τ3細胞。預孵育所有的樣品30分鐘，進一步透析4小時，使得SF 的最終濃度為:ΜηΜ。作為另外的陰性對照，細胞不接受處理或僅僅用34nM SF處理，這兩種情形都沒有誘導螢光素酶。將化學發光針對每種樣品的蛋白質濃度進行歸一化(詳述請參見方法部分)。這是所進行的總共四個類似實驗中的一個代表性實驗。顯示的數據為三次重復的平均值(s. e. m)。圖9代表在用如實施例2所述的與SF —起孵育0小時和21小時后的EGF在220nm 波長下的UV光譜(實驗1)。*由于柱平衡，與21小時的樣品(23. 822秒)相比，0小時樣品的未修飾EGF運行得更遲630秒)。圖10代表如實施例2所述的在0小時未修飾和經修飾EGF的提取離子質譜(實驗1)。*因為柱平衡，與21小時的樣品(圖11，上圖)相比，0小時樣品(圖10，上圖)的未修飾EGF運行得更遲。圖11代表如實施例2所述的21小時的未修飾和經修飾EGF的提取離子質譜(實驗1)。圖12代表如實施例2所述的未修飾EGF的質譜(實驗1)。顯示多個帶電的EGF 分子。圖13代表經修飾的EGF的質譜。顯示如實施例2討論的多個帶電的經修飾EGF 分子(實驗1)。圖14代表(a)凝膠的圖片；和(b)在條形圖中定量的數據，其對應于表6中的數據，如實施例2所述(實驗2)。該數據圖解ITC如何調節Smad活性。該實驗包括將TGF3 1 與和不與萊菔硫烷(SF) —起預孵育30分鐘，之后處理PC3細胞1小時，然后測量Smad2磷酸化(即TGFiil活性的函數)。圖15代表凝膠圖片；并對應于表7中所定量和給出的數據，如實施例2所述(實驗2)。該數據闡明ITC如何調節Smad活性。該實驗包括將TGF β 1與或不與芥酸精(ER) 一起預孵育30分鐘，之后處理PC3細胞1小時，然后測量Smad2磷酸化(即TGF β 1活性的函數)。圖16代表顯示磷酸化EGF受體(p_EGFR)在BPHl細胞(增生性前列腺細胞)中表達的條形圖，如實施例2所述(實驗3)。該實驗包括將BPH細胞與10 μ mol/L萊菔硫烷一起預孵育，在10分鐘的時間中導致10mg/L EGF可誘導的EGF受體磷酸化減少約三倍。圖17代表圖解將HUVEC細胞與高原花青素提取物和芥酸精一起孵育對IL_6表達之影響的條形圖，如實施例3所述。實施例1本發明基于本發明人進行的工作，其研究了攝入十字花科植物對前列腺癌發生和發展成侵襲性前列腺癌之風險的影響，特別是對導致這樣的癌癥的潛在作用機制的影響。 在本研究中，本發明人對在12個月富含椰菜的飲食之前、期間和之后的人前列腺中總體基因表達模式的變化進行了定量，并然后解釋了該變化。結果使本發明人意識到，植物中存在的ITC調節控制炎癥反應和調節前列腺癌發生的信號轉導機制。這一認識使得本發明人開發了本文所涉及的組合物和植物提取物以及其在治療具有炎性成分的病癥中的用途。給志愿者隨機地分配富含椰菜或富含豌豆的飲食。六個月后，對于富含豌豆的飲食而言，谷胱甘肽S-轉移酶μ I(GSTMl)陽性和空白(null)的個體之間的基因表達沒有差異；但是對于富含椰菜的飲食而言，GSTMl基因型之間存在顯著差異，這與轉化生長因子 β KTGFβ 1)和表皮生長因子(EGF)信號傳導途徑有關。介入前和介入后獲得的活組織檢查的比較表明，與富含豌豆的飲食的個體相比，在富含椰菜的飲食的個體中出現的基因表達的變化更多。雖然不管飲食如何雄激素信號傳導都存在變化，但花椰菜飲食的男性還具有除mRNA加工和TGFi3 1、EGF和胰島素信號傳導之外的其他變化。本發明人還確定了，萊菔硫烷(SF 來源于在花椰菜中累積的4-甲基亞磺酰基丁基葡糖異硫氰酸酯的異硫氰酸酯) 與TGFi3 UEGF和胰島素肽發生化學作用而形成硫脲，增強了 TGFi3 Ι/Smad介導的轉錄。前列腺癌是西方國家男性人群中最常診斷的非皮膚癌。流行病學研究提出，富含十字花科植物(比如花椰菜)的飲食除了可以減少其它部位的癌癥和心肌梗死的風險之外，還可以減少前列腺癌的風險。某些研究特別證實，每周攝入一份或多份的花椰菜可以降低前列腺癌的發病率，以及降低前列腺癌從局部形式發展為侵襲性形式。該風險的減少可被谷胱甘肽S-轉移酶yl(GSTMl)基因型調節，具有至少一個GSTMl等位基因的個體(即約50%的人群)獲得比具有GSTMl純合缺失的個體更多的益處。因此，本研究的一個目的是研究花椰菜的保護作用的機制基礎和與GSTMl基因型的相互作用。這些發現使本發明人認識到，攝入花椰菜與GSTMl基因型相互作用，引起與前列腺中炎癥和癌發生相關之信號途徑的復雜變化。本發明人認為這些變化可能是通過ITC與血漿中信號肽的化學相互作用而介導的。該研究首次提供了在人類中獲得的支持如下觀察研究的實驗證據富含十字花科植物的飲食可以減少發生具有炎性成分之病癥的風險和/ 或對其進行治療。而且，本發明人接著證實(參見隨后的實施例)包含ITC或包含富含ITC 之植物提取物的產品可用于治療這些病癥。1. 1 方法1.1.1對象和研究設計招募年齡為57-70歲(表1)、具有高級前列腺上皮內瘤形成(HGPIN，前列腺腺癌的侵入前原位階段)的前述診斷的二十二名男性進行飲食介入試驗，以研究富含花椰菜的飲食和富含豌豆的飲食對前列腺基因表達的影響。由對前列腺病理學具有特殊興趣的兩名會診組織病理學家進行組織學診斷。該試驗獲得倫理學批準，并且所有參與者都簽署了書面的知情同意書。如果志愿者正在進行化學預防性治療、接受睪酮替代藥物療法或5 α還原酶抑制劑、具有需要治療的活躍期感染、 體重指數(BMI) < 18. 5或>35或者患有糖尿病，則將其排除。將對象分配進入12個月的平行飲食介入試驗中，其由兩個飲食介入組組成除了其正常飲食之外，(i)每周攝入400g 花椰菜或(ii)每周攝入400g豌豆。該試驗從2005年4月至2007年4月進行。在本介入研究之前及6個月和12個月之后，在諾福和諾維奇大學(Norfolk and Norwich University) 醫院使用總PSA免疫測定來定量前列腺特異性抗原(PSA)的水平。在每次活組織檢查時間點之前48小時，志愿者避免已知含有葡糖異硫氰酸酯的食物，以避免急性效應。除了對在臨介入研究之前以及六個月和十二個月之后從志愿者獲得的前列腺經直腸超聲掃描(TRUQ導引的針刺活組織檢查之外，還從諾福和諾維奇大學醫院合作者癌癥研究人組織庫(Cancer Research Human Tissue Bank)獲得了 18個良性和14個惡性的經尿道前列腺切除(TURP)組織。1.1. 2飲食介入按月將蔬菜遞送給志愿者。向他們提供蒸籠，并且由食物研究所(the Institute of Food Research)的廚師給志愿者就如何烹煮所述蔬菜進行示范。蒸煮花椰菜部分 4-5分鐘，蒸煮豌豆部分2-3分鐘。冷凍的豌豆(Birds Eye Garden Peas，http://www. birdseye.co.uk/)購自本地零售渠道。為了保證提供給志愿者的冷凍的花椰菜中葡糖異硫氰酸酯含量的一致性，將本介入研究所需的椰菜按一批次種植在鄰近英國King' s Lynn ^Terrington 白勺 ADAS ^ !^ (http//www. adas. co. uk/) ±， ^ Christian Salvesen (Bourne, Lincolnshire, UK, http: //www. salvesen. co. uk/)力口工。將其在 90. 1°C 漂白74秒，在-30°C冷凍，并包裝成IOOg部分，然后在_18°C貯存，直到志愿者蒸煮。花椰菜是一種葡糖異硫氰酸酯含量高的品種。4-甲基亞磺酰基丁基葡糖異硫氰酸酯和3-甲基亞磺酰基丙基葡糖異硫氰酸酯(分別為SF和IB的前體)的水平平均值(SD)分別為10.6(0. 38)和3.6(0. 14)微摩爾每克干重，與之相比，購自本地零售渠道的花椰菜分別為 4.4(0. 12)和0. 6(0. 01)微摩爾每克干重。盡管葡糖異硫氰酸酯的水平高于標準花椰菜，但在冷凍之前的漂白使植物黑芥子酶變性，因此來源于高葡糖異硫氰酸酯含量花椰菜飲食的 SF和IB的水平類似于或低于從含有功能性黑芥子酶的鮮椰菜煮獲得的。在高葡糖異硫氰酸酯含量的花椰菜和標準花椰菜中，吲哚葡糖異硫氰酸酯的水平相似。1.1.3順應性監測和飲食評價在12個月介入期間，志愿者完成每周勾選表(tick sheet)，以確定何時食用蔬菜部分。每2周電話聯系志愿者并詢問飲食的堅持情況。在基線時和六個月后，由志愿者使用家用度量作為每份份量的指標來完成七天的評估食物攝取飲食日志。將來自該日志的食物攝取輸入至Ij Diet Cruncher vl. 6. 1 (www. waydownsouthsoftware. com/)中，并分析在基線時和介入后六個月兩個介入組之間營養組成的差異。1.1. 4基因分型使用具有RNase處理的Qiagen QIAamp DNA小型試劑盒，根據制造商的說明 (http://www. qiagen. co. uk/)，從全血或組織樣品提取基因組DNA。使用基于Covault及同事的實時PCR方法，使用基因特異性引物和探針測定了 GSTMl (NM_000561)基因型，并相對于兩拷貝基因對照(乳腺癌1的IVS10區域，早期發病(BRCA1，匪007四4)基因)進行定量(Covault ^A, (2003)Biotechniques 35 :594-596,598) 使用 Applied Biosystems Primer Express 來設計弓I物禾口探針(http://www. appliedbiosystems. com/),并賦予表 1 中的 PCR 條件。采用 Applied Biosystems Absolute Quantification 軟件分析數據。在表1中顯示了用于測定GSTMl基因缺失的正向(F)引物和反向(R)引物以及熒光探針(CP)的序列和濃度。探針用5'報告基因染料即FAM(6-羧基熒光素)和3'淬滅劑染料即TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)進行標記。在由Universal MasterMix、引物和探針以及50ng DNA組成的總體積25 μ L的孔中一式三份地進行反應。在95°C進行Amplitaq Gold活化10分鐘，然后進行95°C變性15秒并在60°C退火/延伸1分鐘的40個PCR循環。
權利要求
1.一種用于預防或治療以具有炎癥成分為特征的醫學病癥的組合物，其包含治療有效量的異硫氰酸酯(ITC)。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述ITC來源于蕓苔屬(Brassica)植物。
3.根據權利要求2的組合物，其中所述植物為芝麻菜物種。
4.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述ITC為萊菔硫烷(SF)、iberindB) 或芥酸精(ER，4-甲基硫丁基異硫氰酸酯)中的至少一種。
5.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述ITC在富集了ITC或ITC前體的植物提取物內。
6.根據權利要求5的組合物，其中所述植物提取物來源于蕓苔屬植物。
7.根據權利要求6的組合物，其中所述植物為芝麻菜物種。
8.根據前述權利要求中任一項的組合物，其與其它抗炎劑聯合使用。
9.根據權利要求7的組合物，其中所述抗炎劑為NSAID或皮質類固醇。
10.根據權利要求7的組合物，其中所述抗炎劑為多酚。
11.根據權利要求10的組合物，其中所述抗炎劑為富集了多酚的植物提取物。
12.根據權利要求10或11的組合物，其中所述多酚為原花青素。
13.根據權利要求10或11的組合物，其中所述多酚為黃酮類化合物。
14.根據權利要求13的組合物，其中所述黃酮類化合物為黃烷醇。
15.根據權利要求10-14中任一項的組合物，其中所述多酚來源于果皮或種子。
16.根據權利要求10-15中任一項的組合物，其中所述多酚來源于Vinusspp.。
17.根據前述權利要求中任一項的組合物，用于治療類風濕性關節炎。
18.根據權利要求1-16中任一項的組合物，用于治療炎性腸病。
19.飲料，其包含如權利要求1-18中任一項定義的組合物。
20.營養品，其包含如權利要求1-18中任一項定義的組合物。
21.藥品，其包含如權利要求1-18中任一項定義的組合物。
全文摘要
本發明涉及可用于預防或治療以具有炎性成分為特征的醫學病癥的組合物。所述組合物包含治療有效量的異硫氰酸酯(ITC)。所述組合物可以包含其它抗炎劑(例如源自植物的多酚)。
文檔編號A61P29/00GK102186472SQ200980134267
公開日2011年9月14日 申請日期2009年6月25日 優先權日2008年7月1日
發明者尼亞夫·奧肯尼迪, 理查德·米滕 申請人:普羅維斯天然產物有限公司, 植物生物科學有限公司