有效跳躍人杜興肌營養不良基因外顯子43、46、50-53中至少一個的方法和手段的制作方法

專利名稱：有效跳躍人杜興肌營養不良基因外顯子43、46、50-53中至少一個的方法和手段的制作方法
技術領域：
本發明涉及遺傳學領域，更具體而言涉及人類遺傳學領域。本發明尤其涉及人杜興肌營養不良前HiRNA剪接的調節。
背景技術：
肌病是導致肌肉功能性損傷的病癥。肌營養不良(MD)是指特征為骨骼肌的逐漸衰弱和退化的遺傳學疾病。杜興肌營養不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)和貝克肌營養不良(Becker muscular dystrophy,BMD)是最常見的兒童形式的肌營養不良。它們是隱性遺傳疾病，因為負責DMD和BMD的基因位于X染色體上，突變主要影響男性，發病率為每3500名男孩中約1例。DMD和BMD是由編碼抗肌萎縮蛋白的DMD基因的遺傳學缺陷導致，所述抗肌萎縮蛋白是細胞骨架和細胞外基質之間相互作用所必需的肌肉蛋白，用于在收縮期間維持肌纖維的穩定性。DMD是嚴重且致死的神經肌肉病癥，導致在12歲之前依靠輪椅維持，并且由于呼吸或心臟衰竭，DMD患者通常在30歲之前死去。相比之下，BMD患者通常直至晚年仍能走動，并具有近乎正常的預期壽命。DMD基因中的DMD突變特征為移碼插入或缺失或無義點突變，導致功能性抗肌萎縮蛋白的缺乏。通常，BMD突變保持閱讀框完整，允許合成具有部分功能性抗肌萎縮蛋白。最近十年，已經出現為了恢復抗肌萎縮蛋白轉錄本的破壞的閱讀框而進行的剪接的特定修飾，作為杜興肌營養不良(DMD)的有希望的療法(van Ommen, van Deutekom， Aartsma-Rus, Curr Opin Mol Ther. 2008 ；10(2) :140-9, Yokota, Duddy, Partidge, Acta Myol. 2007 ；26(3) 179-84，van Deutekom et al.，N Engl J Med. 2007 ；357(26) 2677-86)。使用干擾剪接信號的反義寡核苷酸(AON)，可以在DMD前mRNA中誘導特定的外顯子跳躍，從而恢復開放閱讀框并將嚴重的DMD轉變成較輕微的BMD表型(van Deutekom et al. Hum Mol Genet. 2001；10 :1547-54 ；Aartsma-Rus et al.，Hum Mol Genet 2003 ；12(8) 907-14.)。在由于外顯子23中無義突變導致抗肌萎縮蛋白缺乏的mdx小鼠模型中首次獲得體內概念驗證(proof-of-conc印t)。肌內注射和靜脈內注射靶向突變的外顯子23的 AON恢復抗肌萎縮蛋白的表達持續至少三個月(Lu et al. Nat Med. 2003 ；8 =1009-14 ；Lu et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 ； 102(1) :198-203)。這是通過纖維膜處抗肌萎縮蛋白關聯蛋白的恢復以及處理的肌肉的功能性改善來實現的。還在hDMD小鼠模型中實現人外顯子的體內跳躍，所述hDMD小鼠模型包含整合在小鼠染色體5中的人DMD基因的完整拷貝(Bremmer-Bout et al. Molecular Therapy. 2004 ；10 :232-40 ； ‘ t Hoen et al. J Biol Chem. 2008 ；283 :5899-907)。最近，成功完成了首次用于人體的研究，其中將誘導外顯子51跳躍的AON注入 4名DMD患者脛骨前肌的小區域內。在治療的所有四名患者的大多數肌纖維中觀察到新抗肌萎縮蛋白表達，并且該AON是安全且耐受良好的(van Deutekom et al. N Engl JMed. 2007；357 :2677-86)。發明的詳細描述^^第一方面，本發明提供了誘導和/或促進患者中，優選在患者分離的細胞中，DMD 前mRNA的外顯子43、46、50-53中至少一個的跳躍的方法，所述方法包括向所述細胞和/或所述患者提供與所述外顯子中的至少8個核苷酸的連續區段結合的分子。應當理解，所述方法包括體外、體內或離體方法。因此，提供了誘導和/或促進患者中，優選在所述患者分離的細胞中，DMD前mRNA 的外顯子43、46、50-53中至少一個的跳躍的方法，所述方法包括向所述細胞和/或所述患者提供與所述外顯子中的至少8個核苷酸的連續區段結合的分子。如本文所定義，DMD前mRNA優選表示DMD或BMD患者DMD基因的前mRNA。優選地，患者意圖表示患有本文隨后所定義的具有DMD或BMD的患者，或由于他或她的遺傳學背景而易于發展為DMD或BMD的患者。就DMD患者而言，所用的寡核苷酸優選糾正所述患者DMD基因所呈現的一個突變，并且因此優選會產生看起來與BMD蛋白類似的 DMD蛋白所述蛋白優選是如本文隨后所定義的功能性抗肌萎縮蛋白。就BMD患者而言，所用的寡核苷酸優選糾正所述患者BMD基因所呈現的一個突變，并且因此優選會產生抗肌萎縮蛋白，其比原來存在于所述BMD患者中的抗肌萎縮蛋白功能性更強。外顯子跳躍是指誘導細胞中的成熟mRNA不包含正常存在其中的特定外顯子。通過向表達所述mRNA的前mRNA的細胞提供能干擾關鍵序列的分子能干擾外顯子包含信號的分子來進行外顯子跳躍，所述關鍵序列例如所述外顯子剪接所必需的剪接受體序列的剪接供體，所述外顯子包含信號是識別一段核苷酸作為待包括在mRNA中的外顯子所必需的。術語前mRNA是指通過轉錄從細胞核中的DNA模板合成的未加工的或部分加工的前體mRNA。在本發明的語境中，本文所指的誘導和/或促進外顯子跳躍表示治療的患者的一個或多個(肌肉)細胞中至少 1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的DMD mRNA不包含所述外顯子。如實施例中所述，這優選通過PCR來評價。優選地，本發明方法通過誘導和/或促進患者的一個或多個(肌肉)細胞中的DMD 前mRNA的外顯子43、46、50-53中至少一個的跳躍，向所述患者提供功能性抗肌萎縮蛋白和 /或減少所述患者中異常抗肌萎縮蛋白的產生和/或增加所述患者中功能性抗肌萎縮蛋白的產生。向患者提供功能性抗肌萎縮蛋白和/或減少所述患者中異常抗肌萎縮蛋白的產生通常應用于DMD患者中。增加所述患者中功能性抗肌萎縮蛋白的產生通常應用于BMD患者。因此，優選的方法是這樣的方法其中向患者或所述患者的一個或多個細胞提供功能性抗肌萎縮蛋白和/或其中減少所述患者中異常抗肌萎縮蛋白的產生和/或其中增加所述患者中功能性抗肌萎縮蛋白的產生，其中所述異常或功能性抗肌萎縮蛋白的水平是通過與開始方法時所述患者中的所述抗肌萎縮蛋白的水平比較來評價。減少異常抗肌萎縮蛋白的產生可以在mRNA水平上評價，并且優選表示通過RT PCR仍然可檢測到異常抗肌萎縮蛋白mRNA最初數量的99 %、90 %、80 %、70 %、60 %、50 %、 40%,30%,20%,10%,5%或更少。異常抗肌萎縮蛋白mRNA或蛋白在本文也被稱為非功能性抗肌萎縮蛋白mRNA或蛋白。非功能性抗肌萎縮蛋白優選的是不能與肌動蛋白和/或DGC 蛋白復合物成員結合的抗肌萎縮蛋白。非功能性抗肌萎縮蛋白或抗肌萎縮蛋白mRNA通常沒有或不編碼具有蛋白的完整C-末端的抗肌萎縮蛋白。增加所述患者或所述患者細胞中功能性抗肌萎縮蛋白的產生可以在mRNA水平上評價(通過RT-PCR分析)，并且優選表示通過RT PCR可以檢測到可檢測數量的功能性抗肌萎縮蛋白mRNA。在另一個實施方案中，可檢測到的抗肌萎縮蛋白mRNA的1 %、5%、10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多是功能性抗肌萎縮蛋白mRNA。增加所述患者或所述患者細胞中功能性抗肌萎縮蛋白的產生可以在蛋白水平上評價(通過免疫熒光和western印跡分析)，并且優選表示通過免疫熒光或western印跡分析可以檢測到可檢測數量的功能性抗肌萎縮蛋白。在另一個實施方案中，可檢測到的抗肌萎縮蛋白的1%、 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多是功能性抗肌萎縮蛋白。如本文所定義，功能性抗肌萎縮蛋白優選是與具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的蛋白相應的野生型抗肌萎縮蛋白。功能性抗肌萎縮蛋白優選是這樣的抗肌萎縮蛋白， 其具有在它的N末端部分中的肌動蛋白結合結構域(N末端的前240個氨基酸)、半胱氨酸富集結構域(氨基酸3361至3685)和C末端結構域(C末端的最后325個氨基酸)，如本領域技術人員所已知的，這些結構域的每一個都存在于野生型抗肌萎縮蛋白中。本文所指的氨基酸與SEQ ID NO :1表示的野生型抗肌萎縮蛋白的氨基酸相符合。換而言之，功能性抗肌萎縮蛋白是至少在一定程度上表現出野生型抗肌萎縮蛋白活性的抗肌萎縮蛋白。“至少在一定程度上”優選表示野生型功能性抗肌萎縮蛋白的相應活性的至少10<%、20%、30%、 40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^ 100%。在本文中，功能性抗肌萎縮蛋白的活性是優選與肌動蛋白和與抗肌萎縮蛋白關聯的糖蛋白復合物(DGC)結合(Aartsma-Rus A et al, (2006)，萊頓杜興肌營養不良突變數據庫條目確定閱讀框規則的突變類型反常情況的綜述，Muscle Nerve, 34 :135-144).通過使用總蛋白提取物的免疫共沉淀或來自肌肉活檢的橫斷面的免疫熒光分析可以顯現抗肌萎縮蛋白與肌動蛋白和與DGC復合物的結合，這對本領技術人員是已知的。患杜興肌營養不良的個體或患者通常在編碼抗肌萎縮蛋白的基因中具有突變，其阻止完整蛋白的合成，即提前的終止阻止C-末端的合成。在貝克肌營養不良中，DMD基因與野生型基因比較也包含突變，但是所述突變通常不會誘導提前的終止且通常合成C-末端。因此合成的功能性抗肌萎縮蛋白具有至少與野生型蛋白一樣的活性，盡管沒有必要是相同的活性量。BMD個體的基因組通常編碼這樣的抗肌萎縮蛋白，其包含N末端部分(N末端的前240個氨基酸)、半胱氨酸富集結構域(氨基酸3361至3685)和C末端結構域(C 末端的最后325個氨基酸)，但是它的中央桿狀結構域可以短于野生型抗肌萎縮蛋白之一 (Aartsma-Rus A et al, (2006)，萊頓杜興肌營養不良突變數據庫條目確定閱讀框規則的突變類型和反常情況的綜述，Muscle Nerve, 34 :135-144)。用于DMD治療的外顯子跳躍通常通過跳躍桿狀結構域中的外顯子以糾正閱讀框和允許包含C-末端的抗肌萎縮蛋白的殘余部分的合成，克服前mRNA中的提前終止，盡管由于較小的桿狀結構域，所述蛋白略小。在優選的實施方案中，患有DMD并通過本文所定義的方法治療的個體會提供至少在一定程度上表現出野生型抗肌萎縮蛋白活性的抗肌萎縮蛋白。更優選地，如果所述個體是杜興患者或疑似杜興患者，功能性抗肌萎縮蛋白是患有BMD個體的抗肌萎縮蛋白通常所述抗肌萎縮蛋白能與肌動蛋白和DGC兩者相互作用，但是它的中央桿狀結構域可以短于野生型抗肌萎縮蛋白的中央桿狀結構域(Aartsma-Rus A et al, (2006)，萊頓杜興肌營養不良突變數據庫條目確定閱讀框規則的突變類型和反常情況的綜述，Muscle Nerve, 34 :135-144)。野生型抗肌萎縮蛋白的中央桿狀結構域包含M個血影蛋白樣重復(Aartsma-Rus A et al, (2006)，萊頓杜興肌營養不良突變數據庫條目確定閱讀框規則的突變類型和反常情況的綜述，Muscle Nerve, 34 :135-144)。例如，本文所提供的抗肌萎縮蛋白的中央桿狀結構域可以包含5-23個、10-22個或12-18個血影蛋白樣重復，只要它能與肌動蛋白和與DGC結合。本發明方法可以緩解患者生肌細胞或肌細胞的一個或多個特征或緩解具有下述缺失的DMD患者的一種或多種癥狀所述缺失包括但不限于DMD基因中的外顯子44、 44-46、44-47、44-48、44-49、44-51、44-53(可通過外顯子 43 跳躍糾正)、19-45、21-45、 43-45、45、47-54、47-56 (可通過外顯子 46 跳躍糾正)、51、51-53、51_55、51_57 (可通過外顯子50跳躍糾正)、13-50、19-50、29-50、43-50、45-50、47-50、48-50、49-50、50、52(可通過外顯子51跳躍糾正)、外顯子8-51、51、53、53-55、53-57、53-59、53-60(可通過外顯子52 跳躍糾正)和外顯子 10-52、42-52、43-52、45-52、47-52、48-52、49-52、50-52、52(可通過外顯子53跳躍糾正)，這共占所有具有缺失的DMD患者的68% (Aartsma-Rus et al.，Hum. Mut. 2009)。可選擇地，本發明方法可以改善患者肌細胞的一個或多個特征或緩解DMD患者的一種或多種癥狀，所述DMD患者在DMD基因中具有小突變或具有外顯子43、46、50-53 的單一外顯子重復，這共占所有具有缺失的DMD患者的36% (Aartsma-Rus et al, Hum. Mut.2009)。此外，對于一些患者，除外顯子43、外顯子46和/或外顯子50_53之外還需要一個其他外顯子的同時跳躍以恢復開放閱讀框，包括具有特定缺失、小(點)突變或雙重或多重外顯子重復的患者，例如(但不限于)外顯子44-50的缺失需要外顯子43和51的共跳躍、 外顯子46-50的缺失需要外顯子45和51的共跳躍、外顯子44-52缺失需要外顯子43和53 的共跳躍、外顯子46-52的缺失需要外顯子45和53的共跳躍、外顯子51巧4的缺失需要外顯子50和55的共跳躍、外顯子53-54的缺失需要外顯子52和55的共跳躍、外顯子53-56 的缺失需要外顯子52和57的共跳躍、外顯子43或外顯子44中的無義突變需要外顯子43 和44的共跳躍、外顯子45或外顯子46中的無義突變需要外顯子45和46的共跳躍、外顯子50或外顯子51中的無義突變需要外顯子50和51的共跳躍、外顯子51或外顯子52中的無義突變需要外顯子51和52的共跳躍、外顯子52或外顯子53中的無義突變需要外顯子52和53的共跳躍、或雙重或多重外顯子重復涉及外顯子43、46、50、51、52和/或53。在優選的方法中，誘導外顯子43的跳躍、或誘導外顯子46的跳躍、或誘導外顯子 50的跳躍、或誘導外顯子51的跳躍、或誘導外顯子52的跳躍、或誘導外顯子53的跳躍。本發明方法還包括誘導這些外顯子中的兩個的跳躍。例如，優選外顯子50和51、或52和53、 或43與51、或43和53、或51和52的跳躍。根據患者中識別的突變的類型和身份(涉及的特定外顯子)，本領域技術人員應當知道需要在所述患者中跳躍哪種外顯子組合。在優選的方法中，緩解DMD或BMD患者的一種或多種癥狀和/或改善來自DMD或 BMD患者的一個或多個肌細胞的一個或多個特征。可以在細胞、組織水平或患者自身評價這類癥狀或特征。可以通過對來自患者的生肌細胞或肌細胞進行下述任何測定來評價一個或多個特征緩解減少的肌細胞鈣攝取、減少的膠原蛋白合成、改變的形態學、改變的脂質合成、減少的氧化脅迫和/或改善的肌纖維功能、完整性和/或存活。通常使用肌肉活檢的橫斷面的免疫熒光和/或組織化學分析來評價這些參數。可以使用下述測定中的至少一個來評價肌纖維功能、完整性和/或存活的改善 血液中肌酸激酶可檢測地減少、疑似營養不良的肌肉的活檢橫斷面中肌纖維壞死可檢測地減少和/或疑似營養不良的肌肉的活檢橫斷面中肌纖維直徑的同質性可檢測地增加。這些測定中的每一種都是本領域技術人員已知的。可以如Hodgetts et al (Hodgetts S. ,et al, (2006) ,Neuromuscular Disorders, 16 :591-602. 2006)所述檢測血液中的肌酸激酶。肌酸激酶可檢測地減少可以表示與治療前的同一 DMD或BMD患者中的肌酸激酶濃度相比減少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、 60%、70%、80%、90% 或更多。肌纖維壞死可檢測地減少優選在肌肉活檢中評價，更優選如Hodgetts et al (Hodgetts S.，et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16 :591-602. 2006)所述使用活檢橫斷面來評價。壞死可檢測地減少可以是其中使用活檢的橫斷面鑒定為壞死區域減少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。通過與治療前的同一 DMD 或BMD患者中評價的壞死比較來測量所述減少。肌纖維直徑的同質性可檢測地增加優選在肌肉活檢橫斷面中評價，更優選如 在 Hodgetts et al (Hodgetts S.，et al，(2006)，Neuromuscular Disorders，16 591-602. 2006)中所述評價。通過與治療前的同一 DMD或BMD患者中肌纖維直徑的同質性比較測量所述增加。可以通過對患者自身進行任何下述測定來評價一種或多種癥狀的緩解將喪失行走的時間延長、肌力的改善、舉重物能力的改善、從地上站起來所需時間的改善、9米行走時間改善、攀爬四層樓梯所需時間的改善、腿功能等級的改善、肺功能的改善、心臟功能的改善、生活質量改善。這些測定中的每一種都是本領域技術人員已知的。舉例而言，Manzur at al(Manzur AY et al, (2008),Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy (杜興肌營養不良的糖皮質激素皮質留類)(綜述)，Wiley publishers, The Cochrane collaboration.)的公開對這些測定中的每一種都給出大量的說明。對于這些測定中的每一種，一旦發現測定中測量的參數可檢測地改善或延長，則將優選表示使用本發明方法已經緩解了個體的杜興肌營養不良或貝克肌營養不良的一種或多種癥狀。可檢測地改善或延長優選統計學上顯著的改善或延長，如Hodgetts et al (Hodgetts S. , et al, (2006), Neuromuscular Disorders, 16 :591-602. 2006)所述。可選擇地，可以通過測量如本文后所定義的肌纖維功能、完整性和/或存活的改善來評價杜興肌營養不良或貝克肌營養不良一種或多種癥狀的緩解。本發明方法的治療可以持續至少一周、至少一個月、至少七個月、至少一年、至少 2、3、4、5、6年或更長。如本文所定義的用于本發明的每個分子或寡核苷酸或其等同物都可以適用于向受DMD或BMD影響的或有風險發展成DMD或BMD的個體體內的細胞、組織和/或器官直接給藥，并且都可以體內、離體或體外直接給藥。本發明分子或寡核苷酸或組合物的給藥頻率可以依賴于數個參數，例如患者年齡、患者突變、分子數(劑量)、所述分子的劑型。所述頻率可以在兩周至少一次、或三周至少一次或四周至少一次或五周至少一次或更長的時間周期之間改變。可以將分子或寡核苷酸或其等同物遞送至細胞。當將所述分子、寡核苷酸或其等同物給藥至個體時，優選將它溶解在與遞送方法相容的溶液中。對于靜脈內給藥、皮下給藥、肌內給藥、膜內給藥和/或心室內給藥，所述溶液優選是生理鹽水。特別優選的本發明方法是使用賦形劑，所述賦形劑將進一步增強本文所定義的所述分子、寡核苷酸或其功能等同物遞送至細胞或細胞中，優選肌細胞。優選的賦形劑在題目為“藥物組合物”的部分中界定。在本發明優選的方法中，使用能誘導和/或促進患者DMD前mRNA的另一個外顯子跳躍的其他分子。優選地，第二外顯子選自患者DMD前mRNA的外顯子6、7、11、17、19、 21、43、44、45、50、51、52、53、55、57、59、62、63、65、66、69 或 75。可以使用的分子在表 1-7 中的任何一個中有描述。這樣，阻止了從該前mRNA產生包含DMD前mRNA兩個或多個外顯子的mRNA。該實施方案也被稱為雙重或多重外顯子跳躍(Aartsma-Rus A，Janson AA, Kaman WE, et al. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense (杜興肌營養不良的反義誘導的多重外顯子跳躍更有意義).Am J Hum Genet 2004 ；74 (1) :83-92, Aartsma-Rus A, Kaman WE, Weij R, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons(通過雙重靶向一個或多個外顯子來開發對杜興肌營養不良治療的外顯子跳躍的前沿).Mol Ther 2006 ； 14 (3) :401-7)。在大多數情況下，雙重外顯子跳躍導致DMD前mRNA僅排除兩個靶向外顯子。然而，在其他情況下，發現所述前mRNA中的靶向外顯子和所述外顯子之間的全部區域在產生的mRNA中都不存在了，即使這些區域中存在其他外顯子(其間的外顯子)。 該多重跳躍顯然是來自DMD基因的寡核苷酸組合的結果，其中將外顯子45的一個寡核苷酸和外顯子51的一個寡核苷酸添加到轉錄DMD基因的細胞中。這種安排導致產生的mRNA不包含外顯子45-51。顯然地，在所提及寡核苷酸存在的情況下，前mRNA的結構是這樣的刺激剪接體系使外顯子44和52彼此連接。通過在兩條互補的寡核苷酸之間提供連接，也有可能特定地促進其間的外顯子跳躍。因此，在一個實施方案中，通過連接部分使與至少兩個抗肌萎縮蛋白外顯子互補的核苷酸區段分離。因此在該實施方案中，所述至少兩段核苷酸連接形成單個分子。如果多于一個化合物或分子用在本發明方法中，則可以以任何順序將所述化合物給予個體。在一個實施方案中，所述化合物可以被同時給藥(意思是在10小時之內，優選在1小時之內給予所述化合物)。盡管如此，這是沒有必要的。在另一個實施方案中，相繼給予所述化合物。分子第二方面，提供了如前部分題目為“方法”所述的方法中使用的分子。如本文所定義的分子優選寡核苷酸或反義寡核苷酸(AON)。本發明人發現，使用優選與外顯子43、46、50_53中任何一個的至少8個核苷酸的連續區段結合的分子，所述外顯子被高頻率地特異跳躍。盡管該效應與所述分子相對于結合少于8個核苷酸的連續區段的分子的較高結合親和力有關，但是可能有其他細胞內參數參與促成雜交雙鏈的熱動力、動力或結構特征。在優選的實施方案中，使用與所述外顯子中的至少 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 個核苷酸的連續區段結
合的分子在優選的實施方案中，包含與DMD前mRNA的外顯子43、46、50-53中的任何一個的一部分互補的序列的本發明分子或寡核苷酸是這樣的所述互補部分至少是本發明寡核苷酸長度的50 %，更優選至少是60 %，更優選至少是70 %，更優選至少是80 %，更優選至少是 90%或更優選至少是95%甚至更優選至少是98%和最優選高達100%。“所述外顯子的一部分”優選表示至少8個核苷酸的區段。在最優選的實施方案中，本發明的寡核苷酸由與本文所定義的所述外顯子DMD前mRNA的一部分互補的序列組成。例如，寡核苷酸可以包含與本文所定義的所述外顯子DMD前mRNA的一部分互補的序列和其他側翼序列。在更優選的實施方案中，所述寡核苷酸的互補部分的長度至少為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50個核苷酸。優選地，其他側翼序列用來修飾蛋白與所述分子或寡核苷酸的結合，或用來修飾寡核苷酸的熱動力特征、更優選地用來修飾靶RNA結合親和力。用于本發明方法中的優選分子與選自下述核苷酸序列之一的至少8個核苷酸的連續區段結合或互補5 ’ -AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAG⑶CGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCA AAGUGCAACGCCUGUGG-3，(SEQ ID NO 2)用于外顯子 43 的跳躍；5 ‘ -UUAUG⑶UGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUG AACCUGGAAAAGAGCAGCAAC UAAAAGAAAAGC-3，(SEQ ID NO 3)用于外顯子 46 的跳躍；5' -GGCGGTAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUG ACCUAGC UCCUGGACUGACCACUAUUGG-3，(SEQ ID NO 4)用于外顯子 50 的跳躍；5 ‘ -CUCCUACUCAGACU⑶UACUCUG⑶GACACAACCUGUG⑶UACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAA CUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUG UUGGAGGUAC-3，(SEQ ID NO 5)用于外顯子 51 的跳躍；5’ -AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCA⑶UGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAA AACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3，(SEQ ID NO 6)用于外顯子 52 的跳躍；以及5’ -AAAU⑶UAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAA GCUGAGCAG⑶CUUAGGACAG GCCAGAG-3’ (SEQ ID NO 7)用于外顯子53的跳躍.在理論上可以制備的與所述外顯子之一中通過SEQ ID NO 2_7所定義的連續核苷酸區段結合的多種分子之中，本發明提供了可以在本方法中使用的用于有效跳躍外顯子 43、外顯子46和/或外顯子50-53中至少一個的不同的分子。盡管跳躍效應可以針對所述區段中相對高密度的推定的SR蛋白結合位點，但是可能有其他參數參與促成所述分子或其他分子的攝取，細胞內參數例如雜交雙鏈的熱動力、動力或結構特征。發現與包括在SEQ ID NO 2_7中任一個的連續區段或組成SEQ ID NO 2_7中任一個的連續區段結合的分子分別導致被提供該分子的細胞和/或患者中外顯子43、外顯子46 和/或外顯子50-53的高效跳躍。因此，在優選的實施方案中，提供了這樣的方法其中分子與 SEQ ID NO 2-7 中至少 8、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50 個核苷酸的連續區段
社a
？口口。在用于誘導和/或促進跳躍外顯子43、外顯子46和/或外顯子50_53中任一個的優選實施方案中，本發明提供的分子包含反義核苷酸序列或由其組成，所述反義核苷酸序列選自表1-6中任一個所述的反義核苷酸序列。本發明分子優選包含SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 127、 SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 246、SEQ ID NO 299、SEQ ID NO 357 的反義核苷酸序列或由 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 246, SEQ ID NO 299, SEQ ID NO :357 的反義核苷酸序列組成。本發明的優選分子包含8-50個核苷酸或堿基的核苷酸類或核苷酸或反義寡核苷酸序列，更優選10-50個核苷酸，更優選20-40個核苷酸，更優選20-30個核苷酸，例如20 個核苷酸、21個核苷酸、22個核苷酸、個核苷酸、M個核苷酸、％個核苷酸、26個核苷酸、 27個核苷酸、28個核苷酸、四個核苷酸、30個核苷酸、31個核苷酸、32個核苷酸、33個核苷酸、34個核苷酸、35個核苷酸、36個核苷酸、37個核苷酸、38個核苷酸、39個核苷酸、40個核苷酸、41個核苷酸、42個核苷酸、43個核苷酸、44個核苷酸、45個核苷酸、46個核苷酸、47 個核苷酸、48個核苷酸、49個核苷酸或50個核苷酸。本發明的最優選分子包含25個核苷酸的核苷酸類序列。此外，所示的序列沒有一個源自剪接點的保守部分。因此，所述分子不可能介導來自DMD前mRNA的其他外顯子或來自其他基因的外顯子的差異剪接。在一個實施方案中，本發明的分子是與確定序列結合的化合物分子，或者是已經被修飾得能與DMD前RNA分子上的對應核苷酸序列結合的諸如RNA結合蛋白或非天然的鋅指蛋白的蛋白。用于篩查與特定核苷酸序列結合的化合物分子的方法例如在PCT/ NL01/00697和美國專利第6，875，736號中公開，通過引用將二者并入本文。用于設計與特定核苷酸序列結合的RNA結合鋅指蛋白的方法在Friesen and Darby, Nature Structural Biology 5 :543-546(1998)中公開，通過引用將其并入本文。本發明的優選分子與SEQ ID NO 2 5，-AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAG⑶CGGAUUGACAU UAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCU⑶GG-3，序列的至少一部分結合，所述序列存在于DMD基因的外顯子43中。更優選地，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 8-SEQ ID NO 69的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 8-SEQ ID NO 69的反義核苷酸序列組成。在更優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 16和/或SEQ ID NO 65的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 16和/或SEQ ID NO 65的反義核苷酸序列組成。在最優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 65的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 65的反義核苷酸序列組成。發現該分子在調節肌細胞和/或患者的DMD 前mRNA外顯子43的剪接中是非常有效的。本發明的另一個優選分子與SEQ ID NO 3:5' -UUAUG⑶UGGAGGAAGCAGAUAACAUUG CUAGUAUCCCACUUG AACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC-3，序列的至少一部分結合，所述序列存在于DMD基因的外顯子46中。更優選地，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 70-SEQ ID NO 122的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 70-SEQ ID NO 122的反義核苷酸序列組成。 在更優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 110 和 / 或 SEO ID N0117 的反義核苷酸序列或由 SEQ ID NO 70,SEQ ID NO 9USEQ ID NO 110和/或SEQ ID NOl 17的反義核苷酸序列組成。
在最優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 117的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 117的反義核苷酸序列組成。發現該分子在調節肌細胞和/或患者的 DMD前mRNA外顯子46的剪接中是非常有效的。本發明的另一個優選分子與SEQID NO 4 5，-GGCGGTAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAG GGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG-3，序列的至少一部分結合，所述序列存在于DMD基因的外顯子50中。更優選地，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 123-SEQ ID NO 167 和 / 或 SEQ ID NO 529-SEQ ID NO 5；35 的反義核苷酸序列或由 SEQ ID NO 123-SEQ ID NO 167和/或SEQ ID NO 529-SEQ ID NO 535的反義核苷酸序列組成在更優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 127、或SEQ ID NO 165、或SEQ ID NO 166和/或SEQ ID NO 167的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 127、或 SEQ ID NO 165、或SEQ ID NO 166和/或SEQ ID NO 167的反義核苷酸序列組成。在最優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 127的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 127的反義核苷酸序列組成。發現該分子在調節肌細胞和/或患者的 DMD前mRNA外顯子50的剪接中是非常有效的。本發明的另一個優選分子與SEQ ID NO 5:5' -CUCCUACUCAGACU⑶UACUCUG⑶GAC ACAACCUGUG⑶UACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUG UUGGAGGUAC-3 ’ 序列的至少一部分結合，所述序列存在于DMD基因的外顯子51中。更優選地，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 168-SEQ ID NO 241的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 168-SEQ ID NO 241的反義核苷酸序列組成。本發明的另一個優選分子與SEQID NO 6 5，-AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAG UUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCU-3，序列的至少一部分結合，所述序列存在于DMD基因的外顯子52中。更優選地，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 242-SEQ ID NO 310的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 242-SEQ ID NO 310的反義核苷酸序列組成。在更優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 246和/或 SEQ ID NO 299的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 246和/或SEQ ID NO 299的反義核苷酸序列組成。在最優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 299的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 299的反義核苷酸序列組成。發現該分子在調節肌細胞和/或患者的DMD前mRNA外顯子52的剪接中是非常有效的。本發明的另一個優選分子與SEQID NO 7 5，-AAAU⑶UAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGG AAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAG-3，序列的至少一部分結合，所述序列存在于DMD基因的外顯子53中。更優選地，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 311-SEQ ID NO 358的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 311-SEQ ID NO 358的反義核苷酸序列組成。在最優選的實施方案中，本發明提供的分子包含SEQ ID NO 357的反義核苷酸序列或由SEQ ID NO 357的反義核苷酸序列組成。發現該分子在調節肌細胞和/或患者的 DMD前mRNA外顯子53的剪接中是非常有效的。本發明分子的核苷酸序列可以包含RNA殘基、一個或多個DNA殘基和/或一個或多個核苷酸類似物或等同物，這將在下文進一步詳述。優選地，本發明分子包含一個或多個被修飾的殘基，以增加核酸酶抗性和/或增加反義核苷酸與靶序列的親和力。因此，在優選的實施方案中，所述反義核苷酸序列包含至少一個核苷酸類似物或等同物，其中將核苷酸類似物或等同物定義為具有修飾堿基和/或具有修飾主鏈和/或具有非天然核苷間連接或這些修飾的組合的殘基。在優選的實施方案中，所述核苷酸類似物或等同物包含修飾的主鏈。這類主鏈的實例通過下述修飾提供嗎啉代主鏈、氨基甲酸酯主鏈、硅氧烷主鏈、硫化、亞砜和砜主鏈、甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基主鏈、亞甲基甲酰乙酰基 (methyleneformacetyl)主鏈、乙酰核糖主鏈、含有烯烴的主鏈、氨基磺酸、磺酸和磺胺主鏈、亞甲基亞胺和亞甲基胼主鏈，以及氨基主鏈。磷酰二胺嗎啉代寡聚物是之前已被證實為反義試劑的修飾的主鏈寡核苷酸。嗎啉代寡核苷酸具有不帶電的主鏈，其中DNA的脫氧核糖由六元環取代，且磷酸二酯連接由磷酰二胺連接取代。嗎啉代寡核苷酸對酶降解是抗性的，并且似乎是通過阻止翻譯或干擾前mRNA剪接而非通過激活RNase H而發揮反義試劑的功能。通過物理破壞細胞膜的方法已成功地將嗎啉代寡核苷酸遞送至組織培養細胞中，并且一項比較數種這些方法的研究發現劃痕標記是最有效的遞送方法；然而，由于嗎啉代主鏈不帶電，陽離子脂質不是嗎啉代寡核苷酸攝入細胞中的有效介導物。一項最近的報道表明嗎啉代寡核苷酸形成三螺旋，并且由于非離子型主鏈，這些研究表明在不存在鎂的條件下，嗎啉代寡核苷酸能形成三螺旋。優選地，主鏈殘基之間的連接不包含磷原子，例如通過短鏈烷基或環烷基核苷間連接形成的連接、混合的雜原子和烷基或環烷基的核苷間連接或一個或多個短鏈雜原子或雜環的核苷間連接。優選的核苷酸類似物或等同物包括具有修飾的聚酰胺主鏈的肽核酸(PNA) (Nielsen, et al. (1991) Science 254，1497-1500)。基于 PNA 的分子就堿基對識別而言是真正的DNA分子模擬物。PNA的主鏈由通過肽鍵連接的N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元組成，其中核苷堿基通過亞甲羰鍵與主鏈連接。可選的主鏈包含一碳延伸的吡咯烷PNA單體 (Govindaraju and KumaH2005) Chem. Commun，495-497)。由于 PNA 分子的主鏈包含不帶電的磷酸基，因此PNA-RNA雜合體通常分別比RNA-RNA或RNA-DNA雜合體更穩定(Egholm et al (1993)Nature 365,566-568)。更優選的主鏈包括嗎啉代核苷酸類似物或等同物，其中核糖或脫氧核糖由六元嗎啉環取代。最優選的核苷酸類似物或等同物包括磷酸二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)，其中核糖或脫氧核糖由六元嗎啉環取代，并且鄰近的嗎啉環之間的陰離子磷酸二酯連接由非離子的磷二酰胺連接取代。在另一個實施方案中，本發明的核苷酸類似物或等同物包含磷酸二酯連接的一個非橋氧的取代。該修飾輕微地使堿基對不穩定，但是顯著增加了對核酸酶降解的抗性。 優選的核苷酸類似物或等同物包含硫代磷酸，手性硫代磷酸，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨烷基磷酸三酯，H-磷酸酯，包括3'-烴基亞磷酸酯、5'-烴基亞磷酸酯和手性磷酸酯的甲基和其他烷基磷酸酯，亞膦酸酯，包括3 ‘-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯，硫羰氨基磷酸酯，硫羰烷基磷酸酯，硫羰烷基磷酸三酯，硒磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate)0本發明的另一個優選的核苷酸類似物或等同物包含一個或多個糖部分，其在2'、 3'和/或5'位置處單取代或雙取代，例如-OH ;-F;取代的或非取代的、線性的或分支的低級(Cl-ClO)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基、芳基或芳烷基，以上基團可以由一個或多個雜原子打斷；0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；0-、S-或N-烯丙基；0-烷基-0-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；-氨基氧；甲乙氧基；-二甲氨基乙氧基；以及-二甲氨基乙烯乙氧基。所述糖部分可以是吡喃糖或吡喃糖衍生物、或脫氧吡喃糖或脫氧吡喃糖衍生物、優選是核糖或核糖衍生物、或脫氧核糖或脫氧核糖衍生物。這類優選的衍生化的糖部分包括鎖核酸(LNA)，其中2'-碳原子與糖環的3'或4'碳原子連接，因而形成雙環糖部分。優選的LNA包括2' -0,4' -C-乙烯-橋核酸(Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1 :241-242)。這些取代使得核苷酸類似物或等同物耐受RNase H和核酸酶，并增加了對靶RNA的親和力。本領域技術人員應當理解，沒有必要均勻地修飾反義寡核苷酸中的所有位置。此外，可以將多于一個前述類似物或等同物并入單反義寡核苷酸中，或甚至并入反義寡核苷酸的單一位置中。在某些實施方案中，本發明的反義寡核苷酸具有至少兩種不同類型的類似物或等同物。本發明優選的反義寡核苷酸包含2’_0烷基磷硫酰反義寡核苷酸，例如2' -0-甲基修飾的核糖(RNA)、2' -0-乙基修飾的核糖、2' -0-丙基修飾的核糖和/或這些修飾的取代衍生物，例如鹵代衍生物。本發明最優選的反義寡核苷酸包含2’-0_甲基磷硫酰核糖。可將本發明分子的功能性等同物定義為本文所定義的寡核苷酸，其中至少在一定程度上保留了所述功能性等同物的活性。優選地，所述功能性等同物的活性是誘導外顯子 43、46、50、51、52或53跳躍，并提供功能性抗肌萎縮蛋白。因此優選地，通過檢測外顯子43、 46、50、51、52或53跳躍并通過確定功能性抗肌萎縮蛋白的數量來評價所述功能性等同物的所述活性。本文優選將功能性抗肌萎縮蛋白定義為能與肌動蛋白和DGC蛋白復合物成員結合的抗肌萎縮蛋白。對寡核苷酸所述活性的評價優選通過RT-PCR或免疫熒光或Western 印跡分析來進行。優選至少在一定程度上保留所述活性，此時，它表現出功能性等同物來源的所述寡核苷酸相應活性的至少50 %、或至少60 %、或至少70 %或至少80 %或至少90 %或至少95%或更高。遍及在本申請，當使用詞語寡核苷酸時，它可以由本文所定義的其功能性等同物代替。本領域技術人員應當理解，可以將不同的反義寡核苷酸組合，用于有效地跳躍人 DMD前mRNA的外顯子43、外顯子46、外顯子50、外顯子51、外顯子52和/或外顯子53中任何一個。本發明包括使用一個、兩個、三個、四個、五個或更多個寡核苷酸用于跳躍所述外顯子之一(即外顯子43、46、50、51、52或53)。還包括使用至少兩個寡核苷酸用于跳躍至少兩個所述外顯子。優選跳躍兩個所述外顯子。更優選地，這兩個外顯子是-43 和 51，或-43 和 53，或-50 和 51，或-51 和 52，或-52 和 53。本領域技術人員會知道，根據DMD或BMD患者中存在突變的類型、數量和位置，跳躍外顯子的哪種組合是優選的。可以將反義寡核苷酸與增強所述反義寡核苷酸攝入細胞中，優選肌細胞中的部分連接。這些部分的實例是膽固醇、碳水化合物、維生素、生物素、脂質、磷脂、細胞穿透肽(包括但不限于觸角足突變蛋白(antermapedia)、TAT、transporter!以及諸如寡精氨酸、聚精氨酸、寡賴氨酸或聚賴氨酸的帶正電荷氨基酸)、諸如由抗體提供的抗原結合結構域、抗體的Fab片段、或諸如駱駝狀單結構域抗原結合結構域的單鏈抗原結合結構域。優選的反義寡核苷酸包含肽連接的ΡΜ0。當系統性遞送時，包含本發明一個或多個核苷酸類似物或等同物的優選反義寡核苷酸調節一個或多個包括心肌細胞在內的肌細胞中的剪接。在本方面中，包含特定核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸的系統性遞送可能導致靶向肌細胞的子集，而包含不同核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸可能導致靶向肌細胞的不同子集。因此，在一個實施方案中，優選使用包含不同核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸組合來誘導人DMD前 mRNA的外顯子43、46、50、51、52或53跳躍。通過基于腺病毒或腺相關病毒的載體所提供的質粒來源的反義寡核苷酸表達或病毒表達可以將能干擾必需序列的分子提供給細胞，這導致高效跳躍人DMD前mRNA的外顯子43、外顯子46、外顯子50、外顯子51、外顯子52或外顯子53。在優選的實施方案中， 提供了基于病毒的表達載體，其包含驅動本文所示分子表達的表達盒。表達優選由諸如 UUU6或U7RNA啟動子的聚合酶III啟動子驅動。通過提供水性溶液中的質粒可以將所述質粒提供給肌細胞或生肌細胞，用于反義寡核苷酸表達。可選擇地，可以通過使用已知轉染藥劑的轉染來提供質粒，例如LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)或聚乙烯亞胺(PEI ； ExGen500 (MBI Fermentas))或它們的衍生物。一個優選的反義寡核苷酸表達系統是基于腺病毒相聯病毒(AAV)的載體。已經開發出可以用于小反義核苷酸序列高效表達的基于單鏈和雙鏈AAV的載體，用于高效跳躍 DMD 前 mRNA 的外顯子 43、46、50、51、52 或 53。優選的基于AAV的載體包含由聚合酶III-啟動子(Pol III)驅動的表達盒。優選的Pol III啟動子例如是U1、TO或U7RNA啟動子。因此，本發明還提供了基于病毒的載體，其包含用于表達本發明的一個或多個反義序列的Po 1 III-啟動子驅動的表達盒，用于誘導人DMD前mRNA的外顯子43、外顯子46、 外顯子50、外顯子51、外顯子52或外顯子53跳躍。藥物組合物如果需要，通過添加藥物可接受的載體可以將本發明的分子或表達反義寡核苷酸的載體并入藥學上有活性的混合物或組合物中。因此，另一方面，本發明提供了組合物，優選藥物組合物，所述藥物組合物包含含有本發明的反義寡核苷酸的分子和/或表達本發明反義序列的基于病毒的載體分子和藥物可接受的載體。優選的藥物組合物包含本文所定義的分子和/或本文所定義的載體，以及藥物可接受的載體或賦形劑，所述藥物可接受的載體或賦形劑與能誘導DMD前mRNA的外顯子6、7、 11、17、19、21、43、44、45、50、51、52、53、55、57、59、62、63、65、66、69 或 75 跳躍的本文所定義的分子和/或載體任意組合。能誘導任何這些外顯子跳躍的優選分子顯示在表1-7的任一個中。優選的賦形劑包括能形成遞送本文所定義的這類分子的復合物、介質和/或脂質體的賦形劑，優選將寡核苷酸復合在或捕獲在囊泡或脂質體中通過細胞膜。這些賦形劑中許多是本領域內已知的。合適的賦形劑包括聚乙醇胺和衍生物、或包括聚丙烯亞胺或聚乙醇胺共聚物(PEC)和衍生物在內的相似的陽離子聚合物、ExGen 500、合成的兩性物 (SAINT-18)、lipofectinTM, DOTAP和/或能自我組裝成顆粒的病毒衣殼蛋白，所述顆粒可以將這類分子，優選本文所定義的寡核苷酸遞送至細胞，優選肌細胞。這種賦形劑已經表現出有效地將(寡核苷酸，例如反義)核酸遞送至包括肌細胞在內的大量培養細胞中。它們的高轉染潛能與對總細胞存活的去除的低至中度的毒性結合。可以利用結構修飾的便利來對它們其他的(體內)核酸轉移特征或毒性進行進一步的修飾和分析。Lipofectin代表脂質體轉染試劑的實例。它由兩種脂質組分組成，陽離子脂質 N-[1-(2，3 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨基氯化物(DOTMA)(化學純(cp.)，DOTAP， 其是甲基硫酸鹽)和中性脂質二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性組分介導細胞內釋放。另一組遞送系統是聚合納米顆粒。聚陽離子，例如公知的作為DNA轉染試劑的二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖，可以與氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)結合，以配制成能將本文所定義的分子或化合物，優選寡核苷酸穿過細胞膜遞送入細胞中的陽離子納米顆粒。除了這些常用的納米顆粒材料之外，陽離子肽魚精蛋白為將本文所定義化合物， 優選的寡核苷酸配制成膠體提供了可選的方式。該膠狀納米顆粒系統可通過簡單的自我組裝過程形成所謂的微粒(proticles)，以包裝和介導本文所定義的化合物，優選寡核苷酸的細胞內釋放。本領域技術人員可選擇和修改任何上述的或其他可商購的可選擇的賦形劑和遞送系統，來包裝和遞送本文所定義的化合物，優選寡核苷酸，用于在本發明中遞送治療人杜興肌營養不良或貝克肌營養不良的所述化合物。此外，可以將本文所定義的化合物，優選寡核苷酸與特別設計的促進攝入細胞、細胞質和/或它的核的靶向配基共價或非共價連接。這類配基可以包括(i)識別細胞、組織或器官特異性元件促進細胞攝取的化合物(包括但不限于肽(-樣)結構)和/或(ii)能促進本文所定義的化合物的細胞攝取和/或細胞內釋放的化合物，優選從諸如內涵體或溶酶體的囊泡釋放寡核苷酸。因此，在優選的實施方案中，將本文所定義的化合物，優選寡核苷酸配制在藥物中，所述藥物提供有至少一種用于遞送的賦形劑和/或靶向配基和/或將所述化合物遞送至細胞和/或增強它的細胞內遞送的遞送裝置。因此，本發明還包括藥學上可接受的組合物，其包含本文所定義的化合物，優選寡核苷酸且還包含至少一種用于遞送的賦形劑和/ 或靶向配基和/或將所述化合物遞送至細胞和/或增強它的細胞內遞送的遞送裝置。應當理解，不可以將分子或化合物或寡核苷酸配制在一種單一的組合物或制劑中。根據它們的特性，本領域技術人員會了解對于每種化合物哪種類型的劑型是最合適的。在優選的實施方案中，使用的本文所定義的分子或寡核苷酸的濃度范圍為 0. InM-I □ M0更優選地，所用的濃度范圍為0. 3-400ΠΜ，更優選1-200ΠΜ。可以以范圍為 0. l-20mg/kg的劑量使用本文所定義的分子或寡核苷酸，優選0. 5-10mg/kg。如果使用數種分子或寡核苷酸，這些濃度可以指寡核苷酸的總濃度或每種寡核苷酸的濃度。如上文給出的寡核苷酸濃度的范圍是體外或離體使用的優選濃度。本領域技術人員應當理解，根據所用的寡核苷酸、待處理的靶細胞、基因靶標和它的表達水平、所用的培養基以及轉染與孵育條件、所用的寡核苷酸濃度可以進一步改變，并且需要進一步的優化。
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更優選地，用于在發明中預防、治療DMD或BMD的化合物，優選寡核苷酸是通過合成產生的，并且以配制在藥學可接受的組合物或制劑中的形式直接給予細胞、組織、器官和 /或患者。藥物組合物至個體的遞送優選通過一種或多種腸胃外注射實施，例如靜脈內給藥和/或皮下給藥和/或肌內給藥和/或膜內給藥和/或心室內給藥，優選在人體的一個或多個位點注射。當系統性遞送時，任選地包含本發明的一種或多種核苷酸類似物或等同物的本文所定義的優選寡核苷酸調節一個或多個包括心肌細胞在內的肌細胞中的剪接。本方面中， 包含特定核苷酸類似物或等同物的寡核苷酸的系統性遞送可能導致靶向肌細胞的子集，在本方面中，包含特定核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸的系統性遞送可能導致靶向肌細胞的子集，而包含不同核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸可能導致靶向肌細胞的不同子集。在本方面中，包含特定核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸的系統性遞送可能導致靶向肌細胞的子集，而包含不同核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸可能導致靶向肌細胞的不同子集。因此，在本實施方案中，優選使用包含不同核苷酸類似物或等同物的寡核苷酸組合來調節至少一類肌細胞中的DMD mRNA的剪接。在優選的實施方案中，提供了用作藥物的分子或基于病毒的載體，優選用于調節 DMD前mRNA的剪接，更優選用于促進或誘導本文所示的外顯子43、46、50_53中任一個的跳躍。MM另一方面，本發明提供了本發明的反義寡核苷酸或分子和/或表達本發明一段或多段反義序列的基于病毒的載體和/或藥物組合物在調節DMD前mRNA剪接中的用途。優選在體外人生肌細胞或肌細胞中調節所述剪接。更優選的是在體內人肌細胞中調節剪接。 因此，本發明還涉及本文所定義的分子和/或本文所定義的載體和/或本文所定義的藥物組合物在調節DMD前mRNA剪接中的作用或在制備用于治療DMD或BMD患者的藥物中的用途。在本文及其權利要求書中，動詞“包含”與它的同源詞用的是它的非限制性意義， 表示包括緊接著該詞的項目但并不排除未具體提到的項目。此外，動詞“由…組成”可以用 “基本上由…組成”取代，表示本文所定義的分子或基于病毒的載體或組合物可以包括具體指出的組分之外的其他組分，所述其他組分不會改變本發明的特有特征。此外，由不定冠詞 “一個(a)”或“一個(an)”提及的元件不排除存在多于一個所述元件的可能性，除非文中明確指出有且只有一個所述元件。因此，不定冠詞“一個(a)”或“一個(an)”通常表示“至少一個，，。可以將本文所示的每個實施方案組合起來，除非另有所指。通過引用將本說明書所引用的所有專利和參考文獻整體并入本文。下面提供的實施例僅為說明性目的，并非意圖以任何方式限制本發明的范圍。 實施例實施例1-4材料和方法
(部分地)基于通過m-fold程序所預測的靶外顯子RNA的重疊開放的二級結構， (部分地)基于通過ESE-finder軟件所預測的重疊潛在的SR-蛋白結合位點來設計Α0Ν。 AON 由 Prosensa Therapeutics B. V. (Leiden,Netherlands)^ 2’ _0_ ^ RNA 和全長磷硫酰(PQ主鏈。組織培養、轉染和RT-PCR分析如前述處理來自健康個體(“人對照”)(實施例1、3和4 ；外顯子43、50、52跳躍)或攜帶外顯子45缺失的DMD患者(實施例2 ；外顯子46跳躍)的肌管培養物(Aartsma-Rus et al. ,Neuromuscul. Disord. 2002 ；12 :S71_77 以及Hum Mol Genet 2003 ；12 (8) :907-14)。為了篩查Α0Ν，用50nM和150nM(實施例2)、200nM和500nM(實施例4)或只有500nM(實施例 1和3)的每種AON轉染肌管培養物。使用轉染試劑UNIi^ectylin (Prosensa Therapeutics BV, Netherlands)，每口 g AON 加 2 □ 1 UNIFectylin0 通過用靶向外顯子(43、46、50、 51、52或5 側翼外顯子中引物的巢式RT-PCR分析來確定外顯子跳躍效率。從瓊脂糖凝膠分離PCR片段用于序列確認。為了定量，使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies, USA)上的 DNA IOOOLabChips Kit 分析 PCR 產物。結果DMD外顯子43跳躍。設計靶向外顯子43序列的一系列Α0Ν，并轉染進健康的對照肌管培養物中。隨后對分離的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定義為SEQ ID NO 2的外顯子43中連續核苷酸區段的幾乎所有的AON都確實能誘導外顯子43跳躍。如

圖1所示，PS237(SEQ ID NO 65)在500nM時可重復地誘導外顯子43跳躍的最高水平(高達66%)。為了比較，還顯示了 PS238和PSM0，誘導外顯子43跳躍的水平分別高達13%和36% (圖1)。通過對新的更小的轉錄本片段的序列分析來確認外顯子43的精確跳躍。在未處理的細胞(NT)中沒有觀察到外顯子43跳躍。DMD外顯子46跳躍。設計靶向外顯子46序列的一系列Α0Ν，并轉染進來自DMD基因中攜帶外顯子45缺失的DMD患者的肌管培養物中。對于攜帶這類突變的患者，反義誘導的外顯子46跳躍將誘導確實可以緩解所述疾病的一種或多種癥狀的新的BMD-樣抗肌萎縮蛋白的合成。隨后對分離的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定義為SEQ ID NO 3的外顯子46中連續核苷酸區段的幾乎所有的AON都確實能誘導外顯子46跳躍，甚至在50nM的相對低的AON濃度時。如圖2所示，PS182(SEQ ID NO :117)可重復地誘導外顯子46跳躍的最高水平(在 50nM時高達50%且在150nM時高達74% )。為了比較，還顯示了 PS177、PS179和PS181， 在150nM時誘導外顯子46跳躍的水平分別高達55%、58%和42% (圖2)。通過對新的更小的轉錄本片段的序列分析來確認外顯子46的精確跳躍。在未處理的細胞(NT)中沒有觀察到外顯子46跳躍。DMD外顯子50跳躍。設計靶向外顯子50序列的一系列Α0Ν，并轉染進健康的對照肌管培養物中。隨后對分離的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定義為SEQ ID NO 4的外顯子50中連續核苷酸區段的幾乎所有的AON都確實能誘導外顯子50跳躍。如圖3所示，PS248(SEQ ID NO 127)可重復地誘導外顯子50跳躍的最高水平(在500nM時高達35% )。為了比較，還顯示了 PS245、PS246和PS247，在500nM時誘導外顯子50跳躍水平高達14-16% (圖3)。通過對新的更小的轉錄本片段的序列分析來確認外顯子50的精確跳躍。在未處理的細胞 (NT)中沒有觀察到外顯子50跳躍。DMD外顯子51跳躍。設計靶向外顯子51序列的一系列Α0Ν，并轉染進健康的對照肌管培養物中。隨后對分離的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定義為SEQ ID NO 5的外顯子51中連續核苷酸區段的幾乎所有的AON都確實能誘導外顯子51跳躍。SEQ ID NO 180的AON可重復地誘導外顯子51跳躍的最高水平(未示出)。DMD外顯子52跳躍。設計靶向外顯子52序列的一系列Α0Ν，并轉染進健康的對照肌管培養物中。隨后對分離的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定義為SEQ ID NO 6的外顯子52中連續核苷酸區段的幾乎所有的AON都確實能誘導外顯子52跳躍。如圖4所示，PS236(SEQ ID NO 299)可重復地誘導外顯子52跳躍的最高水平(在200nM時高達88%且在500nM時高達 91%)。為了比較，還顯示了 PS232和A0N52-1(之前由Aartsma-Rus et al.公開，寡核苷酸2005)，當以500nM施用時，誘導外顯子52跳躍水平分別高達59%和10% (圖4)。通過對新的更小的轉錄本片段的序列分析來確認外顯子52的精確跳躍。在未處理的細胞(NT) 中沒有觀察到外顯子52跳躍。DMD外顯子53跳躍。設計靶向外顯子53序列的一系列Α0Ν，并轉染進健康的對照肌管培養物中。隨后對分離的RNA的RT-PCR和序列分析表明靶向本文定義為SEQ ID NO 7的外顯子53中連續核苷酸區段的幾乎所有的AON都確實能誘導外顯子53跳躍。SEQ ID NO 3 的AON可重復地誘導外顯子53跳躍的最高水平(未示出)。序列表DMD基因氨基酸序列SEQ ID NO 1 MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGST RVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQ STRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYP DKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTS SPKPRFKSYA YTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKD QFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQN QKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESS⑶HATAALEE QLKVL⑶RWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKA DLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQAVTTTQPSLTQTTVMETV TTVTTREQILVKHAQEELPPPPPQKKRQITVDSEIRKRLDVDITELHSffITRSEAVLQSPEFAIFRKEGNFSDLKEK VNAIEREKAEKFRKLQDASRSAQALVEQMVNEGVNADSIKQASEQLNSRWIEFCQLLSERLNWLEYQNNIIAFYNQL QQLEQMTTTAENWLKIQPTTPSEPTAIKSQLKICKDEVNRLSGLQPQIERLKIQSIALKEKGQGPMFLDADFVAFTN HFKQVFSDVQAREKELQTIFDTLPPMRYQETMSAIRTWVQQSETKLSIPQLSVTDYEIMEQRLGELQALQSSLQEQQ SGLYYLSTTVKEMSKKAPSEISRKYQSEFEEIEGRWKKLSSQLVEHCQKLEEQMNKLRKIQNHIQTLKKWMAEVDVF LKEEWPAL⑶SEILKKQLKQCRLLVSDIQTIQPSLNSVNEGGQKIKNEAEPEFASRLETELKELNTQffDHMCQQVYA RKEALKGGLEKTVSLQKDLSEMHEWMTQAEEEYLERDFEYKTPDELQKAVEEMKRAKEEAQQKEAKVKLLTESVNSVIAQAPPVAQEALKKELETLTTNYQWLCTRLNGKCKTLEEVWACWHELLSYLEKANKffLNEVEFKLKTTENIPGGAEE ISEVLDSLENLMRHSEDNPNQIRILAQTLTDGGVMDELINEELETFNSRWRELHEEAVRRQKLLEQSIQSAQETEKS LHLIQESLTFIDKQLAAYIADKVDAAQMPQEAQKIQSDLTSHEISLEEMKKHNQGKEAAQRVLSQIDVAQKKLQDVS MKFRLFQKPANFEQRLQESKMILDEVKMHLPALETKSVEQEVVQSQLNHCVNLYKSLSEVKSEVEMVIKTGRQIVQK KQTENPKELDERVTALKLHYNELGAKVTERKQQLEKCLKLSRKMRKEMNVLTEWLAATDMELTKRSAVEGMP SNLD SEVAWGKATQKEIEKQKVHLKSITEVGEALKTVLGKKETLVEDKLSLLNSNWIAVTSRAEEWLNLLLEYQKHMETFD QNVDHITKffIIQADTLLDESEKKKPQQKEDVLKRLKAELNDIRPKVDSTRDQAANLMANRGDHCRKLVEPQISELNH RFAAISHRIKTGKASIPLKELEQFNSDIQKLLEPLEAEIQQGVNLKEEDFNKDMNEDNEGTVKELLQRGDNLQQRIT DERKREEIKIKQQLLQTKHNALKDLRSQRRKKALEISHQWYQYKRQADDLLKCLDDIEKKLASLPEPRDERKIKEID RELQKKKEELNAVRRQAEGLSEDGAAMAVEPTQIQLSKRffREIESKFAQFRRLNFAQIHTVREETMMVMTEDMPLEI SYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVE RVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQffLTEAEQFLRKTQIPENffEHAKYKffYLKE LQDGIGQRQTWRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQKNILSEFQRDLNEFV LWLEEADNIASIPLEPGKEQQLKEKLEQVKLLVEELPLRQGILKQLNETGGPVLVSAPISPEEQDKLENKLKQTNLQ WIKVSRALPEKQGEIEAQIKDLGQLEKKLEDLEEQLNHLLLWLSPIRNQLEIYNQPNQEGPFDVQETEIAVQAKQPD VEEILSKGQHLYKEKPATQPVKRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETA ISKLEMPSSLMLEVPALADFNRAWTELTDWLSLLDQVIKSQRVMV⑶LEDINEMIIKQKATMQDLEQRRPQLEELIT AAQNLKNKTSNQEARTIITDRIERIQNQWDEVQEHLQNRRQQLNEMLKDSTQWLEAKEEAEQVLGQARAKLESWKEG PYTVDAIQKKITETKQLAKDLRQWQTNVDVANDLALKLLRDYSADDTRKVHMITENINASWRSIHKRVSEREAALEE THRLLQQFPLDLEKFLAWLTEAETTANVLQDATRKERLLEDSKGVKELMKQWQDLQGEIEAHTDVYHNLDENSQKIL RSLEGSDDAVLLQRRLDNMNFKWSELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPA VQKQNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEK LNLHSADWQRKIDETLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSH VNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVP YYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDIL QIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVAS STGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRV AAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKN KFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLE⑶NMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYL NDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHE HKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPRDAELIAEAKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGT TVSSPSTSLQRSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRGRNTPGKPMREDTMSEQ ID NO 2(外顯子 43)AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAG⑶CGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAG UGCAACGCCUGUGGSEQ ID NO 3(外顯子 46)UUAUG⑶UGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUA⑶AUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAA GAAAAGCSEQ ID NO 4(外顯子 50)
20
，GGCGGTAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUA UUGGSEQ ID NO 5(外顯子 51)CUCCUACUCAGACU⑶UACUCUG⑶GACACAACCUGUG⑶UACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAG AAAUGCCAUCUUCCUUGAU⑶UGGAGGUACSEQ ID NO 6(外顯子 52)AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCA⑶UGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAAC AAGACCAGCAAUCAAGAGGCUSEQ ID NO 7(外顯子 53)AAAU⑶UAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAG⑶CUUAGGACAGGCCA GAG表1 用干跳躍DMD某因外H子43的寡核苷酸
2權利要求
1.分子，所述分子與選自以下核苷酸序列之一中的至少8個核苷酸的連續區段結合用于外顯子50的跳躍的5’ -GGCGGTAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUU GG-3，(SEQ ID NO 4)；用于外顯子43的跳躍的5’ AGAUAGUCUACAACAAAGCUCAG⑶CGGAUUGACAUUAUUCAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUG CAACGCCUGUGG-3，(SEQ ID NO 2)；用于外顯子46的跳躍的5' UUAUG⑶UGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAG AAAAGC-3，(SEQ ID NO 3)；用于外顯子51的跳躍的5' CUCCUACUCAGACU⑶UACUCUG⑶GACACAACCUGUG⑶UACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGA AAUGCCAUCUUCCUUGAUG UUGGAGGUAC-3，(SEQ ID NO 5)；用于外顯子52的跳躍的5’ AUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCA⑶UGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAA GACCAGCAAUCAAGAGGCU-3，(SEQ ID NO 6)；以及用于外顯子53的跳躍的5’ AAAU⑶UAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAAA GCUGAGCAG⑶CUUAGGACAGGCCAGA G-3，(SEQ ID NO :7)。
2.如權利要求1所述的分子，其中所述分子包含選自表1-6中所示的SEQID NO :8-358 和/或SEQ ID NO 5四-535的反義核苷酸序列或由選自表1-6中所示的SEQ ID NO :8-358 和/或SEQ ID NO 5四-535的反義核苷酸序列組成。
3.如權利要求2所述的分子，其中所述分子包含選自SEQID NO 16, SEQ ID NO :65、 SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :91、SEQ ID NO :110、SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :127、SEQ ID NO :165, SEQ ID NO :166、SEQ ID NO :167、SEQ ID NO :246、SEQ ID NO :299 和 SEQ ID NO 357 的反義核苷酸序列或由選自 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO 110,SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 165,SEQ ID NO :166、SEQ ID NO :167, SEQ ID NO :246、SEQ ID NO :299 和 SEQ ID NO :357 的反義核苷酸序列組成。
4.如權利要求1-2任一項所述的分子，其包含2’-0-烷基磷硫酰反義寡核苷酸。
5.如權利要求4所述的分子，其包含2’-0甲基磷硫酰核糖。
6.基于病毒的載體，其包含驅動權利要求1-5中任一項所定義的分子表達的表達盒。
7.用作藥物的權利要求1-5中的任一項所述的分子或權利要求6所述的基于病毒的載體，其優選用于調節DMD或BMD患者的DMD前mRNA的剪接或用于治療DMD或BMD患者。
8.藥物組合物，包含權利要求1-5中任一項所定義的分子和/或權利要求6所述的載體，藥物可接受的載體，并且任選地與能誘導或促進患者DMD前mRNA的外顯子6、7、11、17、 19、21、43、44、45、50-53、55、57、59、62、63、65、66、69 或 75 中至少一個的跳躍的分子組合。
9.用于誘導和/或促進患者中，優選患者分離的細胞中DMD前mRNA的外顯子43、外顯子46、外顯子50-53中至少一個的跳躍的方法，所述方法包括向所述細胞和/或所述患者提供權利要求1-5中任一項所述的分子或權利要求6所述的載體。
10.如權利要求9所述的方法，其中使用能誘導或促進患者DMD前mRNA的外顯子6、7、 11、17、19、21、43、44、45、50-53、55、57、59、62、63、65、66、69 或 75 中至少一個的跳躍的其他分子。
11.權利要求1-5中任一項所述的分子、權利要求6所述的載體或權利要求8所述的藥物組合物在調節DMD前mRNA的剪接中的用途或制備用于治療DMD或BMD患者的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及方法，其中使用分子誘導和/或促進患者中，優選患者分離的細胞中DMD前mRNA的外顯子43、外顯子46、外顯子50-53中至少一個的跳躍，所述方法包括向所述細胞和/或所述患者提供分子。本發明還涉及所述分子本身。
文檔編號A61P21/00GK102256606SQ200980151919
公開日2011年11月23日 申請日期2009年3月11日 優先權日2007年10月26日
發明者勒德烏斯·約翰尼斯·普拉滕伯格, 安妮姆耶克·阿斯馬-魯斯, 朱迪思·克里斯蒂娜·塞奧多拉·萬多伊特科姆, 蓋瑞特-揚·保德維金·萬歐門, 約瑟夫斯·約翰尼斯·德吉姆彼 申請人:普繞申薩公司, 普羅森那技術公司, 普羅森那控股公司, 萊頓教學醫院