專利名稱：：杜興肌營養不良中有效的外顯子(44)跳躍方法及相關手段的制作方法
技術領域：
：本發明涉及遺傳學領域，更具體而言，涉及人類遺傳學。本發明特別涉及人類杜興肌營養不良基因剪接的調節。
背景技術：
：肌病是導致肌肉功能障礙的病癥。肌營養不良是指以骨骼肌逐漸衰弱和退化為特征的遺傳疾病。杜興肌營養不良(Duchennemusculardystrophy,DMD)和貝克肌營養不良(Beckermusculardystrophy,BMD)是最常見的童年形式的肌營養不良。它們為隱性遺傳疾病，因為負責DMD和BMD的基因位于X染色體上，突變主要影響男性，并且發病率為每3500個男孩中約一例。DMD和BMD是由編碼肌養蛋白的DMD基因中的基因缺陷引起的，肌養蛋白是細胞主鏈與細胞外基質之間相互作用必需的肌肉蛋白質，從而在收縮期間維持肌纖維的穩定性。DMD是一種嚴重的、致死的神經肌肉病癥，其導致12歲以前依賴輪椅支持，并且DMD患者常常在30歲以前死于呼吸或心力衰竭。相比之下，BMD患者通常保持能行走，直至生命晚期，并且具有幾乎正常的預期壽命。肌養蛋白基因DMD突變的特征為移碼插入、缺失或無義點突變，這導致功能性肌養蛋白的缺乏。BMD突變通常保持可讀框完整，從而允許合成具有部分功能性肌養蛋白。在過去20年中已經研究了一些可能的療法，包括成肌細胞移植、DNA靶向的基因療法和反義介導的外顯子跳躍(vanDeutekomandvanOmmen,(2003),Nat.Rev.Genet.,4(10):774-83)。反義介導的外顯子跳躍目旨在將存在于DMD患者中的框外(out-of-frame)突變轉變成合成至少部分功能性肌養蛋白的框內(in-frame)BMD樣突變，從而延長肌肉的活力(Aartsma-RusandvanOmmen,(2007),RNA,13(10):1609-24)。外顯子跳躍能夠被反義寡核苷酸(AON)誘導，該反義寡核苷酸針對涉及外顯子連接酶促過程的剪接點的剪接供體或剪接受體位點，或針對外顯子內部序列。通常，剪接供體和剪接受體位點包含保守序列，靶向這些序列有不可避免的風險，即會同時靶向來自DMD或其他基因轉錄本的另外的外顯子的剪接位點。DMD基因的外顯子44由148個堿基對組成。外顯子44的治療性跳躍會恢復DMD患者的正確可讀框，所述DMD患者具有缺失或者具有外顯子44的重復，所述缺失包括但不限于外顯子03-43、05-43、06-43、10-43、13-43、14-43、17-43、19-43、28-43、30-43、31_43、33-43、34-43、35-43、36-43、37-43、38-43、40-43、41-43、42-43、43、45、45-54和45-68。此外，對于某些DMD患者而言，突變是這樣的，從而除了外顯子44跳躍以外，一個或多個外顯子的同時跳躍是恢復可讀框必需的。這種突變的非限制性實例為側翼外顯子43或45中的無義點突變，分別要求外顯子43+44跳躍或外顯子44+45跳躍。上述突變總共發生于約6-8%的全部DMD患者中。大部分所得的肌養蛋白在該蛋白中心桿結構域被截短，這使得重要的N-末端肌動蛋白結合結構域、與小肌養蛋白(dystrobrevin)和肌養蛋白結合蛋白(syntrophin)結合的C-末端結構域以及β-營養不良聚糖結合C-末端富含半胱氨酸的結構域完整。發明描述本發明鑒定了外顯子44中四個不同區域，其特別適合誘導外顯子44的跳躍。因此，本發明提供了調節細胞中DMD基因的外顯子44剪接的方法，該方法包括為所述細胞提供與包含以下序列的核苷酸序列結合的分子SEQIDNO.1:5’-GUGGCUAACAGAAGCU、SEQIDNO.2:5’-GGGAACAUGCUAAAUAC、SEQIDNO.3:5’-AGACACAAAUUCCUGAGA或SEQIDNO.45，-CUGUUGAGAAA。當DMD前mRNA(pre-mRNA)的外顯子44中存在SEQIDNO:1、2、3或4時，該分子優選地與SEQIDN0:l、2、3或4的任意一個結合或互補。在本申請書中，短語“誘導跳躍”與“調節剪接”是同義的。據發現，與包含SEQIDNO.1:5，-GUGGCUAACAGAAGCU、SEQIDN0.25'-GGGAACAUGCUAAAUAC、SEQIDΝ0·35'-AGACACAAAUUCCUGAGA或SEQIDNO.45’-CUGUUGAGAAA的核苷酸序列結合的分子在提供了該分子的細胞中導致外顯子44的高效跳躍。而且，所示序列沒有一個源自剪接點的保守部分。因此，所述分子不大可能介導DMD前mRNA的其他外顯子或其他基因的外顯子的差異剪接。另外，通過避免與上文所定義的核苷酸序列結合的分子中的CpG對，會優選地避免其他(免疫)毒性。外顯子跳躍指在細胞中誘導成熟的mRNA，該mRNA不含有通常存在于其中的特定外顯子。外顯子跳躍通過為表達所述mRNA的前mRNA的細胞提供這樣的分子而實現，該分子能夠干擾諸如允許剪接的酶促過程所需的剪接供體或剪接受體序列的序列，或者能夠干擾識別作為外顯子而并入mRNA的一段核苷酸所需的外顯子包含信號。術語前mRNA指通過轉錄從細胞核中的DNA模板合成的未加工或部分加工的前體mRNA。本發明的某些方法會緩和具有缺失或具有外顯子44的重復的DMD患者的生肌細胞或肌細胞的一種或多種特征，該缺失包括但不限于外顯子03-43、05-43、06-43、10-43、13-43、14-43、17-43、19-43、28-43、30-43、31-43、33-43、34-43、35-43、36-43、37-43、38-43、40-43、41-43、42-43、43、45、45-54和45-68。此外，移除諸如外顯子43或外顯子45的側翼外顯子會由于該側翼外顯子中的無義點突變而引起框外轉錄。外顯子44的其他跳躍聯合側翼外顯子的跳躍會恢復DMD患者的生肌細胞或肌細胞中DMD基因的可讀框。這些突變的非限制性實例為側翼外顯子43或45中的無義點突變，它們分別要求外顯子43+44跳躍或外顯子44+45跳躍。在實施方案中，本發明的方法還可以將強BMD患者的生肌細胞或肌細胞的一種或多種特征緩和為輕微BMD患者的特征。DMD或DMD患者的細胞的特征包括肌細胞吸收的鈣增加、膠原蛋白合成增加、形態學改變、脂類生物合成改變、氧化應激和/或破壞的肌膜增加。本發明方法的優選實施方案將在后文中進行定義。在一實施方案中，本文所定義的分子可以為與特定的序列結合和/或互補的化合物分子，或者諸如經修飾能夠與RNA分子上指定的核苷酸序列結合的RNA結合蛋白或非天然鋅指蛋白的蛋白。篩查與特定核苷酸序列結合的化合物分子的方法公開于，例如PCT/NL01/00697和美國專利6，875，736中，它們通過引用并入本文。設計與特定核苷酸序列結合的RNA結合鋅指蛋白的方法公開于FriesenandDarby,NatureStructuralBiology5543-546(1998)中，其通過引用并入本文。與特定SEQIDNO:1、2、3或4序列之一結合，優4選在DMD的外顯子44的情況下，可以通過本領域技術人員已知的技術來評價。優選的技術為EP1619249所述的凝膠遷移率變動分析。在優選的實施方案中，一旦在凝膠遷移率變動分析中檢測到所述分子與標記的序列SEQIDN0:l、2、3或4的結合，則認為所述分子與特定序列之一結合。可選擇地，或者與前述實施方案結合，如后文所定義的，分子為與SEQIDNO:1、2、3或4或其部分互補或者基本上互補的寡核苷酸。該語境中所用的術語“基本上”互補表示，可以允許1個或2個或者更多個錯配，只要具有功能性，即外顯子44的誘導跳躍仍然是可接受的。本發明提供了設計能夠誘導DMD基因的外顯子44跳躍的分子的方法，該分子優選為寡核苷酸。首先，如前文所定義的，選擇與SEQIDN0:l、2、3或4之一或其部分結合的所述寡核苷酸。隨后，在優選的方法中，設計必須考慮至少以下方面之一以進一步改進所述分子-所述分子不含有CpG，-所述分子不含有G-四聯體基序，-所述分子具有可接受的RNA結合動力學和/或熱力學屬性。寡核苷酸中CpG的存在通常與所述寡核苷酸免疫原性增加有關(DornandKippenberger,CurrOpinMolTher200810⑴10-20)。這種增加的免疫原性是不期望的，因為其可能誘導肌纖維的破壞。動物模型中的免疫原性可以通過評價所述動物的肌肉活檢中的CD4+和/或CD8+細胞的存在和/或炎癥單核細胞侵潤來評價。免疫原性還可以利用本領域技術人員已知的標準免疫測定，在用本發明的寡核苷酸進行處理的動物或人的血液中，通過檢測中和抗體和/或識別所述寡核苷酸的抗體的存在來評價。免疫原性的增加可以通過利用標準免疫測定，檢測中和抗體和/或識別所述寡核苷酸的抗體的存在或增加量來評價。包含G-四聯體基序的寡核苷酸具有形成四聯體(quadruplex)的趨勢，該四聯體是通過4條單鏈寡核苷酸的Hoogsteen堿基配對形成的多聚體或集合物(aggregate)(ChengandVanDyke,Gene.1997Sep15；197(1-2):253-60)，這當然是不期望的因為預期寡核苷酸的效率會降低。多聚化或聚集優選地通過本領域技術人員已知的標準聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳技術來評價。在優選的實施方案中，小于總量的20%或15^^10%]^5%或更低的本發明的寡核苷酸具有利用上文所述的測定評價的多聚化或聚集能力。本發明允許設計具有可接受的RNA結合動力學和/或熱力學屬性的寡核苷酸。RNA結合動力學和/或熱力學性質至少部分地通過寡核苷酸的解鏈溫度來測定(Tm；用寡核苷酸屬性計算器來計算(www,unc.edu/cail/biotool/oligo/index.html)，對于單鏈RNA，利用基本Tm和最近的鄰近模型來計算)，和/或通過AON-靶外顯子復合體的自由能來測定(利用RNA結構4.。如果Tm過高，則預期寡核苷酸具有較低的特異性。可接受的Tm和自由能取決于寡核苷酸的序列。因此，對于這些參數中的每一個，難以給出優選的范圍。可接受的Tm的變動范圍可以為35°C至65°C，而可接受的自由能的變動范圍可以為Mkcal/mol至45kcal/mol。因此，技術人員可以首先選擇寡核苷酸作為潛在治療化合物，如本文所定義的，所述寡核苷酸與外顯子44的SEQIDN0:l、2、3或4或其部分結合和/或互補。技術人員可以檢查所述寡核苷酸如前文所定義地與所述序列結合。任選地，在第二步中，技術人員可以利用本發明，通過檢查CpG的不存在、G-四聯體基序的不存在，和/或通過優化其Tm和/或AON-靶復合物的自由能來進一步優化所述寡核苷酸。技術人員可以試圖設計這樣的寡核苷酸，其中不存在CpG和/或不在G-四聯體基序，和/或通過選擇與所述寡核苷酸互補的外顯子44(例如SEQID^):1、2、3或4)的不同序列來獲得更可接受的1^和/或自由能。或者，如果與外顯子44的SEQIDNO:1、2、3或4中給定的一段序列互補的寡核苷酸包含CpG、G-四聯體基序和/或不具有可接受的Tm和/或自由能，則本領域技術人員可以通過降低該寡核苷酸的長度和/或通過選擇與該寡核苷酸互補的任何SEQIDN0:l、2、3或4中不同的一段序列和/或通過改變該寡核苷酸的化學來改進任何這些參數。作為實例，如果選擇SEQIDNO:1，則設計據發現與該序列結合的幾種寡核苷酸SEQIDN0:5、49和M。據發現包含SEQIDNO:5的寡核苷酸具有最優的RNA結合動力學和/或熱力學性質，例如最優的Tm。當我們測試這些寡核苷酸誘導外顯子44跳躍的功能性時，證實包含SEQIDNO:5的寡核苷酸在這四種寡核苷酸中是最有效的。這些寡核苷酸的每一個在本發明中都是有功能的。然而，包含SEQIDNO:5的寡核苷酸是最優選的鑒定為與SEQIDNO1結合和/或互補的寡核苷酸。在該方法的任何步驟中，本發明的寡核苷酸優選為仍然能夠表現出可接受水平的功能活性的寡核苷酸。所述寡核苷酸的功能活性優選為將DMD基因的外顯子44的跳躍誘導至某種程度，以為個體提供功能性肌養蛋白和/或mRNA，和/或至少部分地降低異常肌養蛋白和/或mRNA的產生。每種這些特征在后文中定義。這些功能活性可以在個體的肌肉組織或肌細胞中，或者在體外的細胞中進行測量。可以在mRNA水平，優選利用RT-PCR來評價功能性。可以在蛋白水平，優選利用蛋白印跡分析或橫切片的免疫熒光分析來評價功能性。在優選的實施方案中，當在DMD患者的肌細胞中通過RT-PCR進行測試時，寡核苷酸被認為誘導DMD基因的外顯子44的跳躍，外顯子44跳躍百分比為至少30%、或至少35%、或至少40%、或至少45%、或至少50%、或至少55%、或至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或100%。在優選的實施方案中，這樣的寡核苷酸優選為藥物。更優選地，所述藥物用于預防或治療個體或患者的杜興肌營養不良或貝克肌營養不良。如本文所定義的，DMD前mRNA優選地表示DMD或BMD患者的DMD基因的前mRNA。優選地，患者旨在表示患有DMD或BMD的患者，或者由于他或她的遺傳背景而容易發展DMD或BMD的患者。對于DMD患者，所用的寡核苷酸優選地修正至少一個存在于所述患者的DMD基因中的DMD突變，因此會優選地產生看起來像BMD肌養蛋白的肌養蛋白所述肌養蛋白優選地為如后文所定義的功能性肌養蛋白。對于BMD患者，所用的寡核苷酸優選地修正至少一個存在于所述患者的DMD基因中的BMD突變，因此會優先產生或產生更多的比原始存在于所述BMD患者中的肌養蛋白更具功能性的肌養蛋白。甚至更優選地，所述藥物增加個體的功能性或更具功能性的肌養蛋白和/或mRNA的產生，和/或至少部分地降低個體的異常或功能性較低的肌養蛋白和/或mRNA的產生。優選地，本發明的方法通過誘導和/或促進患者的一種或多種細胞中，優選肌細胞中如本文所定義的至少DMD前mRNA的外顯子44的跳躍來增加該患者的更具功能性的肌養蛋白和/或mRNA的產生，和/或降低該個體的異常或功能性較低的肌養蛋白和/或mRNA的產生。通常在DMD患者中增加患者的更具功能性的肌養蛋白和/或mRNA的產生，和/或降低患者的異常肌養蛋白和/或mRNA的產生。通常在BMD患者中增加更具功能性的或功能性肌養蛋白和/或mRNA的產生。因此，優選方法是這樣的方法，其中在患者中，或者在所述患者的一種或多種細胞中，增加更具功能性的或功能性肌養蛋白和/或mRNA的產生，和/或降低所述患者的異常肌養蛋白和/或mRNA的產生，其中所述異常肌養蛋白和/或mRNA或者所述更具功能性的肌養蛋白和/或mRNA的水平通過與所述方法起作用時所述患者的所述肌養蛋白和/或mRNA的水平進行比較來評價。如本文所定義的，功能性肌養蛋白優選地為對應于具有SEQIDN0:55所定義的氨基酸序列的蛋白的野生型肌養蛋白。功能性肌養蛋白優選地為這樣的肌養蛋白，其在其N末端部分具有肌動蛋白結合結構域(N末端的前240個氨基酸)、富含半胱氨酸的結構域(氨基酸3361至3685)以及C末端結構與(C末端的后325個氨基酸)，并且這些結構域的每一個都存在于本領域技術人員已知的野生型肌養蛋白中。本文所示的氨基酸對應于SEQIDNO:55所示的野生型肌養蛋白的氨基酸。在另一實施方案中，功能性肌養蛋白為表現出至少某種程度的野生型肌養蛋白活性。優選地，“至少某種程度”表示野生型功能性肌養蛋白相應活性的至少30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^；100%。在該語境中，優選地，野生型肌養蛋白的活性為與肌動蛋白結合以及與肌養蛋白相關的糖蛋白復合物(DGC)結合(Aartsma-RusAetal,(2006)，EntriesintheleidenDuchenneMuscularDystrophymutationdatabase:anoverviewofmutationtypesandparadoxicalcasesthatconfirmthereading-framerule(進入leiden杜興肌營養不良突變數據庫確定讀框規則的突變類型和矛盾事例的綜述)，MuscleNerve,34:135-144.)。如技術人員已知的，肌養蛋白與肌動蛋白的結合以及與DGC復合物的結合可以通過利用總蛋白提取物的共免疫沉淀或疑似為營養不良的肌肉活檢橫切片的免疫熒光分析，進行觀察。患有杜興肌營養不良的個體通常在編碼肌養蛋白的基因中具有突變，該突變防止合成完整的蛋白，即過早終止防止合成該蛋白的C末端。在貝克肌營養不良中，肌養蛋白基因與野生型相比也包含突變，但是該突變通常不包含過早終止并且通常合成該蛋白的C末端。因此，合成了具有與野生型蛋白在活性類型至少相同的功能性肌養蛋白，盡管不一定是相同量的活性。在優選的實施方案中，功能性肌養蛋白表示框內肌養蛋白基因。BMD個體的基因組通常編碼包含N末端部分(N末端的前240個氨基酸)、富含半胱氨酸的結構域(氨基酸3361至3685)和C末端結構域(C末端的后325個氨基酸)的肌養蛋白，但是其中心桿狀結構域可以短于野生型肌養蛋白的中心桿狀結構域(Aartsma-RusAetal,(2006)，EntriesintheleidenDuchenneMuscularDystrophymutationdatabase:anoverviewofmutationtypesandparadoxicalcasesthatconfirmthereading-framerule(進入leiden杜興肌營養不良突變數據庫確定讀框規則的突變類型和矛盾事例的綜述)，MuscleNerve，34:135-144.)。本文所示的氨基酸對應于SEQIDNO:55所示的野生型肌養蛋白的氨基酸。用于治療DMD的外顯子跳躍優選地，但非專門地涉及通過使桿狀結構域中的外顯子跳躍來克服前mRNA的過早終止以修正可讀框并允許合成包含C末端在內的肌養蛋白的剩余部分，盡管該蛋白由于較小的桿狀結構域而稍微變小。在優選的實施方案中，可以為患有DMD并用本文所定義的寡核苷酸治療的個體提供表現出至少某種程度的野生型肌養蛋白活性的肌養蛋白。更優選地，如果所述個體為杜興肌營養不良患者或者疑似為杜興肌營養不良患者，則功能性肌養蛋白為在功能性上與患有BMD的個體的肌養蛋白相當的肌養蛋白優選地，所述肌養蛋白能夠與肌動蛋白和DGC相互作用，但是其中心桿狀結構域可以短于野生型肌養蛋白的中心桿狀結構域(Aartsma-RusAetal,(2006)，EntriesintheleidenDuchenneMuscularDystrophymutationdatabase:anoverviewofmutationtypesandparadoxicalcasesthatconfirmthereading-framerule(入leiden杜興肌營養不良突變數據庫確定讀框規則的突變類型和矛盾事例的綜述)，MuscleNerve,34:135-144.)。野生型肌養蛋白的中心桿狀結構域包含M個血影蛋白樣重復(Aartsma-RusAetal,(2006)，EntriesintheleidenDuchenneMuscularDystrophymutationdatabase:anoverviewofmutationtypesandparadoxicalcasesthatconfirmthereading-framerule(進入leiden杜興肌營養不良突變數據庫確定讀框規則的突變類型和矛盾事例的綜述)，MuscleNerve,34:135-144.)。例如，本文所提供的肌養蛋白的中心桿狀結構域可以包含5-23、10-22或12-18個血影蛋白樣重復，只要其能夠與肌動蛋白和與DGC結合。降低所述患者或所述患者細胞中的異常肌養蛋白的產生可以在mRNA水平評價，并且優選地表示99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更低的原始量的異常肌養蛋白mRNA仍然可以通過RTPCR檢測。異常肌養蛋白mRNA或蛋白在本文中也稱為非功能性或功能性較低至非功能性或半功能性的肌養蛋白mRNA或蛋白。非功能性前mRNA肌養蛋白優選地導致框外肌養蛋白，這表示沒有產生和/或檢測到肌養蛋白。非功能性肌養蛋白優選地為不能與肌動蛋白和/或DGC蛋白復合物的成員結合的肌養蛋白。非功能性肌養蛋白或肌養蛋白mRNA通常不具有或不編碼具有完整的蛋白C末端的肌養蛋白。增加患者或所述患者細胞中功能性肌養蛋白的產生可以在mRNA水平評價(通過RT-PCR分析)，并且優選地表示可檢測量的功能性或框內肌養蛋白可以通過RTPCR檢測。在另一實施方案中，1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的可檢測肌養蛋白mRNA是功能性或框內肌養蛋白mRNA。增加患者或所述患者細胞中功能性肌養蛋白的產生可以在蛋白水平評價(通過免疫熒光和蛋白印跡分析)，并且優選地表示可檢測量的功能性肌養蛋白可以通過免疫熒光或蛋白印跡分析檢測。在另一實施方案中，1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的可檢測肌養蛋白是功能性肌養蛋白。增加或降低優選地在個體或患者的肌肉組織或肌細胞中通過與在用本發明的所述分子或組合物進行治療之前存在于所述個體或患者中的量進行比較來評價。或者，比較可以用所述個體或患者的肌肉組織或細胞來進行，如果治療是局部的，所述個體或患者尚未用所述寡核苷酸或組合物進行治療。在另一方面，提供了用于緩和個體的杜興肌營養不良或貝克肌營養不良的一種或多種癥狀，或者緩和所述個體的生肌細胞或肌細胞的一種或多種特征的方法，所述方法包括給予所述個體如本文所定義的寡核苷酸或組合物。還提供了用于增強、誘導或促進患有杜興肌營養不良或貝克肌營養不良個體的表達肌養蛋白前mRNA的細胞中所述肌養蛋白前mRNA的外顯子跳躍的方法，所述方法包括給8予所述個體如本文所定義的寡核苷酸或組合物。還提供了用于增加細胞中功能性肌養蛋白的產生和/或降低細胞中異常肌養蛋白的產生的方法，所述細胞包含編碼異常肌養蛋白的肌養蛋白基因的前mRNA，所述方法包括為所述細胞提供本發明的寡核苷酸或組合物并允許由所述前mRNA剪接產生的mRNA翻譯。在一實施方案中，所述方法在體內進行，例如利用細胞培養。優選地，所述方法為所述個體體內的。在本上下文中，已經了定義了增加功能性肌養蛋白的產生。利用本發明的分子或組合物緩和個體的杜興肌營養不良或貝克肌營養不良的一種或多種癥狀可以通過任何以下測定來評價至喪失行走的時間延長、肌肉強度改善、舉起重物的能力改善、從地板起來的時間改善、9米行走時間改善、4階爬行所耗時間改善、腿功能等級改善、肺功能改善、心臟功能改善、生活質量改善。這些測定中的每個測定對技術人員是已知的。作為實例，出版物Manzureta1(ManzurAYetal,(2008),GlucocorticoidcorticosteroidsforDuchennemusculardystrophy(用于杜興肌營養不良的糖皮質激素皮質類固醇)(綜述)，Wileypublishers,TheCochranecollaboration.)給出了這些測定中的每個測定的大量解釋。對于這些測定中的每個測定，只要在測定中發現所測量參數的可檢測的改善或延長，這優選地表示利用本發明的分子或組合物緩和了個體的杜興肌營養不良或貝克肌營養不良的一種或多種癥狀。可檢測的改善或延長優選地為如Hodgettsetal(HodgettsS.，etal,(2006),NeuromuscularDisorders,16:591-602)所述的統計上顯著的改善或延長。或者，杜興肌營養不良或貝克肌營養不良的一種或多種癥狀的緩和可以通過測量與肌纖維的功能、完整性和/或存活相關的肌纖維特征的改善來評價，所述特征在患者自身進行評價。這樣的特征可以在給定患者的細胞、組織水平進行評價。一種或多種特征的緩和可以通過患者的生肌細胞或肌細胞的任何以下測定進行評價肌細胞鈣吸收減少、膠原蛋白合成降低、形態學改變、脂類生物合成改變、氧化應激降低和/或肌纖維功能、完整性和/或存活改善。這些參數通常利用肌肉活檢橫切片的免疫熒光和/或組織化學分析來評價。本文所用的寡核苷酸優選地包括反義寡核苷酸或反義寡核糖核苷酸。在優選的實施方案中，應用了外顯子跳躍技術。外顯子跳躍干擾發生于真核細胞中的天然剪接過程。在高等真核生物中，細胞DNA中的蛋白質遺傳信息編碼于外顯子中，該外顯子被內含子序列互相隔離。這些內含子在某些情況下非常長。真核生物的轉錄系統(transcriptionmachinery)產生含有外顯子和內含子的前mRNA，而已經在產生前mRNA期間的剪接系統通過存在于前mRNA中的外顯子剪接在一起產生蛋白的實際編碼區。外顯子跳躍導致缺乏至少一個跳躍的外顯子的成熟mRNA。因此，當所述外顯子編碼氨基酸時，外顯子跳躍導致表達改變的產物。外顯子跳躍技術目前涉及使用反義寡核苷酸(AON)。許多這項工作在杜興肌營養不良的mdx小鼠模型中完成。Mdx小鼠攜帶外顯子23中的無義突變。除了妨礙合成功能性肌養蛋白的mdx突變以外，已經在mdx肌肉組織中觀察到稀有的天然存在的肌養蛋白陽性纖維。這些肌養蛋白陽性纖維被認為來自由于體細胞突變或通過替代剪接而導致的明顯天然存在的外顯子跳躍機制。分別涉及肌養蛋白前mRNA中的內含子22和23的3’和/或5’剪接位點的AON被證實干擾通常參與除去內含子23的因子，從而外顯子23也從mRNA中被除去(AlterJ，etal.Systemicdeliveryofmorpholinooligonucleotiderestoresdystrophinexpressionbodywideandimprovesdystrophicpathology(嗎啉代寡核苷酸的全身遞送恢復身體范圍的肌養蛋白表達并改善營養不良病理學).NatMed2006；12(2):175-7,LuQL,etal.FunctionalamountsofdystrophinproducedbyskippingthemutatedexoninthemdxdystrophicmouseOiidx營養不良小鼠中突變的外顯子所產生的功能量的肌養蛋白).NatMed2003；66,LuQL,etal.Systemicdeliveryofantisenseoligoribonucleotiderestoresdystrophinexpressioninbody-wideskeletalmuscles(反義寡核糖核苷酸的全身遞送恢復身體范圍骨骼肌中的肌養蛋白表達)NatlAcadSciUSA2005；102(1)198-203,MannCJ,etal,Improvedantisenseoligonucleotideinducedexonskippinginthemdxmousemodelofmusculardystrophy(改進的反義寡核糖核苷酸誘導肌肉萎縮癥的mdx小鼠模型中的外顯子跳躍).JGeneMed2002；4(6):644-54orGrahamIR,etal,Towardsatherapeuticinhibitionofdystrophinexon23splicinginmdxmousemuscleinducedbyantisenseoligoribonucleotides(spIicomers)targetsequenceoptimisationusingoligonucleotidearrays(針對mdx小鼠肌肉中由反義寡核糖核苷酸(剪接體)誘導的肌養蛋白外顯子23剪接的治療抑制利用寡核苷酸陣列優化靶序列).JGeneMed2004；6(10):1149-58)。通過特定外顯子的靶向跳躍，將DMD表型轉變為較輕微的BMD表型。外顯子跳躍優選地由靶向外顯子內部序列的AON的結合誘導。針對外顯子內部序列的寡核苷酸通常不表現出與非外顯子序列的重疊。其優選地不與剪接位點重疊，至少在剪接位點存在于內含子中的情況下不重疊。針對外顯子內部序列的寡核苷酸優選地不含有與鄰近的內含子互補的序列。因此，還提供了本發明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其功能性等同物用于抑制肌養蛋白前mRNA的外顯子包含入所述前mRNA的剪接所產生的mRNA中。優選應用外顯子跳躍技術，從而肌養蛋白前mRNA所產生的mRNA的外顯子缺乏產生了雖然較短但更具功能性的肌養蛋白的編碼區。在本語境中，如前文所定義的，抑制外顯子的包含優選地表示檢測到原始的異常肌養蛋白mRNA和/或蛋白降低。在本發明的語境中，寡核苷酸的功能性等同物優選地表示如本文本文所定義的寡核苷酸，其中一個或多個核苷酸已經被取代，并且其中至少在某種程度上保留了所述功能性等同物的活性。優選地，所述功能性等同物的活性提供了功能性肌養蛋白。因此，所述功能性等同物的所述活性優選地通過定量功能性肌養蛋白的量或通過定量功能性肌養蛋白mRNA的量來評價。優選地，功能性肌養蛋白(或功能性肌養蛋白mRNA)在本文中被定義為能夠與肌動蛋白及DGC蛋白的成員結合的肌養蛋白(或由所述mRNA編碼的肌養蛋白)。寡核苷酸的所述活性的評價，優選地通過RT-PCR(m-RNA)進行，或通過免疫熒光或蛋白印跡分析(蛋白)進行。當其表示至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%或者更高的功能性等同物所來源的所述寡核苷酸的相應活性時，所述活性優選地保留至某種程度。這類活性可以在個體的肌肉組織或肌細胞中或者在體外于細胞中，通過與功能性等同物所來源的所述寡核苷酸的相應寡核苷酸的活性進行比較來測量。在本申請中，當使用詞語寡核苷酸時，其可以由本文所定義的該寡核苷酸的功能性等同物替代。在優選的實施方案中，包含前文所定義的與肌養蛋白前mRNA的外顯子44結合和/或互補的序列的本發明的寡核苷酸是這樣的互補部分是本發明寡核苷酸長度的至少50%，更優選至少60%，甚至更優選至少70%，甚至更優選至少80%，甚至更優選至少90%或者甚至更優選至少95%，或者甚至更優選至少98%，或者甚至更優選至少99%，或者甚至更優選100%。在最優選的實施方案中，本發明的寡核苷酸由如本文所定義的與肌養蛋白前mRNA的部分互補的序列組成。作為實例，寡核苷酸可以包含與本文所定義的肌養蛋白前mRNA的部分互補的序列和另外的側翼序列。在更優選的實施方案中，所述寡核苷酸的所述互補部分的長度為至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、M、55、56、57、58、59或60個核苷酸。優選地，用另外的側翼序列改良蛋白與寡核苷酸的結合，或改良寡核苷酸的熱力學性質，更優選地改良靶RNA結合親和力。因此，并不絕對要求互補區中的所有堿基能夠與相反鏈中的堿基配對。例如，當設計寡核苷酸時，可以例如并入不與互補鏈上的堿基配對的殘基。可以允許某種程度的錯配，如果在細胞環境中，核苷酸的長度足夠與互補部分雜交。在該語境中，“足夠”優選地表示利用EP1619249的實施例1所述的凝膠遷移率變動分析，寡核苷酸的結合是可檢測的。任選地，所述寡核苷酸還可以通過轉染入患者的肌細胞來進行測試。靶向外顯子的跳躍可以通過RT-PCR評價(如EP1619249所述)。互補區優選地如此設計，即當組合時，他們對前mRNA中的外顯子是特異性的。可以用各種長度的互補區來產生這樣的特異性，因為這取決于系統中其他(前)mRNA的實際序列。一種或多種其他前mRNA也會能夠與寡核苷酸雜交的風險隨著寡核苷酸大小的增加而降低。明顯的是，在互補區中包含錯配但保留與前mRNA中靶向區域雜交和/或結合的能力的寡核苷酸可以用于本發明中。然而，優選地，至少互補部分不包含這樣的錯配，因為這些部分通常比在一個或多個互補區中具有這樣的錯配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特異性。據認為較高的雜交強度(即，增加與相反鏈的相互作用的數目)有利于增加干擾系統的剪接機構的過程的效率。優選地，互補為90%至100%。通常，在20個核苷酸的寡核苷酸中，這允許1或2個錯配，或者在40個核苷酸的寡核苷酸中，允許1、2、3或4個錯配，或者在60個核苷酸的寡核苷酸中，允許1、2、3、4、5或6個錯配。本發明的優選分子包含基于核苷酸的序列或由基于核苷酸的序列組成，該基于核苷酸的序列與選自DMD前mRNA的外顯子44的序列反義。DMD前mRNA的序列優選地選自SEQIDNO1:5，-GUGGCUAACAGAAGCU；SEQIDNO25‘-GGGAACAUGCUAAAUAC；SEQIDNO35，-AGACACAAAUUCCUGAGA和SEQIDNO4:5’-CUGUUGAGAAA。本發明的分子優選為分離的分子。本發明的分子優選為核酸分子或基于核苷酸的分子或寡核苷酸或反義寡核苷酸，其與選自SEQIDN0:l、2、3或4的外顯子44的序列結合和/或互補。本發明的優選分子包含約8至約60個核苷酸或由約8至約60個核苷酸組成，更優選包含約10至約50個核苷酸或由約10至約50個核苷酸組成，更優選包含約17至約40個核苷酸或由約17至約40個核苷酸組成，更優選包含約18至約30個核苷酸或由約18至約30個核苷酸組成，更優選包含約18至約M個核苷酸或由約18至約M個核苷酸組成，最優選包含約20個核苷酸或由約20個核苷酸組成，例如18個核苷酸、19個核苷酸、20個核苷酸、21個核苷酸、22個核苷酸或23個核苷酸。本發明的優選分子包含8至60個核苷酸或由8至60個核苷酸組成，更優選包含10至50個核苷酸或由10至50個核苷酸組成，更優選包含17至40個核苷酸或由17至40個核苷酸組成，更優選包含18至30個核苷酸或由18至30個核苷酸組成，更優選包含21至60個核苷酸或由21至60個核苷酸組成，更優選包含22至55個核苷酸或由22至55個核苷酸組成，更優選包含23至53個核苷酸或由23至53個核苷酸組成，更優選包含M至50個核苷酸或由M至50個核苷酸組成，更優選包含25至45個核苷酸或由25至45個核苷酸組成，更優選包含26至43個核苷酸或由沈至43個核苷酸組成，更優選包含27至41個核苷酸或由27至41個核苷酸組成，更優選包含觀至40個核苷酸或由觀至40個核苷酸組成，更優選包含四至40個核苷酸或由四至40個核苷酸組成，更優選包含18至M個核苷酸或由18至M個核苷酸組成，或者優選地包含11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸或由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸組成。在某些實施方案中，本發明提供了包含選自表IA所示的反義核苷酸序列的反義核苷酸序列的分子，或由選自表IA所示的反義核苷酸序列的反義核苷酸序列組成的分子。與具有核苷酸序列SEQIDNO1:5，_GUGGCUAACAGAAGCU的核苷酸結合和/或互補和/或反義的本發明的分子或核酸分子，優選地包含以下反義核苷酸序列或由以下反義核苷酸序列組成SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO28,SEQIDNO29,SEQIDNO30,SEQIDNO31、SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO38,SEQIDNO:39、SEQIDNO:41,SEQIDNO42,SEQIDNO49或SEQIDNO:54。革巴向DMD前mRNA的該區域的優選分子包含以下反義核苷酸序列或由以下反義核苷酸序列組成SEQIDNO5,SEQIDNO49或SEQIDNO54。最優選的寡核苷酸包含SEQIDNO:5的反義核苷酸序列或由SEQIDNO5的反義核苷酸序列組成。在更優選的實施方案中，本發明提供了包含反義核苷酸序列SEQIDNO55，-UCAGCUUCUGUUAGCCACUG或由反義核苷酸序列SEQIDNO5:5，-UCAGCUUCUGUUAGCCACUG組成的分子。據發現，該分子非常有效地調節肌細胞中DMD基因的外顯子44的剪接。包含SEQIDNO:5的本發明的這種優選分子包含21至60個核苷酸，更優選包含22至55個核苷酸，更優選包含23至53個核苷酸，更優選包含M至50個核苷酸，更優選包含25至45個核苷酸，更優選包含26至43個核苷酸，更優選包含27至41個核苷酸，更優選包含觀至40個核苷酸，更優選包含四至40個核苷酸，或者優選地包含20、21、22、23、M、25、沈、27、觀、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸或者由20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸組成。在另一優選的實施方案中，本發明提供了包含反義核苷酸序列SEQIDNO49或討或者由反義核苷酸序列SEQIDNO49或M組成的分子。包含SEQIDNO49或SEQIDNO54的本發明的這些優選分子還包含18至60個核苷酸，更優選包含18至55個核苷酸，更優選包含20至53個核苷酸，更優選包含M至50個核苷酸，更優選包含25至45個核苷酸，更優選包含26至43個核苷酸，更優選包含27至41個核苷酸，更優選包含洲至40個核苷酸，更優選包含四至40個核苷酸，或者優選地包含18、19、20、21、22、23、M、25、沈、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸，或者由18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸組成。在另一實施方案中，與SEQIDNO2:5，-GGGAACAUGCUAAAUAC反義的本發明的分子優選地包含SEQIDNO43或SEQIDNO44的反義核苷酸序列或由SEQIDNO43或SEQIDNO44的反義核苷酸序列組成。包含SEQIDNO43或SEQIDNO44的本發明的優選分子還包含17至60個核苷酸，更優選包含18至30個核苷酸，更優選包含21至60個核苷酸，更優選包含22至55個核苷酸，更優選包含23至53個核苷酸，更優選包含M至50個核苷酸，更優選包含25至45個核苷酸，更優選包含沈至43個核苷酸，更優選包含27至41個核苷酸，更優選包含觀至40個核苷酸，更優選包含四至40個核苷酸，更優選包含18至24個核苷酸，或者優選地包含17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸，或者由17、18、19、20、21、22、23、對、25、洸、27、沘、29、30、31、32、33、；34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸組成。仍然在另一實施方案中，與SEQIDNO3:5’-AGACACAAAUUCCUGAGA反義的本發明的分子，優選地包含SEQIDNO47或SEQIDNO48的反義核苷酸序列或者由SEQIDNO47或SEQIDNO48的反義核苷酸序列組成。包含SEQIDNO47或SEQIDNO48的本發明的這些優選分子還包含17至60個核苷酸，更優選包含18至30個核苷酸，更優選包含17至60個核苷酸，更優選包含22至55個核苷酸，更優選包含23至53個核苷酸，更優選包含24至50個核苷酸，更優選包含25至45個核苷酸，更優選包含沈至43個核苷酸，更優選包含27至41個核苷酸，更優選包含28至40個核苷酸，更優選包含四至40個核苷酸，更優選包含18至24個核苷酸，或者優選地包含17、18、19、20、21、22、23、對、25、洸、27、沘、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸，或者由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸組成。仍然在另一實施方案中，與SEQIDNO4:5，_CUGUUGAGAAA反義的本發明的分子優選地包含SEQIDNO45或SEQIDNO46的反義核苷酸序列或由SEQIDNO45或SEQIDNO46的反義核苷酸序列組成。包含SEQIDNO45或SEQIDNO:46的本發明的這些優選分子還包含11至60個核苷酸，更優選包含11至30個核苷酸，更優選包含11至60個核苷酸，或者優選地包含11、12、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、1332、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸，或者由11、12、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸組成。本發明的分子的核苷酸序列可以含有RNA殘基，或者一個或多個DNA殘基，和/或一個或多個核苷酸類似物或等同物，如將在下文進一步所詳細地描述的。優選本發明的分子包含一個或多個殘基，該殘基經修飾增加核酸酶抗性和/或增加反義核苷酸對靶序列的親和力。因此，在優選的實施方案中，反義核苷酸序列包含至少一種核苷酸類似物或等同物，其中核苷酸類似物或等同物被定義為具有修飾的堿基和/或修飾的主鏈和/或非天然核苷間連接或這些修飾的組合的殘基。在優選的實施方案中，核苷酸類似物或等同物包含修飾的主鏈。此類主鏈的實例為嗎啉代主鏈；氨基甲酸酯主鏈；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主鏈；亞甲基甲酰基(methyleneformacetyl)主鏈；核糖乙酰基(riboacetyl)主鏈；含有烯烴的主鏈；氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺主鏈、亞甲基亞胺基和亞甲基胼基主鏈；以及酰胺主鏈。二氨基磷酸酯(Phosphorodiamidate)嗎啉代低聚物為已經作為反義試劑而研究的修飾的主鏈寡核苷酸。嗎啉代寡核苷酸具有不帶電的主鏈，其中DNA的脫氧核糖由6元環代替并且磷酸二酯鍵由二氨基磷酸酯鍵代替。嗎啉代寡核苷酸對酶促降解具有抗性，并且看起通過阻止翻譯干擾前mRNA剪接而不是通過激活RNaseH(核糖核酸酶H)來充當反義試劑發揮作用。已經通過物理破壞細胞膜的方法將嗎啉代寡核苷酸成功地送遞至組織培養細胞，并且比較這些方法中的幾個方法的研究發現劃痕負載(scrapeloading)是最有效的送遞方法；然而，由于嗎啉代主鏈是不帶電的，所以陽離子脂類不是細胞中嗎啉代寡核苷酸吸收的有效介質。最近的報告證明，嗎啉代寡核苷酸形成三鏈體，并且由于非離子主鏈，這些研究表明，嗎啉代寡核苷酸在沒有鎂的情況下能夠形成三鏈體。還優選的是，主鏈的殘基之間的連接不包含磷原子，例如由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵合、混合的雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵合或者一種或多種短鏈雜原子或雜環核苷間鍵合形成的連接。優選的核苷酸類似物或等同物包含具有修飾的聚酰胺主鏈的肽核酸(PNA)(Nielsen,etal.(1991)Science254，1497-1500)。對于堿基對的識別，基于PNA的分子是DNA分子的真實模擬。PNA主鏈由通過肽鍵連接的N-(2-氨基乙基)_甘氨酸單元組成，其中核堿基通過亞甲基羰基鍵連接至主鏈。替代性主鏈包含一碳延伸的吡咯烷PNA單體(GovindarajuandKumaH2005)Chem.Commun，495-497)。由于PNA分子的主鏈含有不帶電的磷酸基團，所以PNA-RNA雜化物通常分別比RNA-RNA或RNA-DNA雜化物更穩定(Egholmetal(1993)Nature365,566-568)。另一優選的主鏈包含嗎啉代核苷酸類似物或等同物，其中核糖或脫氧核糖由6元嗎啉代環代替。最優選的核苷酸類似物或等同物包含二氨基磷酸酯嗎啉代低聚物(PMO)，其中核糖或脫氧核糖由6元嗎啉代換代替，并且鄰近的嗎啉代環之間的陰離子磷酸二酯鍵由非離子二氨基磷酸酯鍵代替。仍然在另一實施方案中，本發明的核苷酸類似物或等同物包含磷酸二酯鍵中一個非橋接氧的取代。這種修飾稍微使堿基配對不穩定，但是明顯地增加了對核酸酶降解的抗性。優選的核苷酸類似物或等同物包括硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；H-膦酸酯；包括3’_亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯在內的甲基及其他烷基膦酸酯；次膦酸酯；包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在內的氨基磷酸酯；硫羰基氨基磷酸酯；硫羰基烷基膦酸酯；硫羰基烷基磷酸三酯；硒代磷酸鹽(selenophosphate)或硼烷磷酸酯(boranophosphate)。本發明的另一優選核苷酸類似物或等同物包含一個或多個糖部分，其是2’、3’和/或5’位置處的單或二取代的，如-OH；-F；取代或未取代、直鏈或支鏈低級(Cl-ClO)的烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，其可以被一個或多個雜原子中斷；0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；0-、S-或N-烯丙基；0-烷基-0-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲基氨基氧基乙氧基(dimethylaminooxyethoxy)；以及-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以是吡喃糖或其衍生物或者脫氧吡喃糖或其衍生物，優選核糖或其衍生物或者脫氧核糖或其衍生物。優選的衍生化的糖部分包含鎖核酸(LockedNucleicAcid，LNA)，其中2’-碳原子連接至糖環的3’或4’碳原子，從而形成雙環糖部分。優選的LNA包括2，-0，4，-C-乙烯橋接的核酸(Moritaetal.2001.NucleicAcidResSupplementNo.1:241-242)。這些取代賦予核苷酸類似物或等同物RNaseH和核酸酶抗性并增加對靶RNA的親和力。在另一實施方案中，本發明的核苷酸類似物或等同物包含一個或多個堿基修飾或取代。修飾的堿基包括合成和天然堿基，如肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤以及本領域已知或會知道的嘧啶和嘌呤的其他氮雜、脫氮(deaza)、-羥基、-鹵代、-硫代、巰基、-烷基、-烯基、-炔基、硫代烷基衍生物。技術人員應當理解，并不需要統一地修飾反義寡核苷酸的所有位置。另外，多于一個的前述類似物或等同物可以被并入單個反義寡核苷酸或者甚至反義寡核苷酸的一個位置處。在某些實施方案中，本發明的反義寡核苷酸具有至少兩種不同類型的類似物或等同物。本發明優選的反義寡核苷酸包括2’-0烷基硫代磷酸酯反義寡核苷酸，如2'-0-甲基修飾的核糖(RNA)、2’-0_乙基修飾的核糖、2’-0_丙基修飾的核糖和/或諸如鹵代衍生物的這些修飾的取代衍生物。本發明的最優選反義寡核苷酸包2’-0-甲基硫代磷酸酯核糖。技術人員應當理解，可以將不同的反義寡核苷酸組合，用于外顯子44有效跳躍。在優選的實施方案中，將至少兩種反義寡核苷酸的組合用于本發明的方法中，例如，兩種不同的反義寡核苷酸、三種不同的反義寡核苷酸、四種不同的反義寡核苷酸或五種不同的反義寡核苷酸。可以將反義寡核苷酸連接至增強細胞的反義寡核苷酸吸收的部分，優選生肌細胞或肌細胞。這些部分的實例為膽固醇；碳水化合物；維生素；生物素；脂類；磷脂；穿透細胞的肽，其包括但不限于觸角蛋白(antennapedia)、TAT、運送子(transportan)和帶正電的氨基酸，如寡精氨酸、聚精氨酸、寡賴氨酸或聚賴氨酸；抗原結合結構域，如抗體提供的抗原結合結構域、抗體的Fab片段或單鏈抗原結合結構域，如卵形單結構域抗原結合結構域(cameIoidsingledomainantigen-bindingdomain)。優選的反義寡核苷酸包含肽連接的ΡΜ0。可以利用本領域已知的合適方法間接地給予寡核苷酸。例如，可以向個體或所述個體的細胞、組織或器官提供表達載體形式的寡核苷酸，其中該表達載體編碼包含所述寡核苷酸的轉錄本。優選地通過基因送遞媒介物將表達載體導入細胞、組織、器官或個體。在優選的實施方案中，提供了基于病毒的表達載體，該基于病毒的表達載體包含驅動本文所鑒定的分子表達或轉錄的表達盒或轉錄盒。可以通過質粒來源的反義寡核苷酸表達或者由基于腺病毒的載體或基于腺伴隨病毒的載體所提供的病毒表達來為細胞提供能夠干擾基本序列的分子，該分子導致高效的外顯子44跳躍。表達優選地由聚合酶III啟動子驅動，例如U1、TO或U7RNA啟動子。優選的送遞媒介物是病毒載體，如腺伴隨病毒載體(AAV)、諸如慢病毒載體的逆轉錄病毒(GoyenvalleA，etal·RescueofdystrophicmusclethroughU7snRNA-mediatedexonskipping.Science2004；306(5702):1796-9，DeAngelisFG，etal·ChimericsnRNAmoleculescarryingantisensesequencesagainstthesplicejunctionsofexon51ofthedystrophinpre—mRNAinduceexonskippingandrestorationofadystrophinsynthesisinDelta48-50DMDcells(帶有針對月/I養蛋白前mRNA的外顯子51的剪接點的反義序列的嵌合snRNA分子在Delta48-50DMD中誘導外顯子跳躍并恢復肌養蛋白合成hftOcNatlAcadSciUSA2002；99(14):9456-61或DentiMA,etal.Chimericadeno-associatedvirus/antisenseUlsmallnuclearRNAeffectivelyrescuesdystrophinsynthesisandmusclefunctionbylocaltreatmentofmdxmice(嵌合腺伴隨病毒/反義Ul小核RNA通過mdx小鼠的局部治療有效地解救肌養蛋白合成和肌肉功能).HumGeneTher2006；17(5):565-74)等。此外，可以將質粒、人工染色體、可用于人基因組細胞中的靶向同源重組和整合的質粒合適地用于送遞本文所定義的寡核苷酸。本發明優選的是那些載體，其中轉錄由PolIII啟動子驅動，和/或其中轉錄本為與Ul或U7轉錄本融合物的形式，這獲得送遞小轉錄本的良好結果。技術人員可以設計合適的轉錄本。優選的是PolIII驅動的轉錄本。優選地，為與Ul或U7轉錄本融合轉錄本的形式(參見，相同的GoyenvalleAetal，DeAngelisFGetal或DentiMAetal)。這樣的融合物可以如所述產生(GormanL,etal,Stablealterationofpre-mRNAsplicingpatternsbymodifiedU7smallnuclearRNAs(fflil^i^WU7/Jn^RNA11地改變前mRNA剪接模式).ProcNatlAcadSciUSA1998；95(9):4擬9_34或SuterD，etal,Double-targetantisenseU7snRNAspromoteefficientskippingofanaberrantexoninthreehumanbeta—thalassemicmutations(雙革巴向反義U7snRNA促進三禾中人β地中海貧血突變中的異常外顯子的有效跳躍).HumMolGenet1999；8(13):2415-23)。可以送遞寡核苷酸自身。然而，寡核苷酸也可以由病毒載體編碼。通常，寡核苷酸為RNA轉錄本的形式，該RNA轉錄本包含所述轉錄本的一部分中的寡核苷酸的序列。一種優選的反義寡核苷酸表達系統是基于腺病毒伴隨病毒(AAV)的載體。已經開發了單鏈和雙鏈基于AAV的載體，該載體可以延長小反義核苷酸序列的表達，用于使DMD的外顯子44高效跳躍。優選的基于AAV的載體包含由聚合酶III啟動子(PolIII)驅動的表達盒。優選的PolIII啟動子為，例如Ul、TO或U7RNA啟動子。因此，本發明還提供了基于病毒的載體，其包含PolIII啟動子驅動的表達盒，用于表達本發明的誘導DMD基因的外顯子44跳躍的反義寡核苷酸。考慮到已經目前已經實現的進步，所以期望改善為個體或所述個體的細胞、組織、器官提供寡核苷酸和/或其等同物的方式。當然，可以并入這樣的未來改進，來利用本發明的方法實現對重建mRNA的所述效果。可以將寡核苷酸和/或其等同物自身送遞至個體、所述個體的細胞、組織或器官。當給予寡核苷酸和/或其等同物時，優選將寡核苷酸和/或其等同物溶于與送遞方法相容的溶液中。可以通過提供水溶液中的質粒，為肌細胞或生肌細胞提供用于反義寡核苷酸的質粒。或者，可以利用已知的轉染試劑，通過轉染來提供質粒。對于靜脈內、皮下、肌肉內、鞘內和/或心室內給藥，優選溶液為生理鹽水溶液。特別優選的是，在本發明中使用賦形劑或轉染試劑，其有助于將本文所定義的每種組分送遞至細胞和/或送遞入細胞，優選肌細胞。能夠形成復合物、納米顆粒、微團、小泡和/或脂質體的賦形劑或轉染試劑是優選的，其將復合或捕捉在小泡或脂質體中的本文所定義的每種組分送遞通過細胞膜。許多這些賦形劑在本領域是已知的。合適的賦形劑或轉染試劑包括聚乙烯亞胺(PEI；ExGen500(MBIFermentas))；LipofectAMINE2000或其衍生物；或者類似的陽離子聚合物，其包括聚丙烯亞胺或聚乙烯亞胺共聚物(PEC)和衍生物；合成親水脂分子(SAINT-18)；IipofectinTM；DOTAP；和/或病毒衣殼蛋白，其能夠自我組裝成可以將本文所定義的每種組分送遞至優選肌細胞的細胞的顆粒。已經證實這樣的賦形劑有效地將諸如反義核酸的寡核苷酸送遞至包括肌細胞在內的各種培養細胞。對于整體細胞存活率，將它們的高轉染潛力與期望的低至中等的毒性組合。結構修飾的便利可以用于允許進一步的修飾以及它們的其他(體內)核酸轉移特征和毒性的分析。Lipofectin代表脂質體轉染試劑的實例。其由兩種脂質組分組成陽離子脂質N-[1-(2，3二油酰氧基)丙基]-N，N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)(cp.D0TAP，其是甲基硫酸鹽)和中性脂質二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性組分介導細胞內釋放。另一組送遞系統是聚合納米顆粒。可以將諸如已知為DNA轉染試劑的二乙基氨基乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖的聚陽離子與氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)組合以配制陽離子納米顆粒，其可以將優選寡核苷酸的本文所定義的每種組分跨越細胞膜送遞入細胞。除了這些常見的納米顆粒材料以外，陽離子肽魚精蛋白提供了配制寡核苷酸與膠體的替代方法。這種膠態納米顆粒系統可以形成所謂的proticle，其可以通過簡單的自我組裝過程來包裝并介導寡核苷酸的細胞內釋放而制備。技術人員可以選擇并采用任何上述或其他可商購的替代賦形劑和送遞系統來包裝和送遞用于本發明的寡核苷酸從而將其送遞，用于治療人的杜興肌營養不良或貝克肌營養不良。此外，可以將寡核苷酸共價或非共價連接至靶向配體，該靶向配體經特別的設計促進吸收入細胞、細胞質和/或其細胞核。這樣的配體可以包含(i)化合物(包括但不限于肽(樣)結構)，其識別促進細胞吸收的細胞、組織或器官特異性元件，和/或(ii)化學化合物，其能夠促進吸收入細胞和/或寡核苷酸從諸如核內體或溶酶體的小泡的細胞內釋放。因此，在優選的實施方案中，將寡核苷酸配制于組合物或藥物或組合物中，并為其提供至少賦形劑和/或用于送遞的靶向配體和/或將其送遞細胞和/或增強其細胞內送遞的送遞裝置。因此，本發明還包含藥物可接受的組合物，該藥物可接受的組合物包含寡核苷酸并且還包含至少一種賦形劑和/或用于送遞的靶向配體和/或將所述寡核苷酸送遞至細胞和/或增強其細胞內送遞的送遞裝置。應當理解，如果組合物包含諸如后文所定義的輔助化合物的其他組分，則該組合物的每種組分可以不配制于一種單一的組合或組合物或制劑中。取決于它們的特性，技術人員會知道哪種類型的制劑最適合本文所定義的每種組分。在優選的實施方案中，本發明提供了包含寡核苷酸和如后文所定義的其他輔助化合物的組件試劑盒(kitofparts)形式的組合物或制劑。優選的寡核苷酸用于預防或治療個體的杜興肌營養不良(DMD)或貝克肌營養不良(BMD)。可以用本發明的寡核苷酸治療的個體可能已經診斷為患有DMD或BMD。或者，可以用本發明的寡核苷酸治療的個體可能尚未診斷為患有DMD或BMD，但是該個體可以是考慮到其遺傳背景而具有增加的發展DMD或BMD風險的個體。優選的個體是人。若需要，可以通過添加藥物可接受的載體將表達本發明反義寡核苷酸的分子或載體并入藥理活性混合物中。因此，本發明還提供了藥物組合物，該藥物組合物包含包含本發明的反義寡核苷酸的分子，或者表達本發明的反義寡核苷酸的基于病毒的載體。在另一方面，提供了包含本文所定義的寡核苷酸的組合物。優選地，所述組合物包含至少兩種不同的本文所定義的寡核苷酸。更優選地，這兩種不同的寡核苷酸經設計使一個或兩個或更多個外顯子跳躍。本發明包括多重跳躍，其中誘導外顯子44跳躍的本發明的寡核苷酸與誘導另一外顯子跳躍的另一寡核苷酸聯合使用。在該語境中，另一外顯子可以為外顯子43、45或52。多外顯子跳躍已經公開于EP1619249中。DMD基因為具有許多不同外顯子的大基因。考慮到該基因位于X染色體上，受到影響的，主要是男孩，盡管女孩也可以受該疾病的影響，因為它們可以從父母接受該基因的壞拷貝或者由于他們的肌細胞中特定偏向的X染色體失活而遭受功能性等位基因的特定偏向失活。蛋白由至少2.4Mb的多個外顯子(79)編碼。缺陷可以發生在DMD基因的任何部分。特定外顯子或特定的多個外顯子的跳躍可以常見地導致重建的mRNA，其編碼比正常肌養蛋白短但是至少具有部分功能的肌養蛋白。開發基于外顯子跳躍技術的藥物的實踐問題是，可能導致細胞中功能性肌養蛋白缺乏的眾多突變。盡管可以通過單一外顯子的跳躍來修正多個不同的突變這一事實，但是這樣的眾多突變要求對不同突變需要跳躍不同的外顯子產生一系列不同的藥物。能夠誘導兩個或更多個外顯子跳躍的寡核苷酸或包含如后文所定義的至少兩種不同寡核苷酸的組合物的優勢在于，可以用單一的藥物使多于一個外顯子跳躍。這種屬性不僅是實用的，而且對于治療許多不同DMD或特定的嚴重BMD突變而僅需要產生有限數目的藥物是非常有用的。本領域技術人員已知的另一選擇是選擇特定功能性重建的肌養蛋白，并制備能夠產生這些優選的肌養蛋白的化合物。這樣的優選的最終結果還稱為輕微表型肌養蛋白。在優選的實施方案中，所述組合物優選為藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體、佐劑、稀釋劑和/或賦形劑。還提供了這樣的藥物組合物，其可以包含任何藥物可接受的載體、填充劑、防腐劑、佐劑、增溶劑、稀釋劑和/或賦形劑。這樣的藥物可接受的載體、填充劑、防腐劑、佐劑、增溶劑、稀釋劑和/或賦形劑可以例如在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thEdition(制藥科學和實踐，第20版).Baltimore,MD=LippincottWilliams&Wilkins，2000中發現。所述組合物的每一特征都在前文中進行了定義。如果使用幾種寡核苷酸，則本文中已經定義的濃度或劑量可以指所用的全部寡核苷酸的總濃度或劑量或者所用或所添加的每種寡核苷酸的濃度或劑量。因此，在一實施方案中，提供了組合物，其中所用的每種寡核苷酸的量或寡核苷酸的總量按0.5mg/kg至10mg/kg的量劑量給藥。本發明還提供了本發明的反義寡核苷酸或表達本發明的反義寡核苷酸的基于病毒的載體在調節DMDmRNA剪接中的用途。剪接優選地于體外在人生肌細胞或肌細胞中進行調節。更優選的是，剪接于體內在人生肌細胞或肌細胞中進行調節。包含本發明的一種或多種核苷酸類似物或等同物的優選反義寡核苷酸在全身送遞時調節包括心肌細胞在內的一種或多種肌細胞中的剪接。在這一方面，包含特定核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸的全身送遞可能導致靶向肌細胞的亞群，而包含不同核苷酸類似物或等同的反義寡核苷酸可能導致靶向肌細胞的不同亞群。因此，在一實施方案中，優選地使用包含不同核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸的組合，用于調節DMDmRNA的外顯子44跳躍。本發明還提供了本發明的反義寡核苷酸或表達本發明的反義寡核苷酸的基于病毒的載體在制備用于治療DMD或BMD患者的藥物中的用途。因此，在另一方面，提供了本文所定義的寡核苷酸或組合物在制備用于預防或治療個體的杜興肌營養不良或貝克肌營養不良的藥物中的用途。所述用途的每種特征在前文進行了定義。本發明的用途或方法中的治療為至少1周，至少1個月，至少幾個月，至少1年，至少2、3、4、5、6年或更長。用于本發明的本文所定義的每種分子或寡核苷酸或其等同物可以適合于直接體內給予受DMD或BMD影響或面臨發展DMD或BMD風險的個體的細胞、組織和/或器官，并且可以直接體內、離體或體外給藥。本發明的寡核苷酸、組合物、化合物或輔助化合物的給藥頻率可以取決于幾種參數，如患者的年齡、患者的突變、分子的數量(即，劑量)、所述分子的制劑。頻率可以為兩周或4周或5周或者更長的時間內至少1次。本發明的寡核苷酸的劑量范圍優選地基于臨床試驗中的劑量漸增而設計(體內使用)，其中存在嚴格的方案要求。本文所定義的分子或寡核苷酸可用的劑量為0.lmg/kg至20mg/kg，優選為0.5mg/kg至10mg/kg。在優選的實施方案中，可以使用的本文所定義的寡核苷酸的濃度范圍為0.InM至ΙμΜ。優選地，該范圍用于諸如肌細胞或肌肉組織的細胞模型的體外用途。更優選地，所用濃度的范圍為0.3ηΜ至400ηΜ，甚至更優選為InM至200ηΜ。如果使用幾種寡核苷酸，則該濃度或劑量可以指寡核苷酸的總濃度或劑量或者所添加的每種寡核苷酸的濃度或劑量。上文給出的寡核苷酸的濃度或劑量范圍為體外或離體使用的優選濃度或劑量。技術人員應當理解，取決于所用的寡核苷酸、要治療的靶細胞、基因靶標及其表達水平、所用的培養基及轉染和孵育條件，所用的寡核苷酸的濃度或劑量還可以變化并且需要進一步優化。本發明所用的本文所定義的寡核苷酸可以適合于體內給予受DMD或BMD影響或面臨發展DMD或BMD風險的個體的細胞、組織和/或器官，并且可以體內、離體或體外給藥。所述寡核苷酸可以直接或間接給予受DMD或BMD影響或面臨發展DMD或BMD風險的個體的細胞、組織和/或器官，并且可以直接或間接體內、離體或體外給藥。由于杜興肌營養不良和貝克肌營養在不良肌細胞中具有明顯表型，所以優選地所述細胞是肌細胞，還優選地所述組織是肌肉組織和/或還優選地所述器官包含肌肉組織或由肌肉組織組成。優選的器官為心臟。優選地，所述細胞包含編碼突變體肌養蛋白的基因。優選地，所述細胞為患有DMD或BMD個體的細胞。除非另外指明，可以將本文所述的每個實施方案與本文所述的另一實施方案組合。在本文及其權利要求中，動詞“包含”及其變形以其非限制性意義使用，以表示包括該詞語之后的項，但是并不排除未特別指出的項。此外，動詞“由…組成”可以由“基本上由…組成”代替以表示本文所定義的化合物或輔助化合物除了特別指定的組分外可以包含其他組分，所述其他組分并不改變本發明的獨特特征。此外，通過不定冠詞“a(—個)”或“an(—個)”對要素的引用不排除存在多于一項要素存在的可能性，除非上下文明確地要求有且僅有一項要素。因此，不定冠詞“a(—個)”或“an(—個)”通常表示“至少一個”。當詞語“大約”或“約”當與數值聯合使用時(大約10，約10)優選地表示值可以為大于該值的10%或小于該值的的給定值。本文所用的表述“體內”可以表示，在可以分離自細胞所來源的有機體的細胞體系中。優選的細胞為肌細胞。體內還可以表示在組織中或在多細胞有機體中，該多細胞有機體優選為本文所定義的患者。在本發明中，體內與通常與無細胞體系相關的體外相反。本說明書所引用的全部專利和文獻通過引用特此整體并入本文。除非另外指明，可以將本文所指的每個實施方案組合在一起。在下文的實施例中將進一步解釋本發明。這些實施例并不限制本發明的范圍，而是僅僅用于闡明本發明。附例圖1.在來自健康對照或具有外顯子45缺失的DMD患者的轉染的肌細胞中，經設計誘導來自DMD基因的外顯子44跳躍的AON的評價。(A)在來自具有外顯子45缺失的患者分化的肌細胞(肌管)中，所有測試(轉染)的AON以150nM的濃度誘導了外顯子44跳躍，并且PS188(SEQIDNO:5)、PS190(以前公開%h44A0N2；Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)、PS191(SEQIDNO47)、PS193(SEQIDNO48)、PS194(SEQIDNO46)和PS196(SEQIDNO51)證明了最高的效率(84%-94%)0(B)還通過以150nM和400nM轉染至健康人對照細胞來測試大部分Α0Ν。結果總結于該柱狀圖中。PS188(SEQIDNO:5)、PS190、PS191(SEQIDNO:47)、PS193(SEQIDNO:48)、PS194(SEQIDNO46)和PS196(SEQIDNO51)被證實在誘導外顯子44跳躍中最有效。注意，患者細胞中外顯子44跳躍水平通常高于對照細胞，因為以下事實與健康細胞相比，在患者細胞中，外顯子44跳躍是讀框恢復的并且更具功能性且穩定。在所有實驗中，在未轉染的肌細胞中沒有觀察到外顯子44跳躍(數據未顯示)。(C)在對照肌細胞中，以150nM和400nM的轉染濃度類似地測試了PS197(SEQIDNO52)以及3個另外的AON即PS199(SEQIDNO44)、PS200(SEQIDNO49)和PS201(SEQIDNO50)的實施例。外顯子44跳躍百分比為1%(PS199)M44%(PS200)。M:DNA大小標記(IOObp梯)。圖2.通過轉染人對照肌細胞或外周血單核細胞(PB-MNC)進行的PS188(SEQIDNO5)其他評價。(A)劑量應答實驗。在人對照肌細胞中，在從50nM增加至400nM的轉染劑量，PS188表現出水平漸增的外顯子44跳躍(一式3份)，在400ηΜ時高達45%。(B)用200nMPS188轉染健康個體的PB-MNC。盡管肌養蛋白在該類型的細胞中僅以低水平表達這一事實，但是仍然明顯地觀察到了外顯子44跳躍。這些結果證實了PS188誘導來自DMD基因的外顯子44跳躍的效率。M=DNA大小標記。圖3.通過向表達全長人DMD基因的轉基因hDMD小鼠和廣泛的毒性研究中所包括的獼猴(cynomolgusmonkey)給藥而進行的PS188(SEQIDNO5)的其他評價。(A)向hDMD小鼠的腓腸肌(Gl和G2)肌肉內注射2x40gPS188后，觀察到外顯子44跳躍，盡管是低水平的。這證實PS188在肌肉組織中體內誘導人外顯子44跳躍的能力。鑒于這樣的事實，即與營養不良肌纖維相比，該小鼠模型已經具有通常表現出較低水平的AON吸收的健康肌纖維，所以低水平是預期的。NT在未處理的hDMD肌肉中，未觀察到外顯子44跳躍。M:DNA大小標記。(B)在PS188的毒性試驗所包括的猴中，以6mg/kgPS188的劑量水平進行每4天1小時、持續29天的靜脈內輸注后，在外周血單核細胞(PB-MNC)中觀察到外顯子44跳躍。在未處理的猴中(NT)，未觀察到外顯子44跳躍。M=DNA大小標記。實施例實施例1材料與方法AON設計(部分地)基于靶外顯子RNA的重疊開放二級結構，這是通過m-倍程序(m-foldprogram,Mathewsetal.，JMolBiol1999；288(5):911_40)預測的；(部分)地基于重疊推定SR-蛋白結合位點，這是通過ESE-發現軟件(ESE-Findersoftware,rulai.cshl.edu/tools/ESE/)(Cartegnietal.,NucleicAcidsRes2003；31(13):3568_71)預測的；以及基于避免3個或更多個核苷酸或CpG對的G段(G-stretch)。Α0Ν(參見表1)由Eurogentec(Belgium)禾口ProsensaTherapeuticsBV(Leiden,Netherlands)合成，并且含有2’-0-甲基RNA和全長硫代磷酸酯主鏈。組織培養、轉染和RT-PCR分析如以前所述(Aartsma-Rusetal.HumMolGenet2003;12(8)907-14；Havengaetal.JVirol2002；76(9):4612_20)，處理來自健康個體(“人對照”)或具有外顯子45缺失的DMD患者的肌管培養物。為了篩查Α0Ν，用150nM和/或400nM的每種AON轉染肌管培養物。使用轉染試劑聚乙烯亞胺(PEI，ExGen500MBIFermentas)或衍生物(UNIFectylin，ProsensaTherapeuticsBV，Netherlands)，并且每克AON2μ1ExGen500或UNIFectylin0將具有熒光標記的對照AON用于證實最優的轉染效率(通常獲得超過90%的熒光核)。如所述(Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)，轉染后24至48小時分離RNA。利用位于外顯子44側翼的外顯子中的引物，通過巢式RT-PCR分析來測定外顯子跳躍效率(Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)。利用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN)，從瓊脂糖凝膠分離PCR片段，利用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試齊[J盒(ΡΕAppliedBiosystems)禾口ABI3700測序儀(ΡΕAppliedBiosystems)，進行序列驗證(由Leiden基因組技術中心(LGTC))。對于定量，利用DNAIOOOLabChips試劑盒在Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies,USA)上分析PCR產物。結果設計了一系列靶向外顯子44中的序列的Α0Ν，并通過轉染和隨后的分離的RNA的RT-PCR及序列分析在健康對照和患者來源的肌管培養物中進行測試。在源自具有外顯子45缺失的DMD患者的肌管中，對于每個A0N(PS187至PS201)，以150nM誘導特異性外顯子44跳躍，并且PS188(SEQIDNO5)、PS190(以前公開為h44A0N2，Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)、PS191(SEQIDNO:47)、PS193(SEQIDNO:48)、PS194(SEQIDNO:46)和PS196(SEQIDNO:51)證明了最高水平的跳躍(在150nM時，84%至94%)(圖1A)。在來自健康個體的對照細胞中進行類似的轉染。評價了外顯子44跳躍的百分比，并與患者細胞培養物進行比較(圖1B)。對照百分比通常低于患者細胞的百分比，這是外顯子44跳躍后對照轉錄本無義介導的RNA衰變(decay)所固有的(參見，例如圖1A(患者細胞)比圖IC(對照細胞)的PS197結果)。在對照肌細胞中，以150nM和400nM的濃度，測試了三個其他的A0N(PS199(SEQIDNO44)、PS200(SEQIDNO49)和PS201(SEQIDNO50)。外顯子44跳躍百分比的范圍為1%(PS199)至44%(PS200)(圖1C)。基于所有的轉染實驗，AONPS187、PS188、PS190、PS191、PS192、PS193、PS194、PS196和PS200被認為是最有效的，并且AONPS189,PS197、PS198、PS199和PS201是效率最低的。在劑量應答實驗中，通過應用一式三份從50nM至400nM的漸增劑量，還在健康人對照肌細胞中測試了PS188(SEQIDNO5)。因此，觀察到水平漸增的外顯子44跳躍，在400nMPS188時高達45%(圖2A)。實施例2材料與方法將收集于EDTA管中的新鮮健康人對照血液樣品在HistoPaque梯度介質(HistoPaquegradient)頂部分層。一旦離心，則收集含有單核細胞的第二層(從頂部到底部，4層)，將其洗滌并再次離心。將細胞團重懸浮于增殖培養基中，并進行計數。在6孔板中，每孔接種SxlO6個細胞，并在37°C、5%CO2的條件下孵育3hr(小時)。然后將細胞用0或200nMPS188(SEQIDNO5；2'OMePSRNA；ProsensaTherapeuticsBV)轉染，每盤兩份。轉染后72hr分離RNA，并利用位于外顯子44側翼的DMD-基因特異性引物(Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)，通過RT-PCR分析進行分析。序列分析(由Leiden基因組技術中心(LGTC))，禾Ij用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試劑盒(ΡΕAppliedBiosystems)禾口ABI3700測序儀(ΡΕAppliedBiosystems)針對分離的PCR產物(利用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN))進行，以確認RNA水平的特異性外顯子44跳躍。結果在來自健康對照個體的轉染的外周血單核細胞(PB-MNC)中，當以200nM應用時，PS188誘導新的較短的轉錄本片段產生(圖2B)。將該片段分離并測序，并且由于外顯子44的特異性跳躍而得以證實。在非轉染的PB-MNC中，未觀察到外顯子44跳躍。這些結果表明，PS188是有效的體外誘導人外顯子44跳躍的化合物。實施例3材料與方法反義寡核糖核苷酸(AON)將正常和mdx小鼠(Sicinskietal.(1989)·Science244:1578_1580)注射小鼠特異性m46A0N4(vanDeutekometal.(2001)HumMolGenet101547-1554)，而將hDMD小鼠注射人特異性PS196(SEQIDNO51)或PS188(SEQIDNO5)。兩種AON都含有全長硫代磷酸酯主鏈和2，-0-甲基修飾的核糖分子(PS196=Eurogentec,Belgium；PS188=ProsensaTherapeuticsBV)。正常、mdx和轉基因hDMD小鼠正常小鼠(C57Bl/6NCrL)和mdx小鼠(C57Bl/10ScSn_mdx/J)獲得自CharlesRiverLaboratories(TheNetherlands)。轉基因hDMD小鼠在我們自己的LUMC實驗室進行改造。簡言之，通過與帶有含有全長(2.4Mb)人DMD基因的2.7Mb的YAC的酵母原生質球融合，對胚胎干細胞(ES)進行遺傳修飾。該YAC以前通過酵母中較小的重疊YAC的同源重組來構建(DenDunnenetal.(1992).HumMolGenet119-28)如通過PFGE定位、全基因的外顯子-PCR分析和中期FISH分析所評價的，ES細胞表現出整合了一個拷貝的全尺寸YAC，將該ES細胞用于產生純合hDMD小鼠(，tHoenetal.，J.Biol.Chem.2008)。轉基因hDMD小鼠看起來身體上未受遺傳修飾影響。可以在肌肉中，在RNA和蛋白水平上，證實人DMD基因的合適表達。這些小鼠的改造獲得DutchMinistryofAgriculture(LNV)；projectnr.VVA/BD01.284(E21)的許可。AON的給藥小鼠的肌肉內AON注射實驗由Leiden大學醫學系(MedicalFacultyofLeidenUniversity)的動物實驗委員會(UDEC)許可(項目號00095，03027)。根據生產商的說明書，注射Α0Ν，該AON為純Α0Ν，或與陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI；ExGen500(20χ),MBIFermentas)以ImlPEI每nmolAON的比率，在5%w/v葡萄糖溶液中復合，或者與15nmolSAINT-18TM(SynvoluxTherapeuticsB.V.,TheNetherlands)復合。SAINT-18TM送遞系統基于陽離子吡啶鐺頭基團，并且允許反義寡核苷酸的無毒送遞。通過腹膜內注身寸11(ν/ν)的Hypnorm/Dormicum溶液(JanssenPharmaceutica,Belgium/Roche,TheNetherlands)，將小鼠麻醉。以40μ1的最終注射體積，利用帶有22號針的Hamilton注射器，將純A0N(PS188)給予至小鼠的兩塊腓腸肌中。小鼠以24h的間隔接受兩次40μ1注射。在注射后不同的時間點將它們處死，對于注射PS188的hDMD小鼠，為最后注射后10天。將肌肉分離并冷凍于液氮冷卻的2-甲基丁烷中。RT-PCR分析將肌肉樣品在RNA-Bee溶液(CamproScientific,TheNetherlands)中勻質化。根據生產商的說明書，分離并純化總RNA。對于使用逆轉錄酶C.therm聚合酶(thermpolymerase)或Transcriptor(RocheDiagnostics,TheNetherlands)的cDNA合成，將300ng的RNA用于20μ1的反應中，并且在60°C保持30min，該反應使用小鼠或人特異性引物逆轉錄。第一PCR使用外部引物對(對于注射PS188的小鼠，側翼外顯子43-45)，反應條件為94°C(40sec(秒))、60°C(40sec)和72°C(60sec)，20個循環。然后，利用在直接位于靶外顯子(對于注射PS188的小鼠，外顯子44)側翼的外顯子中的巢式引物組合，再次擴增1μ1該反應物(110稀釋)，反應條件為940C(40sec),60°C(40sec)和72°C(60sec)，30個循環。在2%瓊脂糖凝膠上分析PCR產物。利用DNAIOOOLabChip⑧試劑盒和Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies,TheNetherlands)，通過定量PCR產物來測定跳躍效率。引物對和序列以前已有描述(Aartsma-Rusetal.(2002)NeuromusculDisord12Suppl:S71.8,17；vanDeutekometal.(2001)HumMolGenet101547-1554)序列分析利用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN)，從2%瓊脂糖凝膠分離RT-PCR產物。由Leiden基因組技術中心(LGTC)，利用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試劑盒(ΡΕAppliedBiosystems)，直接進行DNA測序，并在ABI3700測序儀(PEAppliedBiosystems)上進行分析。MALDI-T0F質譜按照生產商的說明書，利用核酸純化試劑盒(SequazymeTMPinpointSNP試劑盒的核酸純化試劑盒，AppliedBiosystems)，用96孔離心板(spinplate)(AppliedBiosystems)，純化RNA-Bee肌肉勻漿。將Iml等份的基質溶液(50%乙腈中的50mg/ml3-羥基吡啶甲酸和25mM檸檬酸二銨)應用于AnchorChipTM樣品靶標(BrukerDaltonics,Germany)，并空氣干燥。以0.5ml等份將樣品點至基質晶體上，并空氣干燥。在ReflexIIIMALDI-T0F質譜儀(BrukerDaltonics,Germany)進行質量測定。以反射模式獲得光譜并積累約900激光發射。分析標記和未標記的m46A0N4樣品，用于比較。結果野生型肌肉中的外顯子跳躍我們首先建立小鼠肌肉中的體內靶向的外顯子跳躍，并優化不同的給藥參數。初始實驗在野生型小鼠中進行，而無義介導的RNA衰變會導致低估外顯子跳躍效率，AON的效果僅在mRNA水平進行監測。我們注射了0.9nmol至5.4nmol的劑量漸增的每種反義寡核苷酸。總肌肉RNA的RT-PCR分析證明，在所有注射的樣品中出現了新的較短的轉錄本片段。序列分析證實了該產物中精確的外顯子44跳躍(數據未顯示)。分析了對側注射的肌肉的橫切片的熒光標記的對照AON的分散和持續性。注射純AON后，我們在某些纖維內觀察到高達一周的熒光信號。在較晚的時間點，只觀察到弱信號，并且主要在胞間隙中。甚至在3周后，PEI的使用明顯地增強了熒光信號的分散和持續性。然而，其還誘導吸收大部分熒光的纖維降解和單核細胞滲入。利用SAINT，在胞間隙(interstitialspace)中檢測到高達1周的大部分信號，這表明該試劑不有效地將AON送遞入肌纖維中。由于熒光信號可以不對應于完整且功能性AON的存在，所以我們進行了注射的肌肉樣品的MALDI-T0F質譜。分析表明，在24小時內從AON除去了熒光標記。當使用PEI時，標記的AON僅在2周內是可檢測的。間質AON可能比細胞內AON對降解更敏感。在全部3個系列中，在注射后3至4周觀察到未標記的Α0Ν，但是當存在于細胞內時，即在PEI系列中，該AON可以只是功能性的。hDMD肌肉中人特異性外顯子跳躍由于外顯子跳躍策略是序列特異性的治療方法，所以理想的臨床前驗證應當為小鼠實驗背景中的靶人DMD基因。我們改造了這樣的轉基因“人化”DMD(hDMD)小鼠，其帶有整合和功能性的全長人DMD基因的拷貝。hDMD小鼠肌肉中人肌養蛋白的表達通過橫切片的免疫組織化學分析，利用人特異性抗體(MANDYS106)來特異性地檢測。在肌肉RNA水平，利用小鼠或人特異性引物的RT-PCR證明了人DMD基因的正確轉錄。而且，一旦與mdx小鼠雜交，則hDMD構建體表現為補償應營養不良缺陷，這如通過組織學和cDNA微陣列分析所評價的(，tHoenetal.,J.Biol.Chem.2008)0hDMD小鼠具有健康的肌纖維，該肌纖維通常表現出有限的裸AON的吸收。將與PEI復合的人特異性AONPS196(SEQIDNO51)，或無PEI的PS188(SEQIDNO5)注射到hDMD小鼠的腓腸肌中(24hr內注射2x40μg)。在注射后7至10天，我們清楚地觀察到來自人DMD轉錄本的靶向的外顯子44的跳躍(圖3A)。盡管人特異性AON與相應的小鼠序列是高度同源的，各自的20-mer中只有2或3個錯配，但是小鼠內源轉錄本的所受的影響并沒有達到任何可檢測的水平。序列分析證實PS188誘導了外顯子44跳躍。在未處理的hDMD肌肉中，沒有觀察到外顯子44跳躍。這些結果表明，PS188是誘導肌肉組織中人外顯子跳躍的有效化合物。實施例4材料與方法作為PS188的廣泛毒性項目的一部分，每4天通過1小時靜脈內輸注(5mL/kg/h)處理非禁食的獼猴，持續29天，劑量水平為6mg/kgPS188(SEQIDNO5;2，OMePSRNA；AgilentLifeSciences，USA)。在每個處理天(第1、5、9、13、17、21、25和29測試天)，且在開始給藥前不久(盡可能的在給藥前，最多在給藥開始前1小時內)，新鮮地制備PS188制劑。制劑通過將PS188溶于磷酸鹽緩沖液來制備；如藥品的分析證書所提供的，考慮純度和水含量。按照每只動物目前的體重，調整PS188的量。最后給藥(第33天)后96小時，將動物處死。將全血樣品收集于EDTA管中，并(室溫下過夜運輸后)在HiStoPaque梯度介質的頂部分層。一旦離心，收集含有單核細胞的第二層(從頂部到底部，4層)，將其洗滌并再次離心。從所得的細胞團分離RNA，并利用位于外顯子44側翼的DMD基因特異性引物(Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)，通過RT-PCR分析進行分析。序列分析(由Leiden基因組技術中心(LGTC))，利用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試齊[J盒(ΡΕAppliedBiosystems)禾口ABI3700測序儀(ΡΕAppliedBiosystems)，針對分離的PCR產物(利用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN))進行，以確認RNA水平上的特異性外顯子44跳躍。結果在每4天以6mg/kgPS188的劑量水平通過1小時靜脈內輸注處理29天的猴中，于外周血單核細胞(圖3B)中，觀察到外顯子44跳躍，盡管事實是，這些細胞僅表達低水平的肌養蛋白。實際上，PS188所靶向的人和猴DMD序列是100%相同的。在未處理的猴中沒有觀察到外顯子44跳躍。這些結果表明，PS188是體內誘導外顯子44跳躍的有效化合物。表1反義寡核苷酸序列表IA權利要求1.核酸分子，其與具有核苷酸序列5’-GUGGCUAACAGAAGCU(SEQIDNO1)的核苷酸結合和/或互補。2.如權利要求1所述的分子，其中所述分子包含反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸包含8至60個核苷酸或由8至60個核苷酸組成。3.如權利要求2所述的分子，其中所述反義寡核苷酸包含以下序列或由以下序列組成SEQIDNO5至SEQIDNO:42、SEQIDNO49或SEQIDNO:54。4.如權利要求3所述的分子，其中所述分子包含核苷酸序列SEQIDNO:5或由核苷酸序列SEQIDNO5組成。5.如權利要求1-4中任一項權利要求所述的分子，包含2’-0烷基硫代磷酸酯反義寡核苷酸。6.如權利要求5所述的分子，其中所述分子包含2’-0甲基硫代磷酸酯核糖。7.基于病毒的載體，包含PolIII啟動子驅動的表達盒，用于表達權利要求1-6中任一項權利要求所定義的分子，優選地，所述分子與所述核苷酸序列5’-GUGGCUAACAGAAGCU(SEQIDNO1)結合和/或互補。8.藥物組合物，包含權利要求1-6中任一項權利要求所定義的分子或權利要求7所述的載體和藥物可接受的載體。9.權利要求1-6中任一項權利要求所定義的分子或權利要求7所述的載體在調節DMD前mRNA剪接中的用途。10.權利要求1-6中任一項權利要求所定義的分子或權利要求7所述的載體在制備用于治療DMD或BMD患者的藥物中的用途。11.用于誘導細胞中DMD基因的外顯子44跳躍的方法，所述方法包括為所述細胞提供權利要求1-6中任一項權利要求所定義的分子或權利要求7所述的載體。全文摘要本發明涉及與具有5′-GUGGCUAACAGAAGCU(SEQIDNO1)序列的核苷酸分子結合和/或互補的核酸分子，以及該分子在誘導DMD患者的DMD基因外顯子44跳躍的方法中的用途。文檔編號C12N15/113GK102171342SQ200980124158公開日2011年8月31日申請日期2009年5月14日優先權日2008年5月14日發明者勒德烏斯·約翰尼斯·普拉滕伯格,安妮姆耶克·阿斯馬-魯斯,朱迪思·克里斯蒂娜·塞奧多拉·萬多伊特科姆,蓋瑞特-揚·保德維金·萬歐門,約瑟夫斯·約翰尼斯·德吉姆彼申請人:普羅森那技術公司,萊頓教學醫院