專利名稱：用于治療瘺的自體和異體脂肪來源的基質干細胞組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生產用于治療瘺的臨床有效量的人脂肪組織來源的基質干細胞的方法，以及由該方法制備的組合物，其中，基質干細胞可獲自自體和異體脂肪組織。
背景技術：
再生醫學是指治療損傷組織或功能惡化的組織和/或器官的方法，通常涉及利用多能干細胞的細胞療法。骨髓來源的干細胞，為用于再生醫學的成體干細胞主要類型中的一種，可在體外增殖并分化成各種細胞類型，包括例如肌細胞、心肌細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等。此外，骨髓來源的干細胞具有免疫調節活性，因而可用于異體骨髓移植或用作自身免疫病的免疫抑制劑。由于脂肪組織也含有大量的干細胞，目前已經開展了大量的脂肪干細胞作為移植物的的應用研究。與其它種類的組織相比，脂肪組織含有相當大量的干細胞(即分離自脂肪組織的干細胞是分離自相同量的骨髓的約1，000倍)，并且脂肪來源的干細胞像骨髓來源的干細胞一樣，是多能的，可分化成軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等。此外，脂肪來源的基質干細胞表現出與骨髓來源的干細胞類似的細胞表面標志的表達，并且具有體內和體外的自體或異體免疫反應的免疫調節活性。瘺是體內不正常產生的通道，并且可在體內的各個位置由不同原因產生。最經常發生的瘺通常存在于腸系統中，包括肛門和直腸。肛門瘺通常由炎癥性疾病引起，其中炎癥發生在肛門腺，傳播到皮膚外部，滲出分泌物，如膿液，是約20%的肛門痔瘡的發病原因。肛門瘺實質上是指直腸道和肛周皮膚之間的不正常通道，并且誘發糞便通過開放位點而不是肛門的不正常排泄。這主要是由于發生肛門直腸膿腫，其反過來形成分泌膿液的瘺。這種形成的瘺被稱為‘肛瘺’。也即，肛瘺是肛門直腸膿腫爆發時，形成于直腸或肛管內部至肛周皮膚的細長孔。肛瘺還可分為下述與在肛門性能中發揮重要作用的外肛門括約肌有關的4類(1)內括約肌肛瘺，其具有形成于內肛門括約肌和外肛門括約肌之間的瘺束；(2)經括約肌肛瘺，其具有穿透外括約肌的瘺束；(3)括約肌上肛瘺，其具有形成于外括約肌上部的瘺束；和(4)括約肌外肛瘺，其具有在直腸附近肛門腺窩上部而不是肛門腺窩本身形成的原發性瘺束。通常已知引起肛瘺的主要原因是肛周腺體的感染，此外，有時肛瘺的發生是由于肺結核、克羅恩氏病、癌癥、白血病、白細胞減少癥等引起。克羅恩氏病的特征是慢性的和復發性的腸道炎癥，并被定為罕見病。由克羅恩氏病引起的瘺可包括，如與陰道相連的直腸-陰道瘺、腸道附近形成的腸道瘺等，以及以上所述的肛瘺。大部分的瘺可通過外科手術進行治療。治療肛周和直腸內的瘺的重要目的在于徹底治療疾病同時保留肛門括約肌的正常功能。然而，外科手術后瘺通常會復發，并可導致如肛門功能紊亂引起的大便失禁等。因此，目前手術的方法不能提供滿意的治療效果。
3
瘺手術可包括，如瘺切開術、泄液線、應用推進皮瓣(advanced flap)、肌肉加注法 (muscle filling procedure)、應用纖維蛋白膠等。這些中，纖維蛋白膠已在一般的手術中被用作外科手術密封劑，通過混合纖維蛋白原和凝血酶而形成纖維蛋白凝塊。對于肛瘺，通過外部開口將纖維蛋白膠注入到瘺束中，從而填滿瘺束以及肛瘺的內部開口。最近幾年中，隨著與干細胞有關的研究的廣泛開展，已經開展了通過移植干細胞到瘺位置治療肛瘺的方法。例如，Mizuno 等人(Plast. Reconstr. Surg. 2002，109 :199-209) 證實了分離自脂肪組織的成體干細胞可分化成肌肉細胞，而Damian等人(Dis Colon Rectum 2005,48 :1416-1423)在臨床試驗的第I階段，證實了脂肪干細胞可安全地應用于治療患有克羅恩氏病的患者的肛瘺。此外，據報道，當患有克羅恩氏病的患者進行成體干細胞移植以治療直腸肛瘺時，即使在移植3個月后也沒有發生大便失禁。已知體外培養脂肪來源的基質干細胞是易于實現的。然而，為獲得臨床有效量的細胞，通常需要相對較大數量的脂肪組織和較長期的培養階段。特別是，治療患有慢性的和 /或復發性的疾病，如克羅恩氏病患者的瘺，需要大量的細胞以及改良的細胞培養方法。此外，如果允許使用異體脂肪來源的基質細胞，那它們在臨床上是非常有用的。WO 2006/136244(2006年12月觀日)公開了應用脂肪來源的基質干細胞的瘺治療及其應用。然而，由于治療中所用的脂肪干細胞獲自患者本身，如果患者沒有足夠的脂肪組織、脂肪組織中所含的干細胞的數量相當低、或者不能培養自體干細胞，那么就有可能無法提供臨床適合的治療。特別是，在患有克羅恩氏瘺的患者的情況下，會遇到重大的腸道炎癥，引起患者的體重減輕以及體質指數的降低。對于這種病人，就很難保證足夠量的脂肪來源的基質干細胞。此外，由于疾病持續了很長時間并惡化，通常引起人體中多個瘺的發生， 而且瘺的尺寸也會相對增加，就需要大量的干細胞來治療患者。同時，對于體外培養脂肪來源的基質細胞，當實施現有專利(W0 2007/011797、US 6，777，231 等)或發表的文獻((組織工程學)Tissue Engineering 7 (2)，211—228，2001 等)中所公開的標準細胞培養方法時，體外培養細胞需要較長的時間，使得難以獲得臨床有效量的細胞。因此，會降低臨床應用中的實際效率。盡管還不知道確切的理由，脂肪干細胞的增殖率因個體不同而有差異，并且由于脂肪干細胞在體外培養中不能活躍增殖而使細胞培養經常失敗。此外，脂肪干細胞的生物學功能，包括如多能型、免疫調節活性等可根據其供體不同而有差異。因此，應用具臨床有效特征的異體脂肪干細胞可改善治療瘺的效果。技術問題因此，本發明涉及在瘺治療中的分離自人脂肪組織的基質干細胞的應用，本發明的一個目的在于提供生產臨床有效量的基質干細胞的改良方法，以及用前述方法生產的脂肪干細胞組合物。技術方案為實現上述目的，本發明提供用于治療瘺的脂肪干細胞組合物，其含有異體脂肪組織來源的基質干細胞。為實現上述的另一個目的，本發明提供制備含有脂肪來源的基質干細胞的脂肪干細胞組合物的方法，該方法包括如下步驟(a)從目標體(subject)中收集脂肪組織；(b)從脂肪組織中分離基質血管成分(‘SVF’ )；
(c)在基質培養中培養SVF ；(d)在含有作為生長因子的EGF或bFGF的擴增培養基中培養SVF，以培養脂肪來源的基質干細胞；和(e)培養脂肪來源的基質干細胞至少一代(passage)。根據本發明，還提供由上述方法制備的脂肪干細胞組合物，以及治療瘺的方法，該方法包括給瘺患者施用前述組合物的步驟。本發明大體上涉及生產用于治療瘺的臨床有效量的人脂肪組織來源的基質干細胞的方法，以及由該方法制備的組合物。移植中所用的脂肪來源的基質細胞可分離自自體和/或異體脂肪組織。更具體地，根據本發明，在治療中可應用異體脂肪來源的基質細胞而不用從目標患者中分離脂肪組織，并且可選擇具有更加優異的治療效果的脂肪干細胞，從而具備臨床適用性。此外，對于分離自自體或異體脂肪組織的基質血管成分(下文中，通常被稱為 iSVF')的培養，本發明可適當地應用基質培養基和擴增培養基來進行培養，從而在短時間內有效生產出臨床有效量的基質干細胞。更具體地，本發明可利用含特定生長因子，如堿性成纖維細胞生長因子(下文中，被稱為‘bFGF’ )或表皮生長因子(下文中，被稱為‘EGF’ ) 的擴增培養基，從而顯著地減少干細胞的培養時間和易于控制干細胞因個體而不同的生長速率。此外，由本發明方法生產的脂肪干細胞與現有的細胞培養方法生產的干細胞相比，表現出優異的分化速率和免疫調節活性。如果通過抽脂從患者中分離而提供大量脂肪組織，可純化和使用該脂肪來源的干細胞。然而，在多數情況下，為獲得足量的用于移植的脂肪來源的干細胞，需要有增殖階段。 即，在計算抽脂獲得的脂肪組織的量、分離自脂肪組織的脂肪組織來源的基質干細胞的數目和移植所需的細胞的數目后，應該進行細胞的培養和繼代培養以獲得臨床有效量的干細胞。為進行異體移植，可進行繼代培養以充分去除一系列可誘發免疫反應的細胞，如免疫細胞、成纖維細胞等，以生產同質的基質干細胞群。優選地，應該進行至少一次繼代培養。在本申請中，“基質培養基”是指用于培養SVF的培養基，可通過添加10% FBS和抗生素至適合的細胞培養基，如DMEM或DMEM/F12中而制備。另一方面，“擴增培養基”
是指用于增殖脂肪來源的干細胞的培養基，并可在基質培養基中額外含有bFGF或EGF。與常規培養方法(W0 2007/011797)所需的約72 120小時的平均倍增時間相比，根據本發明的培養方法，脂肪來源的干細胞的平均倍增時間為約48小時，從而達到顯著增加的效果。如
圖1所示，在本發明的設定的培養條件下，每個傳代中的平均培養時間為4天，而常規方法的每個傳代的平均培養時間為7天，因此本發明顯著減少了細胞生產的時間，即生產足量細胞數所需的時間。例如，為利用50ml提供的脂肪抽吸細胞 (Iipoaspirate)獲得1 X IO8脂肪干細胞，現有的培養方法需要至少30天。相比之下，當提供的脂肪干細胞培養于本發明的在常規基質培養基中含有bFGF或EGF的擴增培養基中時， 可在約15天內獲得預期的產物。根據另一個實施例，如果提供的脂肪干細胞少于50ml，現有的培養方法難以生產臨床有效量的脂肪干細胞，然而本發明提供改良的培養方法以克服這種困難。對于培養基質干細胞，不同供體的脂肪組織其倍增時間有很大不同，然而，本發明可最小化因供體個體差異而導致的培養時間差異。因此，本發明的細胞培養方法可適于確保用于治療瘺的臨床有效量的細胞。通常，已知隨著體外培養世代數的增加，干細胞的多能性降低。因此，需要能維持所需的干細胞多能性的培養方法。與現有的培養方法相比，當使用本發明的培養方法時，干細胞表現出優異的分化成肌細胞、骨細胞等的多能性。此外，本發明獲得的脂肪來源的基質干細胞順利地保留固有的多能性和免疫調節活性，甚至表現出更優異的效果。即，根據本發明，如果干細胞培養于含有bFGF或EGF的擴增培養基中，作為干細胞固有特性的多能性和免疫調節活性能更好地被維持，因而獲得優異的臨床效果。已知脂肪來源的基質干細胞不誘發對異體細胞的免疫反應，但具有免疫調節活性以抑制誘發的免疫反應。本發明提出異體脂肪干細胞可用于瘺的治療。例如，當在活化克羅恩氏病患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell)的條件下加入脂肪干細胞時，免疫反應可被抑制(或被控制)。這種情況下，異體干細胞基本上具有與自體干細胞相同或優于自體干細胞的功能。因此，自體脂肪干細胞可有效地用于治療克羅恩氏病引起的瘺或其它類型的瘺。本發明中用于移植的基質干細胞可通過培養1 10個傳代制備，并且優選這種干細胞的 50%，更優選 80%)^CD10、C13、CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105 和 Oct 4 呈陽性，對0034、0045、00104、00106 和 Mro-I 呈陰性。從下述的詳細描述中可更清楚的知曉本發明的細節。在本申請上下文中，“基質血管成分(SVF) ”是指分離自脂肪組織的細胞，是指脂肪組織用膠原酶處理和離心去除大多數成熟脂肪細胞后剩下的細胞群。“脂肪來源的基質干細胞”是指獲自SVF的間充質干細胞，且還可被稱為“脂肪來源的干細胞(ASC) ”、“脂肪來源的成體干細胞(ADAS)”、“脂肪干細胞”等。本申請所用的“瘺”是指體內產生的不正常通道。這種瘺的實例包括肛瘺、肛門直腸瘺、直腸陰道瘺、膀胱瘺、腸道瘺、糞瘺等，但不具體限于此。“異體移植”是指移植同一物種的其它或另一個體的特定組織、器官或細胞，更具體地，在自體組織、器官或細胞不能使用的情況下，移植另一個人或其它動物的特定組織、 器官或細胞。本發明主要包括從自體或異體脂肪組織中收集SVF，并培養來自于SVF的脂肪來源的基質干細胞，而這一方法已經有報道。本發明通過改良美國專利No. 6，777，231中提出的常規方法，提出用于治療瘺的臨床有效量的細胞的生產方法。更具體地，美國專利 No. 6，777，231公開的方法包括使用膠原酶處理抽脂獲得的脂肪組織并制備SVF、培養所獲得的細胞群，即在含有10%牛血清的由DMEM或DMEM/F12(達爾伯克氏改良伊格爾培養基 /漢姆F-12營養培養基)組成的基質培養基中的SVF，培養孵育的細胞至少一個傳代直到它們生長至覆蓋培養皿的80% 90%。另一方面，本發明包括在基質培養基中孵育SVF 24小時，然后，將孵育的細胞轉接至還含有bFGF或EGF及基質培養基的擴增培養基中。根據本發明，可通過往基質培養基中添加0. 1 lOOng/ml，優選1 lOng/ml的bFGF或EGF 制備擴增培養基，從而增加了細胞分化速率，并維持多能性和免疫調節活性。因此，本發明提供改良的細胞生產方法。本發明中的脂肪來源的基質干細胞可通過抽脂或手術切除從人皮下脂肪組織中獲得，但不具體限于此。
假如細胞培養的基本培養基沒有特別限定為下面的描述，本發明中用于移植的自體或異體脂肪來源的基質干細胞可根據下述的方法獲得。(1)從抽脂獲得的脂肪組織中分離SVF。用KRB溶液洗滌并用膠原酶處理脂肪組織后，繼續進行離心。去除上層液體，往下層加入生理上適合的鹽水溶液(如磷酸緩沖液)形成懸浮液。接下來，進行離心，恢復成含有SVF的下層。(2)在基質培養基中孵育SVF。用基質培養基中懸浮SVF后，將濃度為10，000 40，000個細胞/cm2的懸浮液接種到培養皿中，并在那進行培養。基質培養基為含有10%牛血清的由DMEM或DMEM/F12(達爾伯克氏改良伊格爾培養基/漢姆F-12營養培養基)組成的培養基，并用于培養SVF 24 小時。(3)在擴增培養基中進行孵育去除基質培養基后，加入擴增培養基用于增殖粘附(或凝集)的細胞。擴增培養基含有10%牛血清和0. 1 100ng/ml的EGF或0. 1 100ng/ml的bFGF的DMEM或DMEM/ F12，其作用為加速脂肪來源的(粘附或凝集的)基質干細胞的增殖，從而在短時間內顯著增加細胞的數量。(4)繼代培養當細胞充滿80 90%的培養皿底部時，去除擴增培養基，用胰蛋白酶進行處理從培養皿中收獲細胞。為了繼代培養，細胞應當以1 3 1 4的比例進行稀釋，然后在新的培養皿中用擴增培養基進行培養。通過如上所述的步驟，可進行進一步的繼代培養。(5)確認免疫調節活性由于異體脂肪來源的基質干細胞根據其種類(個體)的不同而具有不同的免疫調節活性，因此在觀察和鑒定獲自至少一代繼代培養的脂肪來源的基質干細胞的免疫調節活性后，可選擇和使用具有優異免疫調節活性的異體脂肪來源的基質細胞，從而實現比自體細胞更優良的臨床效果。附圖簡述通過下述的詳細說明以及所附附圖，將能更加清楚地知曉本發明的上述和其它目的、特征和其它優點，其中圖1所示為基質培養基或擴增培養基中孵育的脂肪干細胞的CPDL ；圖2所示為基質培養基或擴增培養基中孵育20天后的脂肪干細胞的產量；圖3為基質培養基或擴增培養基中孵育的脂肪干細胞進行肌細胞分化的照片 (X40)；圖4為基質培養基或擴增培養基中孵育的脂肪干細胞進行骨細胞分化的照片 (X40)；圖5所示為脂肪干細胞的免疫原性；圖6所示為脂肪干細胞在MLR中的免疫抑制活性；圖7所示為PHA-刺激的免疫反應中，自體和異體脂肪干細胞IFN-Y的分泌抑制活性；圖8所示為PHA-刺激的免疫反應中，自體和異體脂肪干細胞TNF-α的分泌抑制活性；圖9所示為PHA-刺激的免疫反應中，基質培養基和擴增培養基培養的脂肪干細胞的IFN- γ和TNF- α的分泌抑制活性(n = 9)；圖10為脂肪干細胞的細胞外基質蛋白分泌活性的照片(Χ40)；以及圖11為移植脂肪干細胞前后肛瘺的照片。最佳實施方式接下來，將詳細描述本發明優選的實施方案和實施例。然而，這些實施例僅用作說明，并非旨在限制本發明。實施例1人脂肪來源的基質干細胞的培養方法通常通過抽脂獲得脂肪組織，但不特別限于此。根據下述方法從抽脂獲得的脂肪組織中分離脂肪來源的基質細胞用等體積的 KRB溶液洗滌獲得的脂肪組織3 4次以去除脂肪組織中的血液。往脂肪組織中加入等體積的膠原酶溶液，在37°C水浴中進行反應。將反應產物置于離心管中，20°C、1200rpm離心 10分鐘。去除作為上清液的脂肪層，不加振蕩輕柔地分離出剩下的下層膠原酶溶液。將基質培養基加入到膠原酶溶液中制備懸浮液，然后于20°C、1200rpm離心5分鐘。這里，沉淀部分為基質血管成分，也即SVF，而將上清液棄去。在基質培養基中懸浮SVF，接種到培養皿中，在培養箱中于37°C、5% CO2下培養M 小時。去除培養基并用磷酸鹽緩沖液(下稱‘PBS’ )洗滌SVF后，將SVF在含有lng/ml濃度的bFGF或含有5ng/ml濃度的EGF的基質培養基中進行增殖。當脂肪來源的基質細胞生長至覆蓋培養皿80 90%時，用胰蛋白酶處理細胞，以分離和獲得單個類型的細胞。獲得的單個細胞以1 3 1 4的比例用擴增培養基進行稀釋，接下來進行繼代培養。圖1所示為基質培養基或擴增培養基中孵育的脂肪干細胞的CPDL，圖2所示為基質培養基或擴增培養基中孵育20天后脂肪干細胞的產量。如這些圖中所示，發現如果脂肪干細胞在含bFGF或EGF及基質培養基的擴增培養基中進行孵育，細胞的生長速率是使用標準培養基，即單純的基質培養基時的3倍。當1. 5 X IO6個細胞在前述的每個培養基中孵育 20天，基質培養基和擴增培養基中的平均細胞產量分別為9. 7 X IO6和1.9X108。因此，可以看出擴增培養基中收集的細胞約為基質培養基中的20倍。下述表1示出了不同培養基的倍增時間和細胞產量。表 權利要求
1.用于治療瘺的脂肪干細胞組合物，其含有異體脂肪來源的基質干細胞。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中通過培養至少一代生產干細胞。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中至少50%的脂肪干細胞組合物對⑶10、⑶13、 CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105 和 Oct 4 呈陽性，而對 CD34、CD45、CD104、CD106 和 Stro-I呈陰性。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中至少80%的脂肪干細胞組合物對⑶10、⑶13、 CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105 和 Oct 4 呈陽性，而對 CD34、CD45、CD104、CD106 和Stro-I呈陰性。
5.制備含有脂肪來源的基質干細胞的脂肪干細胞組合物的方法，該方法包括如下步驟(a)從目標體中收集脂肪組織；(b)從脂肪組織中分離基質血管成分(SVF)；(c)在基質培養中培養SVF;(d)在含有作為生長因子的EGF或bFGF的擴增培養基中培養SVF，以培養脂肪來源的基質干細胞；和(e)培養脂肪來源的基質干細胞至少一代。
6.根據權利要求5所述的方法，其中步驟(d)的擴增培養基含有濃度為0.1 IOOng/ ml 的 EGF 或 bFGF。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述擴增培養基含有濃度為1 lOng/ml的EGF 或bFGF。
8.根據權利要求5所述的方法，其中所述脂肪組織收集自異體目標體。
9.根據權利要求8所述的方法，其還包括測定通過培養至少一代獲得的脂肪來源的基質干細胞的免疫調節活性，以及選擇具有極佳的免疫抑制活性的異體脂肪來源的基質干細胞。
10.根據權利要求5 9任一項所述的方法制備的脂肪干細胞組合物。
11.用于治療瘺的方法，其包括向瘺患者施用權利要求10所述的脂肪干細胞組合物的步驟。
全文摘要
本發明涉及生產用于治療瘺的臨床有效量的人脂肪組織來源的基質干細胞的方法和由該方法制備的組合物。本發明的方法通過改良常規的標準培養方法，可在短期內有效生產臨床有效量的脂肪組織來源的基質干細胞。與那些通過常規方法制備的細胞組合物相比，通過本發明方法獲得的含有脂肪組織來源的基質干細胞的脂肪干細胞組合物表現出優異的多能性與免疫調節活性，因而更適于治療瘺。特別是，由于在異體脂肪來源的干細胞中，免疫反應被抑制，因而本發明的細胞組合物具有極佳的臨床用途。
文檔編號A61K39/00GK102421444SQ200980158931
公開日2012年4月18日 申請日期2009年6月9日 優先權日2009年4月28日
發明者李圣求, 金美亨 申請人:安特羅根有限公司