脂肪基質細胞分化為成骨細胞及其應用的制作方法

專利名稱：脂肪基質細胞分化為成骨細胞及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及使來自脂肪組織的基質細胞分化為成骨細胞的方法和組合物，及其應用。
背景技術：
在美國每年有大約150萬例的骨折歸咎于骨質疏松癥，其中大約30萬是臀部骨折。臀部骨折50-75％的患者不能獨立生活，導致看護費用的提高。骨質疏松癥的特點是隨著人們變老，骨質密度的降低超乎尋常。這種疾病在西方和亞洲發病率很高(＞30％的60歲以上婦女)，并且壽命越長患者越多。雖然還不知道導致這種骨骼修復紊亂的真正原因，但很明顯骨骼重建的動態過程被一個以骨質形成(骨質形成細胞)活力降低而骨質退化(骨質退化細胞)活力增加為特點的過程所破壞(Parfitt(1992)三角形(Triangle)3199-110；Parfitt(1992)骨骼，卷1，B.K.Hall編。Teleford Press and CRC Press，Boca Raton，FL，351-429頁)。
使用骨髓移植物是矯形術、神經外科和牙科，以及塑造/重塑外科中的常規作法，并且在過去二十年中這種應用越來越頻繁。除血液之外，骨骼是最經常被移植的組織，在美國，每年估計使用50萬骨骼移植物。在普通矯形術中使用骨骼移植物包括處理不連合性和急性長骨骨折，關節重建以及在治療多種脊髓異常中促進脊椎運動部分的融合(Lane(1987)Ortho Clin N Amer 18213-225)。
目前臨床上最能接受的移植材料是自體骨骼。所謂的自體移植材料通常是從第二個手術部位得到的。自體移植存在重要的問題。這些問題包括對于大的傷口和損傷而言缺乏足夠的移植材料。患有骨質疏松癥或骨質減少的年長者使用自體移植也成問題。與獲取移植材料的手術相關的繼發性發病率是很高的。這些并發癥包括感染、骨盆不穩(通常在髂骨的頂端獲取骨骼)、血腫和骨盆骨折(Laurie等(1984)Plas Rec Surg73933-938；Summers等(1989)J Bone Joint Surg 71B677-680；Younger等(1989)矯形術和外傷雜志3192-195；Kurz等(1989)脊柱141324-1331)。另外，供體部位的慢性疼痛是第二種最經常報道的并發癥(Turner等(1992)JAMA 268907-911)。最后，由于骨骼材料的堅硬特性使自體移植物能配合損傷/傷口部位的形狀的能力受到限制。
最近的研究集中在各種基質的使用上，所述基質或是無機材料如羥磷灰石(Flatley等(1983)Clin Orthop Rel Res 179246-252；Shima等(1979)神經手術雜志51533-538；Whitehill等(1985)脊柱1032-41；Herron等(1989)脊柱14496-500；Cook等(1986)脊柱10305-309；各文章內容此處引作參考)或是有機材料如脫礦質的骨基質(DBM)(綜述見Ashay等(1995)美國矯形術雜志24752-761；該文內容此處引作參考)。這些基質被認為是骨質傳導性的(促進骨質形成細胞在惰性基質中的入侵)或骨質誘導性的(誘導重新補充的前體細胞轉化為成骨細胞)。食品和藥品管理局批準的一些用于臨床的產品在臨床上已觀察到許多成功的結果。盡管獲得成功，使用這些基質仍存在很多問題。首先是受治療者對DBM不同程度的反應。而且這些基質比自體骨骼移植需要更長的時間來形成重要的結構整體性和有效地承受負載。
移植物和使用單一基質的替代品是使用骨髓或骨髓基質細胞與DBM的混合物。較為理想的是細胞和DBM來源于同一受治療者，盡管異源DBM也開始在臨床上取得成功(Mulliken(1981)外科年鑒194366-372；Kaban等(1982)J Oral Maxillofac Surg 40623-626)。使用自體骨髓細胞與異源DBM的移植方法已經取得很好的結果(Connolly(1995)臨床矯形術3138-18)。但是，阻礙這些技術廣泛使用的問題包括非自身物質污染的潛在可能、患者對捐獻骨髓的可接受性，以及抽出骨髓后引起的潛在并發癥和骨髓來源耗竭。
許多研究小組已經證明骨髓基質細胞和由此衍生的細胞系能夠分化為在生化性質和形態上類似于成骨細胞的細胞(Dorheim等，(1993)細胞生理學雜志154317-328；Grigoriadis等，(1988)細胞生物學雜志1062139-2151；Benayahu等(1991)Calcif Tiss Int.49202-207；文獻內容引作參考)。在多數情況下，從人或動物的骨髓中分離類成纖維細胞并將這些細胞鋪在標準的組織培養器上。一般來說，使用標準培養基配方，如添加10-20％胎牛血清和抗生素的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)來富集這些細胞(Ashton等(1980)臨床矯形術151294-307；Sonis等(1983)口腔醫學雜志3117-120)。然后通過將培養基換為含有5-20％胎牛血清、2-20mMβ-甘油磷酸和20-75μM抗壞血酸或抗壞血酸-2-磷酸的培養基來刺激細胞分化為成骨細胞(Asahina等(1996)實驗細胞研究22238-47；Yamaguchi等(1991)Calcif Tissue Int 49221-225；文獻內容此處引作參考)。培養14-21天后，許多細胞型和細胞系將礦化培養器中的基質，這由von Kossa染色為陽性可得到證實。成骨細胞譜系的其他表型指示包括分泌堿性磷酸酶活力的升高；培養基中存在分泌的骨鈣蛋白；一些被認為是在成骨細胞中特異表達的基因的表達水平提高，包括骨鈣蛋白，骨橋蛋白和骨涎蛋白(Stein等(1990)FASEB雜志43111-3123；Dorheim等(1993)細胞生理學雜志154317-328；Asahina等(1996)實驗細胞研究22238-47；Yamaguchi等(1991)Calcif TissueInt 49221-225)。
一些實驗室所進行的許多詳細研究證實被移植的骨髓基質細胞能夠形成異位骨骼(Gundle等(1995)骨骼16597-603；Haynesworth等(1992)骨骼1381-89；Boynton等(1996)骨骼18321-329)。例如，人和鼠的骨髓基質成纖維細胞已被移植到免疫缺陷的SCID小鼠中(Krebsbach等(1997)移植631059-1069；Kuzneysov等(1997)J BoneMin Res 121335-1347)。使用抗體和組織化學標記證明存在誘導性基質時，供體的骨髓基質細胞導致在異位骨骼形成的部位上發展出新的成骨細胞。有羥磷灰石/磷酸三鈣顆粒(HA/TCP)、明膠、多聚-L-賴氨酸和膠原蛋白的情況下，小鼠的(骨髓基質)細胞形成骨骼。與此不同的是，人的基質細胞只在有HA/TCP時才能有效地形成骨骼。在這些研究中不需要外源的BMP。
骨的形成并不限于骨架。例如，如果肌肉間、腎下囊或皮下等部位同時表達骨骼形態發生蛋白，在這些部位引入陶瓷的或脫礦化的骨基質將導致骨骼的形成。(Urist等(1996)科學150893-899)。這些結果暗示在合適的環境條件下，這些組織的細胞具有某些形成骨骼前體細胞的能力。
在軟組織如脂肪中的異位骨骼形成是一種罕見的病理狀況，它發現于患有進行性纖維骨化—一種遺傳疾病的患者中。雖然并不完全了解其病原學，該病部分是由于位于軟組織損傷部位的淋巴細胞異常表達BMP所引起的(Kaplan等(1997)J Bone Min Res 12855；Shafritz等(1996)N Eng J Med 335555-561)。在脂瘤中也會偶爾發現骨骼形成(Katzer(1989)Path Res Pract 184437-443)。
有證據表明分離自經膠原酶處理后的脂肪組織的基質—血管部分含有大量的前脂肪細胞，或傾向于分化為脂肪細胞的細胞(Hauner等(1989)臨床研究雜志341663-1670)。這些細胞能以較低的頻率自發地分化為脂肪細胞或能對產脂肪促進劑如四氫噻唑二酮產生應答從而提高分化頻率(Halvorsen(1997)等方法1158-60；Digby(1997)糖尿病4138-141)。有證據表明在這些細胞系之間基質細胞呈現出一種互相分化的模式(Gimble等(1996)骨骼19421-428；Bennett等(1991)細胞科學雜志99131-139；Beresford等(1992)細胞科學雜志102341-351)。具體來說，脂肪形成伴有骨生成可能性的降低，而骨生成伴隨脂肪形成可能性的降低。
在某些條件下，骨髓基質細胞能分化為脂肪細胞。事實上，就這一能力，一些骨骼基質細胞系已經廣泛地得到表征(Gimble等(1990)歐洲免疫學雜志20379-387；Gimble等(1992)細胞生物化學雜志5073-82；Gimble等(1996)骨骼19421-428)。但是，在本發明之前，使從脂肪組織分離的基質細胞能分化為成骨細胞仍是未知的。

發明內容
本發明提供了使脂肪組織的基質細胞分化為具有成骨性質的細胞的方法和組合物，以及改善受治療者骨骼結構的方法。所述方法包括將脂肪組織的基質細胞在β-甘油磷酸、抗壞血酸和抗壞血酸-2-磷酸中培養足夠長時間以誘導所述細胞分化為成骨細胞。這種方法和組合物可用于產生在外科手術部位或傷口進行自體移植到骨骼中的成骨細胞。組合物中包含脂肪基質細胞，以及能支持成纖維細胞生長的培養基和一定量足夠誘導分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
本發明進一步提供了鑒定影響成骨細胞分化的化合物的方法，所述化合物可用于研究骨骼發育和治療骨疾病，其中包括骨折和骨質疏松癥。


圖1顯示了經成骨細胞分化培養基處理后，被誘導分化為成骨細胞的人脂肪基質細胞所發生的形態變化。
圖2顯示了經成骨細胞分化培養基或脂肪細胞分化培養基處理后的脂肪基質細胞和用油紅O(圖2A和圖2C)或yon Kossa方法(圖2B和圖2C)染色后的脂肪基質細胞。
圖3顯示了經基質細胞培養基(PA)、脂肪細胞培養基(AD)或成骨細胞培養基(DST)處理的脂肪基質細胞，分泌到培養基中的骨鈣蛋白和leptin濃度隨時間的變化。
圖4顯示了在基質細胞培養基(SC)、脂肪細胞分化培養基(AD)或成骨細胞分化培養基(OST)中培養21天后的脂肪基質細胞分泌的堿性磷酸酶的濃度。
發明詳述本發明提供了使脂肪基質細胞分化為成骨細胞的方法。由本發明所述方法產生的成骨細胞可用來提供用于研究或移植到受治療者損傷或骨折部位的骨中的成骨細胞。因此，在一個方面，本發明提供了使脂肪基質細胞分化為成骨細胞的方法，其中包括在一種組合物中培養所述細胞，該組合物包括能支持成骨細胞生長的培養基和一定量足夠誘導分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
在另一方面，本發明提供了使脂肪基質細胞分化為成骨細胞的組合物。所述組合物包括脂肪基質細胞，能支持成纖維細胞生長的培養基和足夠量的β-甘油磷酸和抗壞血酸或抗壞血酸-2-磷酸以誘導所述基質細胞分化為成骨細胞。
“脂肪基質細胞”指來源于脂肪組織的基質細胞。“脂肪”意味著任何脂肪組織。脂肪組織可以是棕色或白色的脂肪組織。優選脂肪是皮下白色的脂肪組織。這些細胞可以包括原代細胞培養物或一個永生化的細胞系。脂肪組織可以來源于任何有脂肪組織的生物。優選哺乳動物的脂肪組織，最優選人的脂肪組織。人脂肪組織的一個方便來源是吸脂外科手術，但脂肪組織的來源或分離的方法對本發明并不重要。如果希望成骨細胞用于自體移植，應從受治療者身上分離脂肪組織。
“一定量足夠誘導分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸”指β-甘油磷酸和(抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸)的濃度，當補充于能支持成纖維細胞(如NIH-3T3細胞、人類脂肪基質細胞以及類似細胞)生長的培養基中時，經5天到8周的培養，將誘導所述基質細胞分化為成骨細胞。處理的最佳濃度和時間將由操作者利用已知的分化成骨細胞的檢測方法來確定。這樣的檢測方法包括，但不限于形態和生化特性的檢測(如分泌的骨鈣蛋白或其它成骨細胞特異性蛋白或RNA)。
抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的濃度指這些化合物的混合濃度，即所述濃度的總和。例如，“50μM的抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸”的定義包括，但不限于這樣的排列組合50μM的抗壞血酸；50μM的抗壞血酸-2-磷酸；10μM的抗壞血酸和40μM的抗壞血酸-2-磷酸；或40μM的抗壞血酸和10μM的抗壞血酸-2-磷酸。
優選，培養基含有大約2-20mMβ-甘油磷酸和大約20-75μM的抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。更優選，培養基包含5-15mMβ-甘油磷酸和大約40-60μM的抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。最優選，培養基包含10mMβ甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
可以使用任何能支持成纖維細胞在細胞培養基中生長的培養基。支持成纖維細胞生長的培養基配方包括Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)，α-改進的極限必需培養基(αMEM)和必需的基本培養基(BME)以及類似的培養基。通常，要向以上培養基中加入5-20％胎牛血清(FCS)以支持成纖維細胞的生長。但如果在FCS中對成纖維細胞生長所必須的成分已得到確定并補充到生長培養基中，也可以使用確定成分培養基。
可用于本發明所述方法的培養基可以含有一種或多種感興趣的化合物，包括，但不限于，抗生素，骨誘導性、骨傳導性或促進生長或分化的化合物，例如骨骼形態發生蛋白或其它生長因子。骨骼形態發生蛋白的例子包括，但不限于生骨蛋白-1，BMP-5，成骨素，骨骼誘導因子和骨骼形態發生蛋白-4(Asahina等(1996)實驗細胞研究22238-47；Takuwa(1991)生物化學和生物物理研究通訊17496-101；Chen(1991)JBone Min Res 61387-1390；Sampath(1992)生物化學學報26720352-20362；Wozney等(1988)科學2421528-1534，文獻此處引作參考)，以及類似的物質。
優選地，脂肪組織經過處理從而使基質細胞彼此解離并同其它類型的細胞分離，除去沉淀的血液成份。通常，可以用蛋白水解酶，比如膠原酶和/或胰蛋白酶以及能螯合鈣離子的試劑來處理脂肪組織可以使其解離為單個可存活的細胞。然后通過各種本領域技術人員熟知的方法，如差速離心，熒光激發細胞分選術，親和層析以及類似的方法可以部分或全部地純化基質細胞。然后在經含有β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的培養基處理前，將部分或全部純化的基質細胞在支持成纖維細胞生長的培養基中培養8個小時到5個細胞傳代時間。
將基質細胞在含有β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的培養基中培養足夠長的時間以誘導其分化為成骨細胞。為使得基質細胞分化為成骨細胞，用β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸處理時間的長短取決于多種因素。這些因素包括，但不限于，所用β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的濃度，所用培養基，脂肪組織或基質細胞的來源，鋪板的起始密度，生長因子或骨骼形態發生蛋白質存在與否等。操作者可以優化β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的濃度以及其它條件和因子。通過測量已分化為成骨細胞的細胞百分比可以確定最佳的濃度和處理次數。通過本領域技術人員了解的形態學和生化檢測和指數可以監測上述百分比。這樣的檢測和指數包括，但不限于對形態和生化特性檢測，比如鈣沉淀物或成骨細胞特異性蛋白質或RNA的存在、von Kossa染色、骨鈣蛋白的分泌和堿性磷酸酶的分泌。
來源于脂肪組織基質細胞的成骨細胞可以導入人或動物受治療者的外科手術或骨折部位。將成骨細胞導入骨骼可用于治療骨折和骨疾病，包括骨質疏松癥。因此，在另外一個方面，本發明著眼于改善受治療者骨結構的方法，包括a)在含有能支持成纖維細胞生長的培養基和一定量足夠誘導分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養來自脂肪組織的基質細胞。
b)將所述成骨細胞導入所述受治者的外科手術或骨折部位。
優選基質細胞分離自將接受分化的成骨細胞的受治療者的脂肪組織，但也可以使用分離自與受治療者同種或異種的生物的基質細胞。受治療者可以是有骨組織的任何生物。優選的受治療者是哺乳動物，最優選的受治療者是人。
在移植到受治療者的外科手術或骨折部位之前，可以用目的核酸來穩定或瞬時轉化基質細胞或成骨細胞。目的核酸序列包括，但不限于能編碼提高成骨細胞生長，分化和/或礦化的產物的基因。例如，為治療沒有愈合的骨折或骨質疏松癥，可以將骨骼形態發生蛋白4的表達系統以穩定或瞬時的方式轉化到前脂肪細胞中。轉化基質細胞和成骨細胞的方法是本領域技術人員已知的，將成骨細胞移植到骨骼外科手術或骨折部位上的方法也同樣為人所周知。
可以將成骨細胞單獨或以它與有益于骨骼傷口和損傷的修復的組合物形成的混合物的形成導入。這些組合物包括，但不限于，骨骼形態發生蛋白，羥磷灰石/磷酸三鈣顆粒(HA/TCP)，明膠，多聚-L-賴氨酸，和膠原。例如，可以將從脂肪基質細胞分化而來的成骨細胞與DMB或其它基質組合以使該復合材料具有骨質生成性(自身產生骨骼)和骨質誘導性。用自體骨髓細胞與同種異體的DMB組合的類似方法也產生了很好的結果(Connolly(1995)臨床矯形術3188-18)。
本發明另外一個目的是為鑒定和研究能促使基質細胞分化為成骨細胞的化合物提供方法。能提高成骨細胞的分化的化合物在各種骨疾病，包括骨折和骨質疏松癥的治療中可能有一定作用。另外，發現能誘導成骨細胞分化的化合物可應用于體外或體內使細胞分化。相反地，發現能阻礙成骨細胞分化的化合物或因子可應用于某些疾病狀態，其中特應性骨產生，比如Paget’s病或成軟骨組織變形，可以利用這些化合物進行治療。因此，在另一個方面，本發明著眼于鑒定影響成骨細胞分化的化合物的方法，包括a)在存在或缺乏被檢測其對成骨細胞分化之影響的化合物的情況下，在含有能支持成纖維細胞生長的培養基和一定量足夠誘導分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養脂肪基質細胞；以及b)比較存在或缺乏所述化合物時培養的細胞的成骨細胞分化情況。
可以對任何化合物測試其影響基質細胞分化為成骨細胞的能力。與待測化合物相容的載體是本領域技術人員已知的，并且可以在《Remington’s制藥科學》(此處引作參考)的現行版本中找到。
將檢測結果與使用已知分化促進劑的結果進行比較，比如產骨蛋白1和骨質形態發生蛋白-4(Asahina等(1996)實驗細胞研究22238-47；Takawa(1991)supra；Chen(1991)supra；Sampath(1992)Supra；Wozney等(1988)科學2421528-1534)，已知這些物質通過提高成骨細胞標記物(比如骨鈣蛋白一一種成骨細胞功能的明確標記物)的表達來促進成骨細胞的分化(Celeste(1986)美國科學院學報879843-9872；Stein等(1990)FASEB雜志43111-3123)。并且也可以將這些檢測的結果與已知的成骨細胞分化抑制劑(比如α-TNF)進行比較，這些抑制劑能全部或部分阻斷基質細胞向成骨細胞的轉變。
參考下面的實施例可以更清楚地理解本發明的特點和有利之處，但這些實施例并非用來限制本發明。
具體實施例方式
實施例1從人的脂肪組織中分離基質根據Rodbell(1964，生物化學雜志239275)和Hauner等(1989，臨床研究雜志)描述的方法從人類脂肪組織中分離基質細胞。簡要地說，通過吸脂術分離來自人皮下儲存的脂肪組織。然后將脂肪組織從吸脂杯中轉移到500ml無菌的燒杯中，并沉降大約10分鐘。吸去沉淀的血。將125ml體積(或更少)的脂肪組織轉移到250ml離心管中，然后在離心管中加入Krebs-Ringer緩沖液。組織和緩沖液放置沉降3分鐘或直到產生清晰的分層，然后吸出緩沖液。再用Krebs-Ringer緩沖液將組織洗4-5次或直到組織為橙黃色，而緩沖液為淺褐色。
通過膠原酶處理來解離脂肪組織的細胞。簡要地說，從脂肪組織中除去緩沖液，換上比例為1ml膠原酶溶液/ml組織的2mg膠原酶/ml KrebsBiffer溶液(Worthington，MA，USA，type 1)。離心管在37℃水浴中保溫30-35分鐘，并不時振蕩。
經室溫下500xg離心5分鐘使得基質細胞與脂肪組織中其它組份分離。吸去油和脂肪細胞。剩余的基質-泡囊部分通過強烈旋轉重新懸浮于大約100ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，分到50ml的離心管并于500xg離心5分鐘。小心吸去緩沖液，留下基質細胞。然后將基質細胞重新懸浮于基質細胞培養基(DMEM(Morton(1970)體外689-108；Dulbecco(1959)病毒學8396)/Ham’s F-10培養基(Ham(1963)實驗細胞研究29515)(1∶1，v/v)；10％(v/v)胎牛血清；15mM HEPES，pH7.4；60U/ml青霉素；60U/ml鏈霉素；15μg/ml兩性霉素B)，以合適的細胞密度下鋪板并在5％CO2下37℃培養過夜。一旦附著在組織培養皿或培養瓶上，培養的基質細胞可以馬上投入使用或者在被誘導而分化為成骨細胞(如以下實施例2所述)之前，在培養基中維持5個傳代時間。
實施例2髓外脂肪基質細胞分化為成骨細胞如實施例1所述分離脂肪基質細胞，然后如下處理以誘導分化為成骨細胞。基質細胞以大約22000個細胞/cm2的密度鋪在24孔和/或6孔組織培養板中的基質細胞培養基(見上)上。24小時后，用成骨細胞分化培養基(補充有10％的胎牛血清(v/v)的DMEM；10mMβ-甘油磷酸；50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸；60U/ml青霉素；60U/ml鏈霉素，15μg/ml兩性霉素)取代基質細胞培養基。三周內，每三天用新鮮的培養基置換成骨細胞分化培養基。換培養基時，收集1ml條件培養基并保存于-80℃，用于以后分析分泌的因子。另一種替代的方法是根據Hauner等人(1989臨床研究雜志341663-1670)的方法，經脂肪細胞分化培養基處理，誘導分離自脂肪組織的基質細胞分化為脂肪細胞。
對如上所述經成骨細胞培養基處理的細胞進行顯微觀察顯示與成骨細胞的外形相一致的形態學變化(圖1)。延長培養(21-28天)后，在每個培養小孔內形成了一些多細胞結。成骨細胞培養物的顆粒狀外型表明磷酸鈣沉淀物和前骨結構的存在。因為分離自脂肪組織的基質細胞用脂肪細胞分化培養基處理時，也有可能分化為脂肪細胞，也應檢查經成骨細胞培養基處理的細胞中是否存在脂肪細胞。細胞質中沒有油滴以及缺乏具有特征性的圓形的脂肪細胞形態的細胞表明經成骨細胞培養基處理的培養物中沒有明顯的脂肪細胞。
經成骨細胞分化培養基處理的細胞用von Kossa的方法進行染色以鑒定基質細胞是否分化為成骨細胞。簡要地說，通過用無血清的培養基置換80％的培養基數次，連續稀釋出培養基中的胎牛血清。細胞在5％的甲醛中固定，然后用PBS洗滌數次以除去殘余血清。固定化的細胞在100％的乙醇中4℃下保溫大約10分鐘。除去乙醇后，在波長為254nm的紫外下，固定化的細胞在0.5ml的5％硝酸銀中保溫10分鐘。在蒸餾水中沖洗細胞2-3次，在5％硫代硫酸鈉中溫育5分鐘，然后用水沖洗。染色的細胞可以在50％甘油中無限期地保存。圖2B和圖2C顯示了von kossa染色的結果。只有得到成骨細胞培養基的細胞染色為陽性并變黑。
如下進行油紅O染色培養平板用PBS洗滌幾次以除去培養基中的血清或牛血清白蛋白。細胞在甲醇中或溶于PBS的10％甲醛中固定15分鐘到24小時。通過將6ml儲存液(0.5油紅O溶于100ml異丙醇)加入4ml蒸餾水中來制備油紅O染色溶液。在經Whatman#1濾紙過濾之前，染色液在室溫下放置一個小時。細胞以大約3ml/100mm平板或在6孔平板中以1ml/孔的比例在室溫下染色1小時，然后用水洗滌幾次。將殘留的洗滌用水全部除去。加入150μl/孔的異丙醇，平板在室溫下放置10分鐘。將異丙醇吹吸幾次以保證所用油紅O溶解。在500nm處測量光密度。
接受脂肪細胞分化培養基的細胞用下述方法經油紅O染色將呈現特征性的紅色，表明脂質的積累(圖2A)。在培養基中4周后，前脂肪細胞顯示出積累的很小的油滴。細胞接受成骨細胞培養基顯示了一些非特異性的油紅O背景，但該染色與細胞無關(圖2C)。這些結果表明分化為成骨細胞的基質細胞沒有可檢測到的脂肪細胞形態。缺乏這種中性脂質積累是失去脂肪細胞功能和譜系的標志。
還檢測了指示成骨細胞分化的生化變化。骨鈣蛋白是成骨細胞特異性分泌的蛋白，可由ELISA(完整人類骨鈣蛋白K EIA試劑盒，貨號BT-460，Biomedical Technologies Inc.，Stoughton，MA)來檢測。檢查成骨細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞的培養基是否存在分泌的骨鈣蛋白。簡要地說，收集條件培養基(40000細胞培養72小時后的培養基2ml)，每種培養基取20μl進行檢測。如圖3所示，在成骨細胞培養基中骨鈣蛋白增加，而脂肪基質細胞和脂肪細胞分泌的骨鈣蛋白很少或沒有。
用商業來源的ELISA試劑盒檢測分泌的leptin肽。收集條件培養基(40000細胞條件培養72小時后的培養基2ml)，取100μl依照生產商建議的方案進行檢測。正如預期的那樣，在脂肪細胞分化期間，分泌到培養基中的leptin的量增加，而在成骨細胞分化中則否。在條件培養基中leptin--一種脂肪細胞特異性分泌蛋白的存在，是脂肪細胞活力明確的指示物。成骨細胞和基質細胞不能分泌可檢測量的leptin到培養基中，這表示缺乏脂肪細胞譜系，而只有脂肪細胞分化兩周后的細胞才分泌leptin。
成骨細胞譜系的另一個標記是分泌堿性磷酸酯酶的能力。按上述方法制備和培養細胞。使用商業來源的檢測試劑盒(Sigma診斷公司，貨號104-LS，St Louis，MO)檢查條件培養基的堿性磷酸酯酶活性。如圖4所示，前脂肪細胞有本底水平的分泌的堿性磷酸酯酶活力。經分化，脂肪細胞失去了本底分泌活力，而成骨細胞的堿性磷酸酯酶的水平則有提高。
實施例3鑒定影響成骨細胞分化的化合物按照實施例1描述的方法，用分離自脂肪組織的基質細胞的培養物來研究目的化合物對成骨細胞分化的影響。如實施例2所述，在存在或缺乏目的化合物時，成骨細胞由脂肪基質細胞分化而來。通過分泌骨鈣蛋白的檢測方法來檢測分化。使用本實施例的方法，發現促進成骨細胞分化的化合物包括骨形態發生蛋白4和骨橋蛋白-1(未顯示數據)。這些結果與Wozney等，1988科學2421528-1534；Asahina等，1996實驗細胞研究22238-47；Cook等，1996臨床矯形術32429-38以前的發現相符。如下討論促進成骨細胞分化的化合物可用于增強受治療者的骨結構。
實施例4骨修復中成骨細胞的應用按照實施例1的方法，使用吸脂術從患有不能痊愈性骨折和骨質疏松癥骨折的患者的脂肪組織中分離基質細胞。用實施例2的方法在體外誘導前脂肪細胞分化為成骨細胞。7-21天后，通過例如胰酶處理或從組織培養板中機械地剝離來收集已分化的成骨細胞，然后在無菌條件下4-20℃ 3000xg離心10分鐘濃縮細胞。將收集到的細胞懸浮于膠原或MatrigelTM溶液中，然后使用20口徑或更大孔徑的針頭直接注射到骨折或外科手術部位。另一個替代的方法是，在注射前，將細胞與DBM或比如ProOsteon 2000TM(Interpore Cross，Irvine，CA)或CollagraftTM(Zimmer，Warsaw，IN)的陶瓷基質相混合。所用細胞的數量取決于骨折的面積和性質。根據所需的骨折恢復速度可以進行多種治療。結果是痊愈時間的縮短和骨折部位周圍骨密度的增加。
實施例5使用基因改變的成骨細胞治療骨折或骨質疏松癥如實施例1所述分離基質細胞，使用標準轉染方法如氯化法(Maniatis等(1982)分子克隆實驗指南，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)將基因材料(例如編碼有用基因產物，如骨骼形態發生蛋白的DNA，它可操縱地與啟動子相連)轉入基質細胞。使用Effectene試劑可改善該方法，并在這里描述。在1個微量離心管中，將0.1-2.0μg pCMV-βgal(Stratagene Inc.，La Jolla，CA)加入150μlBuffer EC(Qiagen EffecteneTM試劑盒，貨號301425，Qiagen公司)。這樣可以凝聚DNA。將8μl的促進劑(試劑盒)加入凝聚后的DNA。然后將含有凝聚DNA的離心管旋轉1秒鐘并在室溫下放置2-5分鐘。短暫離心以除去管頂端的液滴。加入10μl EffeeteneTM，離心管旋轉10秒，室溫下放置5-10分鐘。在5-10分鐘的保溫時間后，向DNA混合物中加入1ml培養基。
從細胞移去120μl舊培養基并加入70μl新鮮培養基，然后將25μ1 DNA混合物移入每個孔。細胞于37培養約5小時。但是，Effectene沒有毒性也可以一直保留在細胞上。
然后將細胞在感染72小時后用80μl新鮮培養基沖洗1次，并用Mantiatis等描述的方法(1982)檢測細胞的β-半乳糖苷酶活力。由實施例1描述的方法可使這些細胞分化為成骨細胞。可替代地，或者DNA可以直接導入分化為成骨細胞的細胞中。
也可以使用其它將核酸序列導入細胞的方法。例如，通過與Becker等(1994，Meth Cell Biol 43161-189)和Meunier-Durmont等(1996，歐洲生物化學237660-667)描述的相類似的方法，可以使用腺病毒將DNA轉入基質細胞。細胞經如以上實施例1描述的處理后分化為成骨細胞。或者，分化的成骨細胞能夠用病毒顆粒感染。加入抗生素選擇性標記使其能富集含有導入遺傳材料的細胞。然后如以上實施例3所述，將得到的帶有導入遺傳材料的成骨細胞移植到骨折或骨質疏松癥的骨髓中。
說明書中提到的所有出版物表明了本發明相關領域的技術人員的水平。所有出版物引入本文作為參考文獻，正如每篇均是逐一并個別地全文引入作為參考文獻一樣。
雖然已參照特定的實施方案描述了本發明，可以想到很多變化、改善和實施方案都是可能的，并且可以相應地認為所有這些變化、改善和實施方案都在本發明的精神和范圍內。
權利要求
1.一種使脂肪基質細胞分化為成骨細胞的方法，包括在包含能支持成纖維細胞生長的培養基和誘導分化量的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養所述細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述量是大約2-20mM的β-甘油磷酸和大約20-75μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
3.權利要求2的方法，其中所述量是大約5-15mM的β-甘油磷酸和大約40-60μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
4.權利要求3的方法，其中所述量是大約10mM的β-甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
5.權利要求1的方法，其中所述培養基選自DMEM，αMEM和BME。
6.權利要求1的方法，其中所述培養基還包含大約5-20％的胎牛血清。
7.權利要求1的方法，其中所述培養基還包含一種或多種骨骼形態發生蛋白。
8.權利要求1的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
9.權利要求8的方法，其中所述細胞是人細胞。
10.一種鑒定影響成骨細胞分化的化合物的方法，包括a)在分別存在和缺乏受試以測試其對成骨細胞分化的影響的化合物時，在包含能支持成纖維細胞生長的培養基和一定量足夠誘導分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養脂肪基質細胞；和b)比較分別培養于存在或缺乏所說的化合物中的所述細胞中成骨細胞的分化情況。
11.權利要求10的方法，其中所述量是大約2-20mM的β-甘油磷酸和大約20-75μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
12.權利要求11的方法，其中所述量是5-15mM的β-甘油磷酸和大約40-60μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
13.權利要求12的方法，其中所述量是10mM的β-甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
14.一種改善受治療者骨結構的方法，包括a)在包含能支持成纖維細胞生長的培養基和一定量足夠誘導分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養脂肪基質細胞；以及b)將所說的成骨細胞導入受治療者的外科手術或骨折部位。
15.權利要求14的方法，其中所述量是大約2-20mM的β-甘油磷酸和大約20-75μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
16.權利要求15的方法，其中所述量是大約5-15mM的β-甘油磷酸和大約40-60μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
17.權利要求書16方法，其中所述的數量是大約10mM的β-甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
18.權利要求14的方法，其中所述脂肪基質細胞分離自所說的受治療者。
19.權利要求14的方法，其中所述培養基選自DMEM，αMEM和BME。
20.權利要求14的方法，其中所述培養基還包含5-20％的胎牛血清。
21.權利要求14的方法，其中所述培養基還包含一種或多種骨骼形態發生蛋白。
22.權利要求14的方法，其中所述受治療者是哺乳動物。
23.權利要求22的方法，其中所述受治療者是人。
24.權利要求14的方法，其中所述成骨細胞是與在骨傷口，骨缺損和/或骨疾病的修復中有用的組合物相混合導入的。
25.權利要求14的方法，其中將目的核苷酸序列導入所述脂肪基質細胞或所述成骨細胞。
26.一種組合物，包含脂肪基質細胞、能支持成纖維細胞生長的培養基和一定量的足以誘導基質細胞分化為成骨細胞的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
27.權利要求26的組合物，其中所述量是大約2-20mM的β-甘油磷酸和大約20-75μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
28.權利要求27的組合物，其中所述量是大約5-15mM的β-甘油磷酸和大約40-60μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
29.權利要求28的組合物，其中所述量是大約10mM的β-甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
30.權利要求26的組合物，其中所述基質細胞是人的。
全文摘要
本發明提供了使來源于脂肪組織的基質細胞分化為具有成骨細胞性質之細胞的方法和組合物，以及改善受治療者骨骼結構的方法。這些方法包括在β－甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸－2－磷酸中將來源于脂肪組織的基質細胞培養足夠長時間以使所述細胞分化為成骨細胞。所述方法和組合物可應用于在外科手術和損傷部位產生自體移植入骨所需的成骨細胞。所述組合物包括脂肪基質細胞、能支持成纖維細胞生長的培養基以及一定量的足夠所說的誘導基質細胞分化為成骨細胞的β－甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸－2－磷酸。本發明進一步提供了鑒定影響成骨細胞分化的化合物的方法。所述化合物可用于研究骨骼發育和治療包括骨折和骨質疏松癥在內的骨疾病的治療。
文檔編號A61F2/00GK1584020SQ20041005902
公開日2005年2月23日 申請日期1998年12月1日 優先權日1997年12月2日
發明者Y-D·C·哈爾沃森 申請人:澤恩比奧公司