專利名稱：表達jev免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種表達JEV免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應用。
背景技術：
JE(乙型腦炎)也稱日本腦炎(J即anese enc印halitis)，是由JEV(日本腦炎病 毒)引起的人和動物共患的一種蟲媒病毒性疾病。主要引起母豬出現繁殖障礙如流產、早 產、死胎、木乃伊胎)，也可引起公豬的睪丸急性炎癥反應或不育，從而給我國養豬業造成了 巨大的經濟損失。 JEV屬于黃病毒科，黃病毒屬，是不分節段的單股正鏈RNA病毒。基因組長約llKb， 有單一開放的閱讀框，能編碼、翻釋、加工成3種結構蛋白(囊膜蛋白E、膜蛋白M以及衣殼 蛋白C)和7種非結構蛋白。E糖蛋白是JEV主要的免疫原，可誘發機體產生中和抗體和血 凝抑制抗體，保護機體免受病毒攻擊，是乙腦病毒的基因工程疫苗研究首選蛋白。
JEV是目前嚴重威脅養豬業發展的一種重要的病毒，目前對這JE疾病的控制尚無 切實有效的方法，防制JE的疫苗主要有滅活苗和弱毒苗，但由于免疫原性和安全性等方面 的問題受到限制。因此發展新型疫苗來控制JE已是當務之急。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種重組桿狀病毒及可作為預防JE感染的亞單 位疫苗。 本發明提供的一種表達JEV免疫原基因的重組桿狀病毒，帶有SEQ IDNO. 1所示的
序列。所述重組桿狀病毒表面展示JEV結構蛋白E。 本發明提供一種上述的重組桿狀病毒的制備方法，步驟包括 a、制備E基因。制備方法為用PCR方法擴增了 JEV陜西株E基因，并將其克隆到
pMD18-T載體，構建了 pMD18T-E質粒； b、將JEV的E基因，插入到桿狀病毒表面展示轉座載體pBacSC的p10啟動子下游， 構建含JEV的E基因的重組桿狀病毒轉座質粒pBacSC-E ; c、將上述重組桿狀病毒轉座質粒pBacSC-E轉入大腸桿菌內進行同源重組，獲得 重組桿狀病毒基因組DNA。作為優選，所述大腸桿菌為感受態大腸桿菌DH10Bac。
d、將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉染昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒。優選地， 將重組桿狀病毒DNA通過脂質體介導方法轉入昆蟲細胞Sf9中，包裝出重組桿狀病毒。
本發明提供一種上述的重組桿狀病毒在制備預防豬乙型腦炎的疫苗中的應用。
本發明提供一種制備預防豬乙型腦炎的亞單位疫苗的方法重組病毒接種昆蟲細 胞，培養48 72h，收取感染細胞，-40°C /37t:凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調整病毒 的滴度使其達到109PFU/ml。上述昆蟲細胞優選Sf9昆蟲細胞。
本發明的優點和積極效果為 1 、本發明得到的重組桿狀病毒BacSC-E可表面展示JEV結構蛋白E，直接經過超速
3離心得到桿狀病毒的同時也就得到了目的蛋白，可以避免現有技術中表達系統(包括傳統 的桿狀病毒表達系統)表達目的蛋白分離純化的繁瑣過程。而，現有技術的表達系統中表 達的目的蛋白是分泌到Sf9細胞的培養基中，需要通過蛋白純化系統來純化目的蛋白，這
樣費時費力，代價昂貴，不能大規模應用于目的蛋白的規模化生產，這也是目前蛋白表達最 令人頭疼的地方。 2、轉座載體中添加eGFP基因，可以通過熒光顯微鏡直接觀察熒光的有無來檢測 重組病毒的產生情況，大大簡化病毒滴度的測定。 3、該重組桿狀病毒表面展示的蛋白可與JEV抗體發生特異性反應。 4、本發明得到的一株重組桿狀病毒BacSC-E可剌激小鼠產生有效的體液免疫和
細胞免疫。 5、本發明得到的一株重組桿狀病毒BacSC-E對實驗動物是安全的，無任何病理現 象出現。 6、本發明得到的一株重組桿狀病毒具有很好的遺傳穩定性，經多次傳代后外源基 因不丟失。 7、本發明所使用的目的基因為JEV(自陜西分離)國內分離株，從而構建的重組桿 狀病毒可作為我國預防JE的亞單位疫苗。
圖1是重組轉座質粒pBacSC-E構建流程圖。 圖2是重組病毒BacSC-E感染Sf9細胞綠色熒光蛋白的表達。 圖3是共軛聚焦顯微鏡分析重組桿狀病毒BacSC-E的E蛋白在Sf9細胞膜上的展示。 圖4是重組桿狀病毒BacSC-E的E蛋白的Western blot分析。 圖5是免疫電鏡分析E蛋白在重組桿狀病毒BacSC-E囊膜上的展示。 圖5中標號說明A.重組桿狀病毒BacSC-E ;B.陰性對照組，重組桿狀病毒BacSC。
具體實施例方式
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以 更好的理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。
本發明用PCR方法擴增了 JEV陜西株E基因(具體序列見SEQ ID NO. 1)，并將其 克隆到pMD18-T載體，構建了 pMD18T-E質粒。酶切pMD18T-E質粒，回收E基因。將回收的 結構蛋白基因E插入到桿狀病毒表面展示轉座載體pBacSC的p10啟動子下游，構建含JEV 的E的重組桿狀病毒轉座質粒pBacSC-E ;將構建的重組質粒轉入桿狀病毒/昆蟲表達系統 感受態大腸桿菌DH10Bac內，使其進行同源重組，并用卡那霉素、慶大霉素和四環素進行抗 性篩選。重組病毒分別經聚合酶鏈式反應(PCR)、免疫蛋白印記(western blot)、激光共聚 焦顯微鏡和免疫電子顯微鏡試驗進行檢測，篩選獲得陽性重組桿狀病毒；將篩選的陽性重 組桿狀病毒分別免疫BALB/c小鼠和豬并進行了免疫學指標的檢測。
pBacSC載體的構建過程
1. 1引物的設計
根據發表的桿狀病毒AcMNPV(GenBank :AY542374)的gp64基因組序列和綠色熒光 蛋白(eGFP)基因(GenBank :EU048697)基因組序列，設計3對特異性引物(Pl/P2、 P3/P4、 P5/P6)。
CACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTG-3' ，5'端加上Smal酶切位點；下游引
CGCGCCCATGGGCTAGCGCATGCGCATGC-3'。上游引物P3 5' -GCGCGCCCATCGCATGCTTCAGGGCTA GTGTTTGGTCATGTA-3';下游引物P4 5' -CCCGGTACCTTAATATTGTCTATTAC-3' ，5'端加上 Kpn I酶切位點。預期擴增片斷為267bp，含有GP64信號肽(SP)序列，6個組氨酸(His6) 標簽，4個多克隆位點(Bsshl、 Ncol、 Nhel、 Sphl) ， GP64跨膜區(TM)和GP64胞質區(CTD)基因。 上游引物P55' -GCTGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3 ' ，5'端加上 BamHI酶切位點。下游引物P6 5' -AAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3' ，5'端加上 HindIII酶切位點。預期擴增片斷為717bp，含有完整的綠色熒光蛋白基因(eGFP)基因。
1. 2SP-His6-四個酶切位點-TM-CTD序列(具體序列見SEQ IDNO. 2)的擴增
PCR反應體系如下10XPCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 Pl/P2， P3/P4各1 ii L、 Taq DNA多聚酶1 ii L、加水至50ii L。反應程序95 。C變性5min ;94。C lmin， 56 。C lmin， 72°C 30sec，共30個循環；最后72"延伸10min。反應結束后取10 y L PCR產物加入lyL 6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增產物。
1. 3eGFP基因的擴增 PCR反應體系如下10 X PCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 P5/P6各1 ii L、 TaqDNA多 聚酶1 y L、pEGFP-Cl質粒(BD Biosciences Clontech) 1 ii L、加水至50 ii L。反應程序95。C 變性5min ;94。C lmin，56。C lmin，72。C 2min，共30個循環;最后72"C延伸10min。反應結束 后取10 ii L PCR產物加入1 y L 6 X Loading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增產 物。 1. 4PCR產物與pFastBacTM Dual載體的連接 參照上海生工UNIQ-10膠回收試劑盒說明書回收目的基因。將eGFP基因插入載
體pFastBacTM Dual (Life Technologies)的Polyhedrin啟動子下游的多克隆位點(MCS)
的BamHI和HindIII酶切位點處。同樣方法將SP_His6_四個酶切位點-TM-CTD基因插入
到已經插入了 eGFP基因的pFastBacTM Du al載體的另外一個p10啟動子下游多克隆位點
(MCS)的Smal和Kpnl酶切位點處，從而構建成功pBacSC載體。具體的操作方法、參數都是
按照分子生物學常規方法進行。 下面敘述本發明的具體實施方法 1. JEV陜西株E基因的克隆 1. 1引物的設計 根據發表的JEV SA14標準株(GenBank :U14163)的基因組序列，設計1對特異性 引物(P1/P2)。上游引物P1 5' -GCTTCTAGAATGGGGAATCGGGATTTCATAGA AG-3' ，5'端加 上X ba I酶切位點。下游引物P2 5' -GGG GAATTCGGCATGCACATTGGTCGCTAAAAAC-3' ， 5' 端加上EcoR I酶切位點。預期擴增片斷為1500bp，含有完整E基因。
1. 2病毒基因組的提取 取出-S(TC保存的JEV陜西分離株細胞毒，按照Trizol提取試劑盒提取病毒RNA。 取RNA作模板3ii L，加入E下游引物P21 ii L、 dNTP 4ii L、 RNase-InhibitorO. 5 ii L、 AMV 0. 5iiL、5XAMV Buffer 4iiL，力口DEPC H20至20 ii L， 42°C lh，即得cDNA模板；
PCR反應體系如下IOXPCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 Pl/P2各1 ii L、 TaqDNA 多聚酶1 y L、 cDNA 6 ii L、加水至50 ii L。反應程序95。C變性5min ;94。C lmin， 56°C lmin， 72°C 2. 5min，共30個循環；最后72t:延伸10min。反應結束后取10 y L PCR產物加入lyL 6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增產物。
1. 3PCR產物的純化與回收 參照上海生工UNIQ-IO膠回收試劑盒說明書回收目的基因。
2.大腸桿菌感受態細胞的制備(氯化鈣法) 以無菌接種環刮取凍存于-7(TC冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉 素(Amp)的LB瓊脂平板，37t:培養16h左右。挑取單一菌落，接種到100mlLB培養基中， 37°C 、250r/min振搖培養到0D600 = 0. 4 0. 6，在無菌條件下將細菌培養液轉移到兩個無 菌并以冰預冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴10min，使培養物冷卻到0°C ; 4°C 、2000r/min離心10min，棄上清，以10ml用冰預冷的75,1/L CaCl2、 10mmol/L (p朋.5) 溶液重懸沉淀，冰浴10min，4°C，2000r/min離心10min，棄上清，以2ml用冰預冷的，含15% v/v、)甘油的75mmol/L CaCl2、 10mmol/L Tris *C1 (p朋.5)溶液重懸每管沉淀，用無菌吸頭 將感受態細胞分裝于無菌微量離心管中，每管200 1 ;標明菌株、體積和日期，置-7(rc冰 箱凍存備用。 3. E基因片段與pMD18-T載體的連接反應取0. 5 ii g pMD18-T載體，力n 3 5倍摩爾量的E DNA片段，2 yl 5 X連接緩沖液 加水定容至10iil，最后加入1Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16。C連接1 4h，取 7 y 1連接反應液轉化上述E co. li感受態細胞。
4.轉<七 將適量連接產物DNA(體積質粒< 1 y 1，連接產物< lOiil， DNA < 50ng)加入 200 iil上述感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min ;42。C水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min ; 加入200ii1 37t:預熱的LB培養基，37t: 150r/min振搖培養50min ;取培養液涂布于含 Amp (50 ii g/ml)的LB瓊脂平板，37。C培養14h 16h后，得到轉化菌落。
5.質粒的提取(堿裂解法) 挑取單個上述轉化菌落，接種到2ml含50 ii g/ml Amp的LB培養液(下同)中， 37°C 250r/min振搖培養12 16h ;將1. 5ml轉入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄上 清。以200 ii 1冰預冷的溶液I (50rnmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris Cl， pH8. 0 ;10mmol/L EDTA，pH8. 0)重懸沉淀，加入200 y 1新配制的溶液II (0. 2mol/L NaOH， 1% SDS)，顛倒數次 混勻，加入200 ii 1用冰預冷的溶液III (3mo1 KAc， 5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4°C 12000r/ min離心10min，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)，氯仿/異戊醇 (24 : 1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，置-2(TC 30min，4°C 12000r/min 離心10min，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌抽干。以20 yl含終濃度20 y g/ml RNA酶(無 DNA酶)的TE(10mmol/L Tri s HC1， pH8. 0， lmmol/LEDTA， pH8. O，下同)溶解沉淀，并于37t:水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-2(TC保存。
6.重組質粒pMD18T-E的酶切鑒定 將1. 0 ii g質粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18 iil ，分別加入2 3單位EcoR I和Xba I限制性內切酶及liU相應的10X限制性內切酶反應緩沖液，輕彈管壁混勻并離 心，置最適反應溫度水浴2 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。酶切結果均與預計完全相同者，即 為目的重組質粒。完全酶切后，_201:保存，以備進一步鑒定或回收片段之用。
7.攜帶JEV E基因重組桿狀病毒轉座載體質粒的構建 用Xba和EcoRI雙酶切pMD18T-E質粒，回收E基因，將其插入到同樣經過Xba I
和EcoRI雙酶切的桿狀病毒轉座載體pBacSC，進行連接反應，構建含有E基因的桿狀病毒轉
座載體pBacSC-E。具體試驗操作過程與pMD18T-E重組質粒構建相同。 8.同源重組 8. 1制備"三抗"LB平板 將高壓蒸汽滅菌后的LB液體培養基(含1.5%瓊脂粉)置超凈臺內，待其溫度 冷卻至5(TC左右時加入以下三種抗生素至終濃度為卡那霉素(Kan)50iig/mL、慶大霉素 (Gm) 7 ii g/ml和四環素(Tet) 10 y g/ml，并加入X-gal (終濃度為150 y g/mL和IPTG(終濃 度為40ii g/mL)混勻后立即鋪制平板。
8. 2轉化過程 取重組質粒pBacSC-E 10ii L(4ii g)加入100mL制備好的感受態大腸桿菌DH10Bac 管內，輕輕混勻，將離心管放入冰水混合物中冰浴30min，將離心管放入42t:熱休克2min， 再迅速移至冰水中放置5min。加入滅菌的LB液體培養基900mL， 37。C搖床200rpm/min振 蕩培養lh，加入卡那霉素(終濃度為50 ii g/mL)、慶大霉素(終濃度為7 ii g/ml)后繼續搖 床200rpm/min振蕩培養4h。 6000rpm/min離心10min，保留細菌沉淀及LB液體約300 y L， 用新鮮的LB液體培養基將其以10—、 10—2和10—3不同的稀釋度稀釋。然后各取100 ii L分別 均勻涂布于"三抗"LB平板，將平皿于37t:倒置培養24 48h，觀察藍白菌落的生長情況。
8. 3白斑鑒定 用滅菌的牙簽挑取5 10個分隔良好的白色菌落，再次接種于含"三抗"的平 板上，37t:倒置培養24h，觀察菌落表型的變化，進一步證實為白色菌落。再用滅菌牙簽挑 取6個白色菌落和2個藍色菌落，分別放入裝有6ml LB培養基的試管中，再加入卡那霉素 (Kan)50ii g/mL、慶大霉素(Gm) 7 y g/ml和四環素(Tet) 10 y g/ml，三種抗生素，37。C搖床 200rpm/min振蕩培養過夜。
8. 4重組桿狀病毒DNA的提取與制備 將上述培養菌液分裝至1. 5mL的Eppendorf管中，12000rpm/min離心lmin。棄凈 上清，加入300ii L溶液I(50mmol/L Tris-HCL pH8. 0， 1Ommol/L EDTA，滅菌備用)，重懸沉 淀。加入300iiL溶液I1(0. 2mol/L NaOH，l% SDS)，溫和顛倒混勻，置冰水浴中5min，使細 菌裂解。緩慢逐滴加入300ii L溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml， pH5. 5)，加入過程中輕微搖動，置于冰上10min。 12000r/min離心10min，同時標好另一干 凈的E卯endorf管，加入800 y L異丙醇。輕輕將上清轉移至已加好異丙醇的新管中，注意 不要吸入蛋白沉淀，將離心管顛倒數次混勻，置于室溫15min， 12000r/min離心10min，棄上 清。分別用75%和100X的乙醇各洗滌一次，14000r/min離心5min，棄上清，風干(無菌條件下)lh，溶于40 ii L TE緩沖液。 9.重組桿狀病毒DNA轉染Sf9細胞 在6孔板中每個孔中加入Sf9昆蟲細胞9X105 cells,培養基用2mL Sf900IISFM， 含有雙抗濃度為0.5X終濃度(50units/ml penicillin, 50 u g/ml str印tomycin)。細胞 來自培養3 4天的處于對數生長期的，活力大于97X細胞，并置于27t:培養箱中lh;在 這lh中準備下列實驗。取2支1. 5ml E卯endorf管標為A、 B，分別加入100 y L無抗生素 的Sf90011 SFM培養液，A管中加入5iiL的上述重組桿狀病毒DNA，混勻。B管中加入6iiL 脂質體轉染試劑Cellfectin，混勻(注意脂質體是一個油脂的懸浮物，可能會沉淀，使用前 顛倒管子5 10次，將其混均勻)。混合A管和B管，輕輕混勻，置室溫45min，使其形成 Cellfectin-DNA混合物。取已經貼壁生長良好的Sf9單層細胞，棄舊培養液，用無抗生素 的Sf90011 SFM培養液洗滌1遍。取上述Cellfectin-DNA混合物，加入O. 8ml不含抗生素 的Sf90011 SFM混合均勻。從細胞中吸棄清洗用的培養基，將混合均勻的脂質體和重組DNA 混合物鋪到細胞上，覆蓋細胞，放置28t:培養6h后。吸棄混合物，加入含抗生素的Sf90011 SFM培養液繼續培養，每天觀察細胞形態表現。收集細胞用于表達蛋白的分析，同時收集培 養上清作為原毒種，分小管貯存于-201:，用于重新感染Sf9細胞。
10重組桿狀病毒BacSC-E的PCR鑒定 取病毒的細胞培養物2mL，反復凍融3次，12000r/min離心15min，取上清 437. 5ii L，加入12. 5ii L蛋白酶K(20mg/mL)和50 ii L SDS液(10% ) ，37。C水浴30min ;等 體積酚/氯仿抽提一次，取上清；等體積氯仿復提，取上清；加入l/10體積NaAc(2mol/L)和 2倍體積無水乙醇，-20。C放置2h ;4。C 15000r/min離心15min，取沉淀；70%乙醇洗滌一次， 沉淀用30iiL TE溶液溶解，即為提取的DNA，-70。C保存備用。PCR時取5yL即可。PCR反 應條件為95。C預變性5min后，按95。C變性lmin，54。C退火lmin，72。C延伸2min共30個循 環，最后72t:延伸10min。
11.重組桿狀病毒量的放大與濃縮 懸浮培養昆蟲細胞待細胞濃度達lX106cell/ml，以MOI = 1 (Multiplicity ofinfection，MOI)的重組桿狀病毒量感染昆蟲細胞，利用病毒會在宿主昆蟲細胞中復制達 到病毒量放大的目的。感染3 4天后離心除去細胞及細胞碎片，收集上清液即完成病毒 量的放大。 12.重組病毒表達產物的檢測
12. 1熒光顯微鏡觀察鑒定重組病毒 重組pBacSC-E轉座載體上帶有eGFP基因，可以表達綠色熒光蛋白，可以通過熒光 顯微鏡觀察發出熒光的細胞數量來確認轉染陽性細胞。轉染后48h后細胞呈現明顯的CPE 變化，轉染細胞出現熒光(見附圖2)，產生了具有感染活性的重組桿狀病毒BacSC-E。
12. 2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 將擴增后的純化重組病毒BacSC-E，以10M0I分別接種于10ml培養瓶1 X 106個/ ml Sf9細胞中，同時設桿狀病毒陰性對照組和細胞對照，至75X細胞出現明顯病變時，棄培 養液，用lml的TEN(40mmol/L Tris *C1 pH7. 5， lmmol/L EDTA， 150mmol/L NaCl)洗脫細胞， 收集于E卯endorf管中，3000r/min離心5min，棄上清，細胞沉淀用PBS洗3次，加60 yl裂 解緩沖液(10mmol/LTris Cl， pH7. 4， lmmol/L MgC12，0. 5% NP40， 20 ii g/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min， 5000r/min離心5min， -20。C凍存。 取30iil細胞裂解液與等量2X樣品緩沖液(100mmol/L Tris Cl，p朋.8，4% SDS， 0. 2 %溴酚藍，20 %甘油，使用前加入2. 5 % 13 -巰基乙醇)混勻，于10 %凝膠進行SDS-PAGE 電泳。 12. 3免疫印跡(Western blot) 經SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂乳或3%牛 血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tri s Cl， pH7. 5， 150,1/L NaCl， 0. 05% Tween20) 37°C 封閉2h，洗滌緩沖液(1Ommol/L Tris Cl pH7. 5， 150mmol/LNaCl，0. 05 % Tween20)洗 滌3次，每次5 10min，將豬抗JEV陽性血清用封閉緩沖液稀釋(1 : 300)覆蓋膜上，室 溫感作2h，洗滌3 5次，辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG(1 : 4000)室溫感作2h，洗 滌3 5次后，每次5 10min，最后用蒸餾水清洗一次，夾出硝酸纖維素膜稍晾干，配制 ECL(enhancedchemiluminescence)工作液，在可見光下室溫孵育膜數分鐘，將印跡膜用保 鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數秒到數分 鐘，顯影定影后蛋白質條帶可清晰顯示在X光膠片上。
12. 4激光共軛聚焦顯微鏡分析 在6孔培養板中放入無菌載玻片，Sf9細胞先接種于無菌之載玻片上，細胞接入量 為每孔加入1X106。細胞吸附lh后，吸棄培養基，加入重組桿狀病毒BacSC-E在MOI = 10 下感染。2天后吸棄培養基，再添加lml甲醇丙酮(1 : 1)混合液于-2(TC冰箱下固定5 分鐘，之后再加入lml PBS(phosphate-bufferedsaline)搖床轉速50r/min清洗2次，每次 5min。接著以lml的2% BSA(bovinese進26 albumin)在37。C下反應30min。之后再加 入lmlPBS(phosphate-buffered saline)搖床轉速50r/min清洗2次，每次5min。接下來 分別加入豬抗JEV陽性血清(1 : 100)在37t:下反應lh。以lml的PBS清洗3次后，再加 入FITC標記的羊抗豬IgG(l : 100)37t:下反應lh。最后再以lml的PBS清洗3次。在激 光共軛焦顯微鏡(confocal microscope, TCS SP2， Leica， Germany)下觀察，帶有E重組蛋 白質細胞膜會被FITC染色而呈現綠色熒光。
12. 5免疫電子顯微鏡檢測 取15iU純化的昆蟲桿狀病毒液滴于蠟板上，將封有炭膜的銅網有炭膜的一面向 下懸浮在昆蟲桿狀病毒液面上，吸附30min。滴入含有1% BSA的PBS液1滴于蠟板上，將 銅網有炭膜的一面輕浮于液滴上室溫封阻20min，然后用PBS液洗滌3次，每次5min。洗 滌的方法和封阻的方法相同，用濾紙在網緣將水吸干。將銅網分別浮于豬抗JEV陽性血清 (1 : 50)液滴上(大約15iU)，室溫30 60min.同時設立陰性對照組，不加第一抗體，用 PBS代替。PBS漂洗洗3次，每次5min，濾紙吸干。將銅網懸浮于膠體金標記的羊抗豬IgG 第二抗體液滴上(1 : 50倍稀釋)，室溫孵育30 60min。 PBS漂洗洗3次，每次5min，濾 紙吸干。將銅網懸浮在2%的磷鴇酸液滴上負染2min，在室溫干燥，電鏡觀察。
13.重組病毒BacSC-E表達產物的檢測結果 篩選獲得的重組桿狀病毒BacSC-E接種Sf9昆蟲細胞后，在感染細胞的細胞膜處， 可觀察到特異的一圈黃綠色熒光，說明表達產物是特異的而且表達產物展示在Sf-9昆蟲 細胞的細胞膜上(見附圖3)。經Western blot分析，重組毒接種的細胞培養物出現了與豬 抗JEV陽性血清結合的大小為53kD的特異帶(見附圖4)，證明了 E蛋白在Sf9昆蟲細胞中得到了表達。重組毒pBacSC-E免疫電子顯微鏡檢測到與豬抗JEV陽性血清結合的金粒子，并且金粒子位置在重組病毒膨大的囊膜蛋白處，表明E蛋白被展示在桿狀病毒的囊膜上(見附圖5)。 14.重組病毒的免疫原性研究
14. 1重組病毒免疫小鼠 重組病毒接種Sf9昆蟲細胞，培養48 72h，收取感染細胞。_40°C /37。C反復凍融3次，3000r/min離心10min，取上清測定病毒PFU，調整病毒的滴度使其達到109PFU/ml。
BALB/c雌性小鼠12只，體重18 20g，隨機分2組，采取腹腔注射方式，分別注射重組桿狀病毒BacSC-E和不含E基因的桿狀病毒BacSC 0. 5ml。上述2組均免疫二次，間隔14天，最后一次免疫后的第14天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，凝血分離血清供ELISA檢測抗JEV抗原的IgG抗體以及進行中和試驗檢測免疫小鼠的血清中和抗體滴度。無菌取其脾臟分別進行T淋巴細胞增值試驗和用流式細胞儀分析檢測T淋巴細胞亞類的數量。
14. 2脾臟免疫學指標的檢測
14. 2. 1脾臟單淋巴細胞懸液制備 頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI 1640培養基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龍網過濾制成單細胞懸液，1500r/min，離心5min，棄上清。用Hanks液離心洗細胞兩次，重懸于含10% NBS的RPMI 1640培養液中，計數，調至2 X 107個/ml備用。 14. 2. 2脾T淋巴細胞亞類數量的檢測 取脾細胞懸液0. lml，加5ml PBS， 1500r/min，離心10min，洗細胞兩次，在0. 5mlPBS細胞懸浮液中分別加熒光標記大鼠抗小鼠CD4+和CD8+單克隆抗體(此抗體用PBS按1 : 10稀釋)室溫避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min離心10min，將管底細胞用200 iil PBS懸浮，待上流式細胞儀檢測。FACS檢測10000個細胞，所得數據進行統計學處理。 14. 2. 3T淋巴細胞增值試驗 (1)脾細胞的制備將小鼠捕殺、采血、取脾、研磨、過濾，最后一次用Hank' s液洗滌，棄上清，再用含有10%犢牛血清的1640培養液lml重懸脾細胞，調整細胞濃度至2 X 106個/ml。 (2)在96孔板中每孔加入淋巴細胞懸液100 ii 1，對應孔中分別加入特異性剌激原ConA(lO ii g/ml) 100 y 1作為陽性對照組、20 y g/ml重組桿狀病毒特異性剌激原100 yl為試驗組以及1640培養基100 ii 1為非剌激抗原孔，不同剌激原重復3個孔；以只加200 ii 11640培養基無淋巴細胞的孔作為本底。 (3)68h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20iil，避光培養4h ;每孔吸棄100 yl培養液，再加入匿SO 100iil，10min內用酶聯免疫檢測儀630nm測定個孔0D值。
(4)結果計算SI =(特異剌激原的平均OD值-本底值)/(非剌激原的平均OD值_本底值) 14. 3ELISA測定免疫小鼠血清中抗JEV抗體 ELISA試劑盒中的包被抗原為滅活的全病毒，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體。在酶聯免疫儀450nm測量各孔OD值。
14. 4重組病毒在本體動物豬的免疫學研究
同小鼠的免疫學和檢測方法。
檢測結果 獲得的重組桿狀病毒BacSC-E提取基因組后進行PCR擴增，得預期大小的目的片段。激光共聚焦顯微鏡觀察試驗、免疫金電子顯微鏡觀察和Westernblot檢測均為陽性結果，說明構建的重組桿狀病毒BacSC-E可分別表達JEV糖蛋白E囊膜蛋白。重組桿狀病毒BacSC-E可在昆蟲細胞中表達，且重組病毒具有良好的遺傳穩定性。將重組桿狀病毒BacSC-E大量擴增后進行小鼠免疫實驗，可在免疫小鼠血清中檢測到抗JEV的抗體，表明重組病毒BacSC-E剌激小鼠機體產生了特異性體液免疫。免疫小鼠脾T細胞亞類數量的檢測及淋巴細胞增殖試驗結果均顯示小鼠產生了特異性細胞免疫。 研究結果表明，本發明所構建的重組桿狀病毒是一種安全、有效的基因工程亞單位疫苗，具有開發成為用于預防JE的疫苗的良好前景。 以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例，本發明的保護范圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明的保護范圍之內。本發明的保護范圍以權利要求書為準。
權利要求
一種表達JEV免疫原基因的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒帶有SEQ ID NO.1所示的序列。
2. 根據權利要求l所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒表面展示JEV 結構蛋白E。
3. —種權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟包括a、 制備E基因；b、 將上述的E基因，插入到桿狀病毒表面展示轉座載體pBacSC的p10啟動子下游，構 建含JEV的E基因的重組桿狀病毒轉座質粒pBacSC-E ;c、 將上述重組桿狀病毒轉座質粒pBacSC-E轉入大腸桿菌內進行同源重組，得重組桿 狀病毒DNA ; d、 將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉染昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒。
4. 根據權利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，所述E基因的制備方 法為用PCR方法擴增了 JEV陜西株E基因，并將其克隆到pMD18-T載體，構建了 pMD18T-E 質粒，酶切pMD18T-E質粒，回收E基因。
5. 根據權利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟d所述重組桿狀 病毒DNA轉染昆蟲細胞的方法為將重組桿狀病毒DNA通過脂質體介導方法轉入昆蟲細胞 中。
6. 根據權利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟c所述大腸桿菌 為感受態大腸桿菌DH10Bac。
7. 如權利要求1或2所述的重組桿狀病毒在制備預防豬乙型腦炎的疫苗中的應用。
8. —種制備預防豬乙型腦炎的亞單位疫苗的方法，其特征在于，重組病毒接種昆蟲細 胞，培養48 72h，收取感染細胞，-40°C /37t:凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調整病毒 的滴度使其達到109PFU/ml。
9. 根據權利要 8所述的方法，其特征在于，所述昆蟲細胞為Sf9昆蟲細胞。
全文摘要
本發明公開了一種表達JEV免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備方法和應用。具體地說涉及一種重組桿狀病毒，所述重組桿狀病毒帶有SEQ ID NO.1所示的序列，其表面展示JEV結構蛋白E。利用所述重組病毒接種Sf9昆蟲細胞，培養48～72h，收取感染細胞，-40℃/37℃凍融，離心，取上清測定病毒PFU，調整病毒的滴度使其達到109PFU/ml，制得一種安全、有效的基因工程亞單位疫苗，用于預防豬日本乙型腦炎。
文檔編號A61P25/00GK101792741SQ20101014079
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月7日 優先權日2010年4月7日
發明者張琪, 童德文, 許信剛 申請人:西北農林科技大學