專利名稱：基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法
技術領域：
本發明屬于基因技術，具體涉及一種制備重組人神經生長因子的方法。
背景技術：
神經生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是最早發現和最典型的神經營養因 子，同時也是神經系統中最重要的生物活性分子之一，它對中樞及周圍神經元的發育、分 化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用，可影響外周和中樞神經系統某些 神經元的存活和分化，對保護神經系統的正常功能有重要作用，目前NGF已被開發成治療 外周神經損傷的藥物應用于臨床，廣泛應用于神經損傷、偏癱、卒中、顱腦損傷、小兒腦癱等 神經性疾病領域。然而，天然的NGF含量極低，給分離純化帶來相當的困難。迄今為止已批準上市使 用的神經生長因子均為從小鼠頌下腺中分離純化的鼠源性的神經生長因子。雖然這類產品 中的鼠源性NGF與人體NGF的結構具有高度的同源性，生物效應也無明顯的種間特異性，但 是鼠源性蛋白制品不論在化學結構上還是空間結構上都有別于人源性蛋白制品，且對人來 說，動物源性的蛋白常常具有較高的免疫原性，容易引起人體內的抗原反應，嚴重者甚至會 危及生命。
發明內容
本發明的目的在于提供一種基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子 的制備方法，實現NGF的安全的大量的制備。本發明的技術方案為基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備 方法，其步驟是(1)將編碼人神經生長因子的基因可操作地連接于表達載體Bacmid，構建表達人 神經生長因子的重組表達載體；(2)所述重組表達載體轉染昆蟲細胞，收獲重組病毒顆粒，構建表達人神經生長因 子的昆蟲表達系統；(3)培養昆蟲細胞，并用重組病毒感染，獲得大量重組人神經生長因子。所述步驟(1)的方法是(1. 1)將人神經生長因子基因片段用BamHI、HindIII雙酶切后插入 pFastBac Dual質粒，構建pFastBac Dual+[rh β -NGF]重組質粒，轉化大腸桿菌JM109菌 株，篩選重組子，提取pFastBacTMDual+[rh β -NGF]重組質粒，經PCR與酶切鑒定插入正確 后，測序驗證其序列正確性；(1. 2)將上述鑒定正確的pFastBac Dual+[rh β -NGF]質粒轉化含有Bacmid質粒 的大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，挑取陽性克隆，獲取含重組人神經生長因子基因的穿梭 質粒Bacmid+[rh β -NGF]，經PCR鑒定后再經測序驗證其序列正確性；
所述人神經生長因子基因片段是ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACTCAGAGAG CAATGTCCCTGCAGGACACCATCCCCCAAGCCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACTGCCCTTCGCAGA GCCCGCAGCGCCCCGGCAGCGGCGATAGCTGCACGCGTGGCGGGGCAGACCCGCAACATTACTGTGGACCCAGGCTG TTTAAAAAGCGGCGACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACTCAGGA TCTGGACTTCGAGGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCATCCCATCCCA TCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATC AAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAA GTGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGA CTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCAGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTG TGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA氨基酸序列是MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSTDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRN ITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSWV⑶KT TATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRI DTACYCVLSRKAVRRA-所述構建pFastBac Dual+[rh β -NGF]重組質粒的方法是在構建pFastBac Dual 質粒后，利用T4DNA Iigase連接構建得到pFastBac Dual+[rh β-NGF]重組質粒。所述步驟(2)的方法是(2. 1)取對數生長期的昆蟲細胞sf9，用含rhi3 -NGF的穿梭質粒Bacmid和脂質體 轉染試劑cellfectioMOOO混合進行轉染；(2. 2)轉染后的sf9細胞因Bacmid+[rhi3-NGF]質粒的表達而產生昆蟲病毒顆粒， 并使sf9細胞裂解；(2. 3)收獲細胞培養上清，其中含有攜帶重組人神經生長因子的昆蟲桿狀病毒顆 粒及少量重組人神經生長因子。所述步驟(1. 1)中含有重組人神經生長因子的重組質粒的制備步驟包括1. 1. 1)以下述合成的核苷酸序列為引物引物 1:5' CAGCGGATCCATGTCCATGTTGTTCTACAC 3'引物 2 5 ‘ GCTCAAGCTTCTAGATCAGGCTCTTCTCAC 3 ‘以從人血白細胞中提取的RNA為模板，RT-PCR擴增；1. 1.2)從獲得RT-PCR產物中回收合成的人神經生長因子基因片段，插入載體 pFastBac Dual，獲得含有人神經生長因子的重組質粒pFastBac Dual+[rh β -NGF]。本發明構建的含有人神經生長因子的表達載體Bacmid+[rhi3-NGF]，其本質為重 組的昆蟲桿狀病毒基因組，用該質粒轉染昆蟲細胞后，外源基因能隨著病毒外殼蛋白的表 達而表達。表達出的含有信號肽的重組人神經生長因子能在昆蟲細胞內完成加工修飾和正 確折疊，并被釋放到細胞外；本發明提供了一種用昆蟲桿狀病毒表達系統制備重組人神經生長因子的新方法， 它與其他表達系統相比，如大腸桿菌表達系統和真核細胞表達系統比較具有以下優點表達產率高；
表達產物的翻譯后加工與高等生物相似，可使蛋白產物保持天然結構、生物活性 和免疫活性；可同時表達多個外源蛋白，來源遍及動物、植物、細菌、真菌和病毒；桿狀病毒能容納較大的外源基因而不至于影響其本身的增殖；蛋白產物易從無血清的培養上清中純化，無內毒素污染；生物安全性高，對植物和脊椎動物均無致病性。上述優勢使本發明具有明顯的技術創新性和工藝先進性，能工業化生產重組人神 經生長因子。按照本發明的表達系統和方法可以制備得到純度大于98%，生物比活性高于 500000AU/mg的重組人神經生長因子。
圖1為含有人神經生長因子的昆蟲桿狀病毒表達載體Bacmid+[rh β -NGF]構建及 結構圖。圖2為本發明獲得的重組人神經生長因子SDS-PAGE電泳圖，其中M為低分子量標 準蛋白，1泳道為純化后的rhi3 -NGF，2泳道為感染的昆蟲細胞上清；圖3 圖6為本發明獲得的重組人神經生長因子誘導雞胚背神經節生長情況照 片。其中圖3是樣品稀釋7500倍，約6ng/ml (++++)；圖4是樣品稀釋11250倍，約4ng/ ml (++++)；圖5是樣品稀釋15000倍，約3ng/ml (+++)；圖6是鼠頌下腺神經生長因子參考 品稀釋500倍，約2U/ml (+++)。
具體實施例方式本發明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品，各種試劑和培養基的成 分和配制方法可參見常規實驗手冊中的操作。重組人神經生長因子昆蟲桿狀病毒表達系統的構建與表達l.rh β-NGF 基因的獲取1. 1人血白細胞總RNA的提取方法按常規提取方法進行1)取枸櫞酸鈉抗凝血，離心沉淀白細胞；2)向約7Χ IO6個細胞EP管內加入 Trizol ImL,輕輕混勻后，靜置5min,加入0. 2mL氯仿，用力震蕩15s 30s，靜置冰上3min， 4°C, 12000轉/min，15min ；3)吸上層水相于另一 EP管，加等體積異丙醇，上下顛倒幾次混 勻，震蕩混勻，室溫放置15min,4°C, 12000轉/min, IOmin ；4)棄上清，加入0. 3mL75%乙醇 (DEPC水配制)洗滌RNA沉淀，4°C，7500轉/min，5min。棄上清，空氣干燥RNA，加入25ul DEPC 水溶 RNA。2) RT-PCR 擴增 rh β -NGF 的 cDNA1)以Oligo (dT)為引物逆轉錄合成rhi3 -NGF片段基因的cDNA第一鏈2)逆轉錄后進行PCR擴增rh β -NGF雙鏈cDNA利用引物1，引物2進行PCR擴增rh β -NGF片段基因，擴增條件為94°C變性30 秒，55°C退火50秒，72°C延伸40秒，共進行30個循環；引物 1 5 ‘ CAGCGGATCCATGTCCATGTTGTTCTACAC3 ‘
引物 2 5 ‘ GCTCAAGCTTCTAGATCAGGCTCTTCTCAC3 ‘3) 1 %瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，得到純化的rh β -NGF基因片段。2.表達質粒 Bacmid+[rh0_NGF]的構建2. Irh β -NGF 基因插入 pFastBac Dual 質粒將純化的rh β -NGF基因片段用BamHI、HindIII雙酶切后插入pFastBac Dual 質粒，并用T4DNA Iigase連接構建pFastBacTMDual+[rh β -NGF]重組質粒，轉化大腸桿菌 JM109菌株，在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養基上37°C培養篩選重組子，經PCR與 酶切鑒定正確后，測序；2. 2將上述鑒定正確的pFastBac Dual+[rh β -NGF]質粒轉化DHlOBac感受態細 胞，此時pFastBac Dual+[rh β -NGF]質粒能與DHlOBac內的穿梭質粒Bacmid發生位點特 異性轉座，從而獲得含有rh β -NGF的表達質粒Bacmid+[rh β -NGF]，經PCR鑒定后再測序。Bacmid+[rh3-NGF]質粒結構圖見圖 1。3.昆蟲桿狀病毒表達系統的構建及表達用含8%胎牛血清的Grace’ s培養基于27°C無二氧化碳的環境中培養Sf9細胞， 2-3d更換一次培養液，待細胞生長至對數期，用BaCmid+[rhi3 -NGF]質粒和脂質體轉染試 劑cellfectioMOOO混合進行轉染，具體操作按脂質體說明書進行。轉染后的sf9細胞因 Bacmid+[rh β-NGF]質粒的表達而產生昆蟲病毒顆粒，并使sf9細胞裂解；收獲細胞培養上 清，其中含有攜帶重組人神經生長因子的昆蟲桿狀病毒顆粒及少量重組人神經生長因子； 再用上述上清反復感染sf9細胞獲取第三批感染的上清(P3)，檢測病毒滴度；用P3感染在 昆蟲無血清培養基中生長的sf9細胞，5天后，收獲培養上清，其中含有大量重組人神經生 長因子。如圖2所示。重組人神經生長因子的分離純化制備取收集的培養上清1000ml，于4°C 8000rpm離心lOmin，雙層綢布過濾，濾液用截留 分子量為3k Da的超濾膜超濾濃縮約5 6倍；濃縮物上樣預先用20mM PB(pH7. 1)平衡好 的CM-S印haroseF. F柱，上樣完畢以平衡液流洗至基線走平，以0. IM NaCl-20mMPB (pH7. 1) 洗脫雜蛋白，0.4M NaCl-20mM PB(pH7. 1)洗脫收集目的物，將該洗脫物用截留分子量為 3k Da的超濾膜超濾濃縮至約20ml，上樣預先用0. 15M NaCl-20mM PB(pH7. 1)平衡好的 Sephacryl SlOO柱，以平衡液洗脫收集目標峰，即為純化的rh β NGF樣品，總蛋白含量為 8. Img0經還原性SDS-PAGE電泳檢測為單一條帶；以中國藥品生物制品檢定所分發的鼠頌 下腺神經生長因子參考品為參照，采用雞胚背根神經節培養法檢測該樣品生物活性，結果 顯示比活性為666666. 7AU/mg。如圖3 圖6所示。
權利要求
一種基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法，其步驟是(1)將編碼人神經生長因子的基因可操作地連接于表達載體Bacmid，構建表達人神經生長因子的重組表達載體；(2)所述重組表達載體轉染昆蟲細胞，收獲重組病毒顆粒，構建表達人神經生長因子的昆蟲表達系統；(3)培養昆蟲細胞，并用重組病毒感染，獲得大量重組人神經生長因子。
2.如權利要求1所述基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法， 其特征是所述步驟(1)的方法是(1. 1)將人神經生長因子基因片段用BamHI、HindIII雙酶切后插入pFastBac Dual質 粒，構建pFastBacTMDual+[rh β -NGF]重組質粒，轉化大腸桿菌JM109菌株，篩選重組子，提 取pFastBacTMDual+[rh β -NGF]重組質粒，經PCR與酶切鑒定插入正確后，測序驗證其序列 正確性；(1. 2)將上述鑒定正確的pFastBacTMDual+[rh β -NGF]質粒轉化含有Bacmid質粒的大 腸桿菌DHlOBac感受態細胞，挑取陽性克隆，獲取含重組人神經生長因子基因的穿梭質粒 Bacmid+[rh β -NGF]，經PCR鑒定后再經測序驗證其序列正確性；所述人神經生長因子基因片段是ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACACTCAGAGAGC AATGTCCCTGCAGGACACACCATCCCCCAAGCCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACTGCCCTTCGCAG AGCCCGCAGCGCCCCGGCAGCGGCGATAGCTGCACGCGTGGCGGGGCAGACCCGCAACATTACTGTGGACCCCAGGC TGTTTAAAAAGCGGCGACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACTCAG GATCTGGACTTCGAGGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCCCATCCCAT CTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATCA AGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAAG TGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGAC TCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTG TGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA氨基酸序列是MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARYAGQTRNITY DPRLFKKRRLRSPRYLFSTQPPREAADTQDLDFEYGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSYCDSVSYWY⑶KTTA DIKGKEVMVLGEYNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWBSTCTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTA CYCYLSRKAYRRA-
3.如權利要求2所述基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法， 其特征是構建pFastBac Dual+[rh0-NGF]重組質粒的方法是在構建pFastBac Dual質 粒后，利用T4DNA Iigase連接構建得到pFastBac Dual+[rh β-NGF]重組質粒。
4.如權利要求1所述基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法， 其特征是所述步驟(2)的方法是(2. 1)取對數生長期的昆蟲細胞sf9，用含rhi3-NGF的穿梭質粒Bacmid和脂質體轉染 試劑cellfection2000混合進行轉染；(2. 2)轉染后的sf9細胞因Bacmid+[rhi3-NGF]質粒的表達而產生昆蟲病毒顆粒，并使sf9細胞裂解；(2. 3)收獲細胞培養上清，其中含有攜帶重組人神經生長因子的昆蟲桿狀病毒顆粒及 少量重組人神經生長因子。
全文摘要
本發明公開了一種基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法。它是人神經生長因子的基因連接于表達載體Bacmid，構建表達人神經生長因子的重組表達載體；將重組表達載體轉染昆蟲細胞，收獲重組病毒顆粒，構建表達人神經生長因子的昆蟲表達系統；再培養昆蟲細胞，并用重組病毒感染，獲得大量重組人神經生長因子。該方法能工業化生產重組人神經生長因子。按照本發明的表達系統和方法可以制備得到純度大于98％，生物比活性高于500000AU/mg的重組人神經生長因子。
文檔編號C12N15/866GK101906423SQ20101023505
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者李佳楠, 湯華東 申請人:江漢大學;武漢海特生物制藥股份有限公司