白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系及其制備方法

專利名稱：白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系及其制備方法
技術領域：
本發明涉及血栓防治藥物領域，尤其涉及一種白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖 溶酶原激活物基因靶向體系及其制備方法。
背景技術：
在正常生理情況下，凝血_抗凝和纖溶_抗纖溶機制互相平衡，保證血液在體內正 常流動，既不形成血栓，也不至于出血。血栓形成與血栓溶解機制的失衡使得血栓不適當地 形成或者形成后不能被有效清除，導致組織或器官缺血/壞死；另一方面，抗凝/纖溶過度 也會導致出血的發生。tPA (tissue-type Plasminogen Activator, tPA)是纖溶系統主要激活因子，是機 體重要的抗凝成分。它由血管內皮細胞合成，在各種刺激尤其是纖維蛋白的作用下釋放入 血，作用于血漿素原使其轉換為血漿素促進纖維蛋白降解。自tPA的cDNA克隆成功，人們 已能夠構建其逆轉錄病毒載體并在體外轉導內皮細胞獲得tPA蛋白的高表達。動物實驗證 實，將這種轉導的內皮細胞貼附于球囊支架表面或動脈橋吻合口可防止支架術后或血管搭 橋術后血栓形成和再狹窄的發生，明顯提高手術的遠期效果。人重組tPA作為生物制劑已 應用于冠心病急性心肌梗塞、腦栓塞、肺梗塞等的溶栓治療并取得了顯效，但由于價格昂貴 未能廣泛應用。白蛋白是近年來研究較多的一種納米材料，它的生物相容性好，生物可降解，無免 疫源性和細胞毒性，基因轉移效率較高。由于它有精確的納米結構和表面與內部可攜帶分 子的特性，使之成為一個很好的DNA導入細胞的載體。基因導入體內的方式多為將目的基因直接注射于靶組織，如心血管疾病多采用心 肌內直接注射或心導管注入質粒DNA或腺病毒載體。中國發明專利CN200610033187. 0公 開了一種基因縫線，該縫線為載有高表達tPA基因質粒的外科滌綸縫線，將該基因縫線直 接縫合于心肌組織，可消除或避免凝血塊的形成。中國發明專利CN200910106773. 7公開了 用殼聚糖做原料制備了納米tPA基因載體并直接注射于心肌均獲得tPA的有效表達。但上 述兩專利記載的方法存在有創性，限制其臨床應用。

發明內容
為解決上述問題，本發明的目的在于提供一種安全、有效、無創的白蛋白納米-超 聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系。本發明的第二個目的在于提供一種制備白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶 原激活物基因靶向體系的方法。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案一種白蛋白納米-超聲微泡載組織 型纖溶酶原激活物基因靶向體系，包括載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒和蔗糖白蛋白超 聲微泡。
所述重組tPA基因質粒含有重組tPA基因、啟動子、終止子和篩選標記基因表達
品.o所述重組tPA基因由1686個堿基組成，其堿基序列如SEQ ID :N0. 1所示。所述白蛋白為牛血清白蛋白。靶向體系中蔗糖白蛋白超聲微泡含量為0.8-1. 8X109個/ml，重組tPA基因質粒 含量為 o. l-o. 3mg/ml。白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系的制備方法，包括 以下步驟1)制備載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒；2)制備蔗糖白蛋白超聲微泡；3)用載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒和蔗糖白蛋白超聲微泡制備白蛋白納 米_超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系。步驟1)具體為將重組tPA基因質粒加入牛血清白蛋白溶液中孵育后，在超聲場的 存在下滴入乙醇水溶液，直至溶液出現乳白色并逐滴滴入0.5%的戊二醛溶液，攪拌，室溫 下靜置，得到載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒。步驟2)具體為無菌制備含蔗糖的牛血清白蛋白液體，并置于容器中，依次用氧氣 和氟碳氣體飽和液體，超聲波發生器處理，得到氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超聲微泡。步驟3)具體為步驟1)制備的白蛋白納米粒加至步驟2)制備的白蛋白微泡中，加 入戊二醛，4°C下孵育進行交聯，用生理鹽水洗滌、離心、分層，上浮泡沫懸液即為白蛋白納 米_超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系。本發明構建重組tPA基因質粒并選擇白蛋白納米粒和超聲微泡為載體，將其轉導 機體細胞獲得有效和持續tPA的產生，可達到長期抗凝和防止血栓形成的作用，且安全、無 創； 本發明采用一步法制備載基因白蛋白納米粒，這種方法將質粒物理包裹于白蛋白 納米粒中，其主要優點是攜帶被轉基因量較高；藥物緩釋和轉基因時間較長；具有較好的 酶保護和防止體內DNA酶降解作用；容易設計成靶向載體，應用于體內研究或制備成納米 藥物應用更具優越性；本發明在制備超聲微泡過程中在白蛋白液體中加入10%蔗糖，避免蔗糖白蛋白液 體粘滯性強，制備時超聲困難且所需能量較大的問題，且微泡穩定性良好；含全氟碳的微泡同時加有少量氧氣會進一步促進微泡在血液中的穩定性，從而取 得更強的心肌顯影效果；采用超聲觸發破壞白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體 系，可使載有基因質粒的白蛋白納米粒靶向定位釋放和靶基因的表達增強，這種方法是一 種簡易有效的靶向納米基因轉移新技術。


圖1是重組tPA基因質粒pSeCTag2B-tPA構建流程圖；圖2是載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒ZetasizerfOOO儀粒度分析結果圖；圖3是瓊脂糖凝膠電泳DNA阻滯實驗和DNA酶保護實驗結果4
圖4是白蛋白超聲微泡與白蛋白納米粒交聯后普通光學顯微鏡下400倍放大圖；圖5是超聲波靶向治療前后心臟超聲影像學改變圖，A輸入微泡前；B輸入微泡后 心臟顯影增強；C超聲波治療后；圖6是超聲波靶向治療前后肝臟超聲影像學改變圖，A輸入微泡前；B輸入微泡后 肝臟顯影增強；C超聲波治療后；圖7是超聲靶向轉基因的心肌組織心肌細胞增大圖，胞漿紅染，HE 200X ；圖8是超聲靶向轉基因的骨骼肌組織肌細胞肥大圖，胞漿紅染，細胞核增多，HE 200 X ；圖9A是對照組心肌組織tPA抗體陰性反應免疫組化結果圖，圖9B實驗組心肌組 織tPA抗體陽性反應免疫組化結果圖，200X ；圖10A是對照組心肌組織tPA抗體陰性反應免疫組化結果圖，圖10B是實驗組心 肌組織tPA抗體陽性反應免疫組化結果圖，免疫組化200X ；圖11是實驗組肝細胞tPA抗體陽性反應免疫組化結果圖，400X ；圖12是實驗組肋軟骨基層軟骨細胞tPA抗體陽性反應免疫組化結果圖，400X ；圖13是實驗組骨髓細胞tPA抗體陽性反應免疫組化結果圖，400X。
具體實施例方式本發明白蛋白納米_超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系制備方法 主要包括以下步驟1、構建重組tPA基因質粒pSeCTag2B-tPA，下述實施例1會詳細說明；2、采用上述重組tPA基因質粒和白蛋白，進行白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖 溶酶原激活物基因靶向體系的制備，下述實施例2會詳細說明。實施例1重組tPA基因質粒PSecTag2B-tPA的制備1、主要試劑A、質粒pSecTag2B，購自美國Invitrogen生物公司，B、感受態細胞 E. Coli JM109，購自 Promega 公司，C、限制性內切酶Hindi 11，Kpnl，BamHI和Xhol，購自寶生物工程有限公司，D、T4-DNA 連接酶，購自 New England Biolabs 公司，E、QIAquick Gel Extraction Kit、QIAGEN PCR ProductPurification Kit，購自 QIAGEN 公司。2、方法人工合成三個EST:tPA-l 如 SEQ ID NO. 2 所示、tPA_2 如 SEQ ID NO. 3 所示和 tPA_3 如SEQ ID NO. 4所示，分別連接克隆載體，制備成質粒p0TB6、p0TB7和pCMV_SP0RT6。采用三對引物tPA-lF(SEQ ID NO. 5)和 tPA_lR(SEQ ID NO. 6)、tPA_2F(SEQ ID NO. 7)和 tPA-2R(SEQ ID NO. 8)、tPA-3F (SEQ ID NO. 9)和 tPA_3R(SEQ ID NO. 10)分別擴 增上面描述的所述質粒p0TB6、p0TB7和pCMV_SP0RT6，擴增tPA_l和tPA_3的PCR程序為 94°C預變性 4min，94°C 45sec，55°C 45sec，72°C lmin，共 25 個循環，最后 72°C延伸 5min ；擴 增 tPA-2 的 PCR 程序為94°C預變性 4min，94°C 45sec，60°C 45sec，72°C lmin，共 25 個循 環，最后72°C延伸5min。
將所得產物經QIAGEN PCR Product Purification Kit純化后分別用三對限制 性內切酶Hindlll和Kpnl、Kpnl和BamHI、BamHI和Xhol進行消化，同時用限制性內切酶 Hindlll 和Xhol 消化質粒pSecTag 2B，純化方法見QIAGEN PCR Product Purification Kit 說明書。將上述酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，QIAquick Gel ExtractionKit回收目的 DNA片段，純化方法見QIAquick Gel Extraction Kit說明書，用T4-DNA連接酶連接上述收 回產物，構建出重組tPA基因質粒pSeCTag2B-tPA，構建流程見圖1。實施例2白蛋白納米_超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系的制備利用實施例1制得的重組tPA基因質粒pSeCTag2B-tPA和白蛋白制備白蛋白納 米_超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系，包括以下步驟1、一步法制備載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒，具體為100mg牛血清白蛋白 加入5ml雙蒸水溶解，用0. IN HCI調整pH值至5. 5。將已構建的lmg重組tPA基因質粒 加入上述白蛋白溶液中，孵育30min后在超聲場的存在下緩慢滴入乙醇水溶液(乙醇水 =2 1)，直至溶液出現乳白色并逐滴滴入0.5%的戊二醛溶液30ul，適當攪拌，室溫下靜 置2h。減壓使殘余的乙醇揮發后，所得溶液17000r/min離心30min以除去游離的白蛋白 和多余的交聯劑，所得沉淀為載基因白蛋白納米粒。沉淀用雙蒸水重懸并用超聲波(條件 180W，固定頻率20kHz，30sec)分散成乳膠狀，4°C下儲存備用。取部分制備掃描電鏡標本觀察納米粒形態、做包封率檢測和凝膠阻滯實驗，并用 ZetasizerfOOO儀測定粒徑大小和表面Zeta電位。掃描電鏡結果顯示，白蛋白納米粒球形， 大小較均勻且分散良好。ZetasizerfOOO儀粒度分析顯示，白蛋白粒徑大小呈正態分布，平 均粒徑大小為132. Onm，最大粒徑為152. 4nm，最小粒徑為49. lnm。多分散指數平均0. 33， 見圖2。表面Zeta平均+31.32-+41.42mV。樣品的包封率用紫外分光光度計進行檢測，測 量加入的總的質粒DNA含量。將包裹基因后的納米溶液離心并測量上清液中游離質粒DNA， 包封率(％ ) = (W總-W游)/W總X 100 % (W總的加入量；W游上清液中質粒DNA測得 量)。測定結果顯示包封率平均為73. 58%，符合實驗要求。0.9%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示，可見經白蛋白納米包裹后DNA完全阻滯于 加樣孔中未能移動(DNA 白蛋白為1/100)。質粒DNA未被白蛋白納米粒包裹經DNase I消 化后降解，電泳未見條帶顯現。而包裹納米粒的質粒DNA則保持完好，被完全阻滯于加樣孔 內，表明白蛋白納米粒對質粒DNA具保護作用。2、制備氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超聲微泡，具體為無菌制備含10%蔗糖的5% (g.mr1)牛血清白蛋白液體10ml ；并置于有蓋50ml塑料離心管中，依次用氧氣和氟碳氣 體飽和液體(流量6ml. mirT1)，約lOmin，超聲波發生器處理lmin (條件180W，固定頻率 20kHz)；將制備的微泡4°C下密閉保存備用。取部分顯微鏡觀察微泡形態、測量大小并計數；ZetasizerfOOO儀測定粒徑大小 和表面Zeta電位。普通光學顯微鏡顯示制備的糖蛋白超聲微泡園球形囊泡狀，大小較一 致，分散良好，直徑最小0. 9 ii m，最大9. 8 ii m, 95 %以上微泡直徑2-5 u m,可滿足微血管超 聲造影需求。含10%蔗糖的白蛋白微泡經4°C保存30天形態學上未發生改變，且對熱穩定 性良好(40°C，30min)。3、用載基因白蛋白納米粒和氧_氟丙烷蔗糖白蛋白超聲微泡制備白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系，具體為將一次制備的白蛋白納米粒(含 lmg質粒)加至5ml白蛋白微泡中，加入50%戊二醛10ul溶液4°C下孵育2h進行交聯(戊 二醛溶液終濃度為0. )。用生理鹽水洗滌、離心、分層，離心速度200轉/min，lmin，取 上浮泡沫懸液即得白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系。調整微 泡濃度使5ml靶向體系中含微泡0. 8-1.8X109個/ml，基因質粒含量為lmg。4°C下保存備 用。白蛋白超聲微泡與白蛋白納米粒交聯后形態、大小等性狀亦未發生明顯變化，見圖4。實施例3白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系超聲治療 效果1.材料純種新西蘭白兔25只，雄性，體重2. 3-2. 5kg，南方醫科大學動物中心提{共。2.主要試劑羊抗人tPA多克隆抗體、兔抗羊多克隆抗體、牛血清白蛋白、tPA ELISA檢測試劑盒由晶美生物工程有限公司提供。全氟丙烷氣體(Halocarbon-218)由廣東 佛山捷銳公司提供。3.主要儀器超聲波發生器系寧波新芝生物科技有限公司產品；治療性超聲儀 (US-700，系德國產品)。4.方法4. 1兔用5%戊巴比妥鈉靜脈麻醉(20_25mg/kg)；用二維超聲觀察心、肝等臟器顯 影。經耳緣靜脈注入載tPA基因納米白蛋白微泡劑5ml并觀察到相關臟器顯影明顯增強。 分組(1)實驗組(n = 16)進一步分心臟組6例，肝臟組6例和肌肉組4例。靜脈注入載 tPA基因納米白蛋白微泡劑5ml后立即經胸前壁正對心臟前壁及肝區、經皮膚左后腿內收 肌群等超聲照射30min并觀察到將微泡擊碎(二維超聲觀察)，超聲頻率1MHz ；強度1. 5W/ cm2。(2)對照組(n = 9)單純微泡組3例，經耳緣靜脈注入載tPA基因納米白蛋白微泡劑 5ml ；不用超聲照射；納米基因組3例，靜脈輸入白蛋白納米tPA基因及超聲照射；空白對照 組3例，靜脈輸入5ml生理鹽水和超聲治療。超聲治療條件同前。后2組靶器官為肝臟。術 后普通飼料喂養，觀察期4周。4. 2病理和免疫組化觀察動物經常規飼養和觀察4周后分別處死，取心臟、肝臟、 大腿內收肌組織以及超聲場通過的胸壁肋軟骨組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規切 片和HE染色病理檢查；間接免疫組化法染色檢測tPA基因在各組織和細胞中的表達，陽性 反應細胞為細胞漿內黃褐色顆粒狀沉淀。取肺臟、腎臟組織作為對照。動物于術前和觀察 結束分別取血液檢測D- 二聚體含量并用ELISA法檢測血tPA含量5.結果5. 1超聲顯像和靶向治療經兔耳緣靜脈注入載tPA基因納米白蛋白微泡劑5ml 后超聲顯像心臟、肝臟等設定的靶組織，觀察到與注射前相比相關臟器顯影明顯增強。經超 聲波治療30min后組織顯像回復至注射前水平。非超聲治療的單純微泡組、納米基因組和 空白對照組超聲顯像無明顯改變，見圖5和圖6。5. 2組織病理學改變和tPA基因表達超聲靶向處理的心肌細胞、骨骼肌細胞和肝 細胞等體積增大，細胞漿深染，細胞核增大，骨骼肌細胞核增多。部分細胞胞漿可見空泡。未 經超聲照射的組織和細胞未見明顯改變；對照組織如腎組織、肺組織等未見明顯異常，見圖 7和圖8。超聲靶向轉染4周后可見心臟、肝臟、骨骼肌組織和骨組織中的實質細胞表達tPA抗原。tPA抗原表達陽性心肌和骨骼肌細胞呈散在分布，這些細胞體積增大，胞漿橫紋減少 或消失呈細顆粒狀，部分間質細胞和小血管壁可見弱的陽性反應。tPA反應陽性的肝細胞呈 散在或放射狀分布，主要分布在肝小葉門管區，其它細胞未見陽性反應。骨組織中陽性反應 細胞主要分布在軟骨生發層細胞和骨髓造血細胞和部分間質細胞(圖9、10、11、12)。5. 3血D- 二聚體和tPA含量靶向轉基因前后血D_ 二聚體和tPA含量檢測結果 如表1所示，轉基因后4周血液2項反應纖溶活性的指標均顯著增高(表1)。表1 兔靶向轉tPA基因術前和術后4周血D- 二聚體和tPA含量(y g/L，x士 s) *0. 025 < P < 0. 01，**P < 0. 01，術前與術后相比在獲得靶組織表達tPA的同時檢測到血tPA含量增高以及D- 二聚體含量增高，反 應了 tPA抗凝活性明顯增強。
權利要求
一種白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系，其特征在于包括載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒和蔗糖白蛋白超聲微泡。
2.根據權利要求1所述的白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體 系，其特征在于所述重組tPA基因質粒含有重組tPA基因、啟動子、終止子和篩選標記基因 表達盒。
3.根據權利要求2所述的白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體 系，其特征在于所述重組tPA基因由1686個堿基組成，其堿基序列如SEQ ID :N0. 1所示。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物 基因靶向體系，其特征在于所述白蛋白為牛血清白蛋白。
5.根據權利要求1-3任意一項所述的白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物 基因靶向體系，其特征在于靴向體系中蔗糖白蛋白超聲微泡含量為0. 8-1. 8X IO9個/ml， 重組tPA基因質粒含量為0. 1-0. 3mg/ml。
6.白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系的制備方法，包括以 下步驟1)制備載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒；2)制備蔗糖白蛋白超聲微泡；3)用載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒和蔗糖白蛋白超聲微泡制備白蛋白納米-超聲 微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系。
7.根據權利要求6所述的白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體 系的制備方法，其特征在于步驟1)具體為將重組tPA基因質粒加入牛血清白蛋白溶液中 孵育后，在超聲場的存在下滴入乙醇水溶液，直至溶液出現乳白色并逐滴滴入0.5%的戊二 醛溶液，攪拌，室溫下靜置，得到載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒。
8.根據權利要求6所述的白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體 系的制備方法，其特征在于步驟2)具體為無菌制備含蔗糖的牛血清白蛋白液體，并置于 容器中，依次用氧氣和氟碳氣體飽和液體，超聲波發生器處理，得到氧-氟丙烷蔗糖白蛋白 超聲微泡。
9.根據權利要求6所述的白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體 系的制備方法，其特征在于步驟3)具體為步驟1)制備的白蛋白納米粒加至步驟2)制備 的白蛋白微泡中，加入戊二醛，4°C下孵育進行交聯，用生理鹽水洗滌、離心、分層，上浮泡沫 懸液即為白蛋白納米_超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系。
全文摘要
本發明涉及血栓防治藥物領域，公開了一種白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系，包括載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒和蔗糖白蛋白超聲微泡；其制備方法包括以下步驟1)制備載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒；2)制備蔗糖白蛋白超聲微泡；3)用載重組tPA基因質粒白蛋白納米粒和蔗糖白蛋白超聲微泡制備白蛋白納米-超聲微泡載組織型纖溶酶原激活物基因靶向體系。本發明構建重組tPA基因質粒并選擇白蛋白納米粒和超聲微泡為載體，將其轉導機體細胞獲得有效和持續tPA的產生，可達到長期抗凝和防止血栓形成的作用，且安全、無創。
文檔編號A61P7/02GK101850124SQ201010154900
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月13日 優先權日2010年4月13日
發明者姬尚義, 季軍 申請人:姬尚義;季軍