專利名稱：載紫杉醇納米微泡及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫療藥物領域，具體的說，涉及一種載紫杉醇納米微泡及其制備方法。
背景技術：
先天性或后天性血管血管狹窄病變經介入手術治療后，常發生再狹窄。其主要病理基礎是血管平滑肌細胞增生遷移所引起的新生內膜增生。微管抑制劑紫杉醇具有微管動力學穩定作用，抑制紡錘體的正常形成，且抑制與細胞分裂有關的跨膜信號轉導和基因表達，因此其阻斷細胞有絲分裂和增生的效果確切。實驗表明紫杉醇可抑制VSMCs的分裂和增殖，在再狹窄模型中能明顯減輕新生內膜增生。紫杉醇為白色或類白色粉末，脂溶性高，在水中的溶解度< 0. 004g ·Ι^。口服幾乎不吸收。現臨床應用的紫杉醇注射液由乳浮EUcremoophor EL，含聚氧乙烯蓖麻油)/無水乙醇(50 50，ν/ν)制成的無色粘稠狀濃溶液，使用時用5%右旋糖酐或生理鹽水稀釋成 0. 3-1. 2g · L—1溶液后靜脈滴注3-24h，輸注劑量為135_175mg · πΓ2，最大耐受劑量(MTD)為 3h內輸注225-240mg ·πΓ2。雖然解決了紫杉醇的溶解問題，但由于毒副作用大，患者難以耐受。故開發新的劑型，尤其是供注射的靶向新劑型是目前的研究熱點。
發明內容
為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種無毒副作用，穩定性好的載紫杉醇納米微泡及其制備方法。本發明目的之一是這樣實現的一種載紫杉醇納米微泡，其關鍵在于所述微泡由類脂質雙分子層構成膜，內含N2,所述類脂質雙分子層包含親水基團與疏水基團，所述親水基團鏈接紫杉醇，將紫杉醇載入類脂質雙分子層構成的膜中，所述類脂質雙分子層由卵磷脂、膽固醇、PEG-4000、葡聚糖、司班-80、甲醇、乙醚、3% 6% HSA(人血白蛋白)、紫杉醇標準品、PBS液體的復合構成。本發明目的之二是這樣實現的一種載紫杉醇納米微泡的制備方法，其關鍵在于按如下步驟進行(1)將0. 1 0. 15g卵磷脂，0.04 0.06g膽固醇放入旋轉蒸發儀的反應瓶中，力口入乙醚溶解卵磷脂和膽固醇；40°C水浴，旋轉蒸發儀工作，見反應瓶底部形成一層干燥薄膜結束反應，將乙醚回收入一個瓶子中，妥當保存；(2)配置 0. 01M, PH = 7. 4 的 PBS 緩沖液；(3)在步驟(1)反應瓶中加入PBS液，45°C水浴，磁力攪拌器勻速攪拌，同時加入0.4 0. 6gPEG-4000,0. 07g 0. 105g葡聚糖，0. 1 0. 15ml司班，均質振蕩儀振蕩 6. OXlOVmin 5min，超聲空化5min ；45°C水浴條件下磁力攪拌器攪拌，同時通入N25min ；(4)將(3)中所得粗混懸液依次通過微膜過濾得到多室納米微泡混懸液；(5)將Img紫杉醇標準品溶于Iml甲醇，超聲振蕩lmin，微型漩渦混合器振蕩 5min，得到lmg/ml的紫杉醇標準品；
(6)取步驟(3)制備的納米微泡混懸液lml，加入0. 125ml 3% 6% HSA(人血白蛋白)與步驟(5)得到的5mg/ml的紫杉醇標準品0. 125ml混合振蕩lOmin，得到最終的載紫杉醇納米微泡。上述步驟(2)中緩沖液，由8. Og Nacl ；0. 20g Kcl ；3. 6g Na2HPO4 · 12H20 ；0. 25g KH2PO4加入約800ml-900ml三蒸水在磁力攪拌器攪拌約20min，最終定容到1000ml，后通過 LanGe-Pump蠕動泵0. 22 μ m濾膜過濾，15磅20min高壓滅菌制得。上述步驟(4)粗混懸液依次由0.45μπι微孔濾膜過濾2次，0.22μπι微孔濾膜過濾 2次得到多室納米微泡混懸液。本發明所得的載紫杉醇納米微泡進行檢測1.光學顯微鏡觀察取適量載紫杉醇納米微泡混懸液，用PBS液體稀釋5倍，血細胞計數板計數，計數四個大格，壓線的只計左側和上方的。微泡數/ml = 4大格總數/4*104計數結果為8*109個/ml載紫杉醇納米微泡在光學顯微鏡下觀察形態呈圓球形，規則，大小均勻一致。(見圖2)2.熒光顯微鏡觀察載紫杉醇納米微泡的熒光圖片一(見圖3)3.粒徑檢測馬爾文激光粒徑測量儀測定微泡的粒徑分布載紫杉醇納米微泡粒徑位于700nm 800nm之間。(見圖4、5)4. HPLC檢測載紫杉醇脂質體藥物含量穩定性研究4. 1色譜條件色譜柱=Venusil MP C18 ；流動相甲醇水(70 30)；柱溫室溫； 流速為1. 4mL · miiT1 ；紫外檢測波長為227nm ；進樣量20 μ 1。色譜圖(見圖6)4. 2干擾試驗。取純甲醇溶液，按“4.1”色譜條件進樣，得出色譜圖；再取溶度為5μ g/ml的紫杉醇標準液按“4. 1”色譜條件進樣，得出色譜圖。(見圖7)結果表明，溶劑甲醇和紫杉醇出現的峰時間相距很大，溶劑甲醇對紫杉醇的測定無干擾。4. 3線性關系考察取0. 5 μ g/ml ；Ι.Ομ g/ml ；2. 5 μ g/ml ；5. O μ g/ml ；7. 5 μ g/ml 紫杉醇標準品溶液分別進樣，以峰面積A(mAU*s)為縱坐標，紫杉醇質量濃度C(yg/mL)為橫坐標進行線性回歸，得線性回歸方程A = 28. 734C+4. 3239 (R2 = 0. 9982)(見圖 8)4. 4不同溶度HSA載紫杉醇納米微泡中的載藥量及包封率制備不同溶度HSA的載紫杉醇納米微泡(未加HSA ;1 % HSA-PLM ；3% HSA-PLM ； 6% HSA-PLM ；10% HSA-PLM)高速離心法取制備好的不同溶度的HSA的載紫杉納米微泡混懸液0. 5ml，加入3. 5ml的甲醇，振蕩5min, 15000rpm離心25min。取上清液20 μ 1進樣。得出不同濃度HSA載紫杉醇納米微泡游離紫杉醇的HPLC的曲線，得出峰面積。根據“4. 3”得出的線性回歸方程，計算出游離藥物量(W游)。包封率=(1-W游/W總)Χ100%。 得出未加HSA ;1 % HSA ；3% HSA ；6% HSA ； 10% HSA載紫杉醇納米微泡的包封率分別為 81. 78% ；83. 75% ；93. 51% ；89. 08% ；84. 88% ·結果表明，與未加入HAS相比，加入HSA能提高載紫杉醇納米微泡的包封率，且存在統計學意義(P < 0. 05)。在各濃度組HSA中，3% HSA, 6% HSA的包封率高于其他各組， 且存在統計學意義(P<0.05)。結果表明，加入3% 6%HSA能明顯提高載紫杉醇納米微泡的包封率。(見圖9)，5.載紫杉醇納米微泡大鼠體內毒副實驗5. 1.材料和方法5. 1. 1實驗材料健康雄性SD大鼠，體重180 250g〔購于重慶醫科大學動物中心〕；自制載紫杉醇納米微泡，0.9%氯化鈉注射液〔購于太極西南藥業股份有限公司〕5. 1. 2實驗方法30只雄性SD大鼠分為對照組，治療組。對照組給予lml/kg的 0. 9%氯化鈉〔NS〕注射液尾靜脈注射；治療組給予lml/kg的載紫杉醇納米微泡〔PLM〕懸液尾靜脈注射。在注射24h，48h，72h后分批處死SD大鼠，心臟穿刺抽靜脈血，3500rpm, 5min 離心，取上清液。全自動生化儀檢測肝功〔TP、AS/AL、ALT、AST、ALP，腎功〔BUN、Crea〕。5. 2實驗結果表1.全身毒副實驗中大鼠體重變化結果〔χ士s，η = 8〕
權利要求
1.一種載紫杉醇納米微泡，其特征在于所述微泡由類脂質雙分子層構成膜，內含N2, 所述類脂質雙分子層包含親水基團與疏水基團，所述親水基團鏈接紫杉醇，將紫杉醇載入類脂質雙分子層構成的膜中，所述類脂質雙分子層由卵磷脂、膽固醇、PEG-4000、葡聚糖、司班-80、甲醇、乙醚、3% 6% HSA、紫杉醇標準品、PBS液體的復合構成。
2.—種權利要求1所述載紫杉醇納米微泡的制備方法，其特征在于按如下步驟進行(1)將0.1 0. 15g卵磷脂，0. 04 0. 06g膽固醇放入旋轉蒸發儀的反應瓶中，加入乙醚溶解卵磷脂和膽固醇；40°C水浴，旋轉蒸發儀工作，見反應瓶底部形成一層干燥薄膜結束反應，將乙醚回收入一個瓶子中，妥當保存；(2)配置0. 01M, PH = 7. 4 的 PBS 緩沖液； (3)在步驟⑴反應瓶中加入PBS液，45°C水浴，磁力攪拌器勻速攪拌，同時加入0.4 0. 6gPEG-4000,0. 07g 0. 105g葡聚糖，0. 1 0. 15ml 司班，均質振蕩儀振蕩 6. 0 X 103r/min 5min，超聲空化5min ；45°C水浴條件下磁力攪拌器攪拌，同時通入N25min ；(4)將(3)中所得粗混懸液依次通過微膜過濾得到多室納米微泡混懸液；(5)將Img紫杉醇標準品溶于Iml甲醇，超聲振蕩lmin，微型漩渦混合器振蕩5min，得到lmg/ml的紫杉醇標準品；(6)取步驟(3)制備的納米微泡混懸液1ml，加入0.125ml 3% 6% HSA與步驟(5) 得到的lmg/ml的紫杉醇標準品0. 125ml混合振蕩lOmin，得到最終的載紫杉醇納米微泡。
3.根據權利要求2所述載紫杉醇納米微泡的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中緩沖液，由 8. Og Nacl ；0. 20g Kcl ；3. 6g Na2HPO4 · 12H20 ；0. 25g KH2PO4 加入約 800ml_900ml 三蒸水在磁力攪拌器攪拌約20min，最終定容到1000ml，后通過LanGe-Pump蠕動泵0. 22 μ m 濾膜過濾，15磅20min高壓滅菌制得。
4.根據權利要求2所述載紫杉醇納米微泡的制備方法，其特征在于所述步驟(4)粗混懸液依次由0. 45 μ m微孔濾膜過濾2次，0. 22μπι微孔濾膜過濾2次得到多室納米微泡混懸液。
全文摘要
本發明公開了一種載紫杉醇納米微泡及其制備方法，所述微泡由類脂質雙分子層構成膜，內含N2，所述類脂質雙分子層包含親水基團與疏水基團，所述親水基團鏈接紫杉醇，將紫杉醇載入類脂質雙分子層構成的膜中，所述類脂質雙分子層由卵磷脂、膽固醇、PEG-4000、葡聚糖、司班-80、甲醇、乙醚、3％HSA、紫杉醇標準品、PBS液體的復合構成。本發明載紫杉醇納米微泡無毒性，無副作用；能外周靜脈注射；能通過肺及全身毛細血管床(直徑通常＜5um)，經靜脈注射后可隨血循環到達全身組織；穩定性好，在血循環中持續時間較長；不影響全身或某一系統的血流動力。
文檔編號A61P35/00GK102357071SQ201110330808
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者唐靜, 楊汝鈴, 計曉娟 申請人:重慶醫科大學附屬兒童醫院