專利名稱：一種殼聚糖納米粒的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種可用作注射用重組人血管內皮抑制素殼聚糖納米粒的制備方法。
背景技術：
殼聚糖是殼多糖(chitin)脫乙酰基的產物，含β-(1，4)_2-乙酰胺基_D_葡萄糖 單元和β-(1，4)-2-氨基-D-葡萄糖單元的共聚物，后者一般超過65%。根據不同的制備 方法，可以獲得不同脫乙酰程度和平均分子量的殼聚糖。殼聚糖為陽離子聚合體，不溶于普 通有機溶劑，在堿液中穩定，在酸性條件下，是一種線性高分子電解質，其溶液具有一定粘 度，溶液的濃度越高或分子量越大，粘度就越大。注射用重組人血管內皮抑制素(恩度，Endostar)是首個血管內皮抑制素肺癌新 藥，由山東先聲麥得津生物制藥有限公司(先聲藥業控股子公司)開發。其抗腫瘤機制基 于美國哈佛醫學院的Folkman教授提出的“餓死腫瘤療法”理論。研究發現一些內源性血 管生成抑制因子如Angiostatin、Endostatin能夠阻礙血管在腫瘤組織中的生長，使腫瘤 的生長和轉移處于停滯(0，Relly, M. S.，et al. Cell. 79 :315_328，1994 ；0，Relly, M. S.， et al. Cell，88 :277-285，1997)。注射用重組人血管內皮抑制素Endostar保持了內源性Endostatin的所有生物 活性，但是由于體內半衰期很短，臨床使用中患者需每天注射一次，連續14天為一個療 程，休息一周后，再繼續下一療程。由于頻繁的注射給藥，臨床順應性很差。近期有研究 發現動物體內小劑量持續給予Endostatin的藥效要優于間歇性給藥(Minoru Kuroiwa, et al.J.Pediatr. Surg. 38 1499-1505,2003 ；Oliver Kisker, et al.Cancer Res. 61 7669-7674,2001)。因此，將其開發成注射一次可以持續釋藥的長效制劑非常必要。殼聚糖是自然界中唯一大量存在的陽離子聚合物，有良好的生物相容性、可降解 性和黏膜黏附性。由于殼聚糖特有的性質，它已成為新型的納米藥物載體，常用來包載多肽 及蛋白質類藥物，以促進藥物的胃腸道及黏膜吸收，延長藥物在吸收部位的保留時間，達到 控釋目的。將殼聚糖納米粒作為注射用重組人血管內皮抑制素的控釋載體將具有良好的應 用前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種可用作注射用重組人血管內皮抑制素殼聚糖納米粒體 系的制備方法。本發明所述納米粒體系是將凝聚劑加入殼聚糖溶液中，利用殼聚糖溶液中的水分 子與凝聚劑結合，降低殼聚糖的溶解度使分子間形成氫鍵，最后從溶液中析出形成納米粒。 該體系可以避免使用有機溶劑，同時獲得粒徑分布均勻、載藥量高的納米粒。本發明所述納米粒體系包括殼聚糖和重組人血管內皮抑制素。本發明的納米粒的制備方法采用下列步驟先將殼聚糖加入醋酸溶液中，攪拌至 完全溶解；將注射用重組人血管內皮抑制素緩沖液溶于殼聚糖醋酸溶液中，不斷攪拌的條件下滴入凝聚劑，繼續攪拌、超聲、離心；最后將沉淀重新混懸于水中，即得納米粒。在加入 重組人血管內皮抑制素緩沖液前還可以在殼聚糖醋酸溶液中加入表面活性劑。本發明中重組人血管內皮抑制素溶解在緩沖液中，其中緩沖液可以是醋酸鹽緩沖 液、磷酸鹽緩沖液、TriS緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液中的一種，優選醋酸鹽緩沖液。由于 重組人血管內皮抑制素只在一定PH值下穩定，緩沖液的pH值在2 9之間，優選4 7之 間。本發明中所述殼聚糖分子量范圍在10000 500000道爾頓，優選為50000 200000道爾頓。本發明中醋酸溶液濃度為0. 5 2mg/mL，優選lmg/mL，殼聚糖醋酸溶液中殼聚糖 濃度為ι. ο 10mg/mL。本發明中所述的表面活性劑可以是脂肪酸甘油酯，脂肪酸山梨坦(司盤)，聚山梨 酯(吐溫)中的一種，表面活性劑的加入量為0. 1%襯至2%襯，優選0.5%襯至1%襯。本發明中所述凝聚劑為強親水性物質，可以是硫酸鈉、氯化鈉或硫酸銨，優選硫酸 鈉；凝聚劑的濃度為5 100mM。本發明中殼聚糖與凝聚劑質量比為1 5 5 1，優選1 2 2 1。本發明中在攪拌過程中殼聚糖與凝聚劑形成分子間氫鍵，攪拌可以采用磁力攪 拌、螺旋槳攪拌，攪拌轉速在100 600轉/分，攪拌時間在1 120分鐘。本發明中采用50W 200W功率的超聲，超聲時間在0 IOmin ；離心采用冷凍離 心，即溫度控制在0 10攝氏度，離心轉數控制在6000 16000轉/分，離心時間在10 60分鐘。本發明中所述的重組人血管內皮抑制素殼聚糖納米粒中重組人血管內皮抑制素 重量百分數占Wt 50% Wt，納米粒平均粒徑在400nm 900nm之間。本發明中所述的重組人血管內皮抑制素為重組人血管內皮抑制素Endostar。本發明的優點有1、殼聚糖納米粒具有良好的生物相容性、生物可降解性，是蛋白質類藥物的良好 載體；2、納米粒制備方法操作簡單；3、納米粒分布均勻，載藥量高。
圖1實施例一中納米粒粒徑分布圖。圖2實施例二中納米粒粒徑分布圖。圖3實施例三中納米粒粒徑分布圖。圖4實施例四中納米粒粒徑分布圖。
具體實施例方式本發明通過以下實施例作更詳細的描述，但不能將其解釋為限制本發明的保護范圍。實施例一
稱取分子量為50000道爾頓的殼聚糖500mg，溶于50mL 的醋酸溶液中，得到 lOmg/mL的殼聚糖溶液。以蒸餾水配制5mg/mL的硫酸氨溶液20mL。磁力攪拌下緩慢滴加 硫酸氨溶液，反應30分鐘，IOOff功率下探頭超聲2分鐘，將上述溶液在4攝氏度，10000轉 /分鐘條件下離心30分鐘，分離納米粒。將所得納米粒重新分散于50mL水中，得到殼聚糖 納米粒。用nanO-ZS90馬爾文粒徑儀測定納米粒粒徑，平均粒徑為826nm，粒徑分布見圖1。實施例二稱取分子量為100000道爾頓的殼聚糖200mg，溶于20mL 的醋酸溶液中，得到 10mg/mL的殼聚糖溶液。以蒸餾水配制5mg/mL的硫酸鈉溶液20mL。取含IOOmgEndostar 醋酸鹽緩沖液(PH5. 5)加入殼聚糖溶液中，磁力攪拌下緩慢滴加硫酸鈉溶液，反應10分鐘， IOOff功率下探頭超聲2分鐘，將上述溶液在4攝氏度，15000轉/分條件下離心30分鐘，分 離納米粒。將所得納米粒重新分散于30mL水中，得到殼聚糖納米粒。將離心分離后的上清溶液適當稀釋，采用BCA方法(試劑盒來自于 ThermoScientific，名為BCA Protein Assay Kit)測定其中的蛋白濃度即游離蛋白濃度， 計算納米粒中重組人血管內皮抑制素重量百分數即載藥量。其中載藥量=(加入蛋白重 量_游離蛋白重量)+載藥納米粒總重。將納米粒溶液用nanO-ZS90馬爾文粒徑儀測定納 米粒粒徑。所得納米粒載藥量為24. 2%，平均粒徑為725nm，粒徑分布見圖2。實施例三稱取分子量為100000道爾頓的殼聚糖200mg，溶于40mL 的醋酸溶液中，得到 5mg/mL的殼聚糖溶液，加入200 μ L吐溫80溶解。以蒸餾水配制2mg/mL的硫酸鈉溶液40mL。 取含IOOmg Endostar醋酸鹽緩沖液(pH5. 5)加入含有吐溫的殼聚糖溶液中，磁力攪拌下 緩慢滴加硫酸鈉溶液，反應20分鐘，IOOff功率下探頭超聲2分鐘，將上述溶液在4攝氏度， 15000轉/分條件下離心30分鐘，分離納米粒。將所得納米粒重新分散于50mL水中，得到 殼聚糖納米粒。載藥量測定同實施例二。將納米粒溶液用nanO-ZS90馬爾文粒徑儀測定納米粒粒 徑。所得納米粒載藥量為20. 1%，平均粒徑為663nm，粒徑分布見圖3。實施例四稱取分子量為100000道爾頓的殼聚糖lOOmg，溶于IOmL 的醋酸溶液中，得到 10mg/mL的殼聚糖溶液，加入500 μ L司盤80溶解。以蒸餾水配制10mg/mL的硫酸鈉溶液 20mL。取含IOOmg Endostar醋酸鹽緩沖液(pH5. 5)加入含有司盤的殼聚糖溶液中，螺旋槳 攪拌下(300轉/分)緩慢滴加硫酸鈉溶液，反應30分鐘，IOOff功率下探頭超聲5分鐘，將 上述溶液在4攝氏度，15000轉/分條件下離心30分鐘，分離納米粒。將所得納米粒重新分 散于20mL水中，得到殼聚糖納米粒。載藥量測定同實施例二。將納米粒溶液用nanO-ZS90馬爾文粒徑儀測定納米粒粒 徑。所得納米粒載藥量為18. 6%，平均粒徑為537nm，粒徑分布見圖4。
權利要求
一種制備注射用重組人血管內皮抑制素殼聚糖納米粒的方法，其特征在于(1)將殼聚糖加入醋酸溶液中，攪拌溶解；(2)將含有重組人血管內皮抑制素的緩沖液加入殼聚糖醋酸溶液中；(3)不斷攪拌的條件下滴入凝聚劑；(4)繼續攪拌、超聲、離心；(5)最后將沉淀重新混懸于水中，即得載重組人血管內皮抑制素的殼聚糖納米粒。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于權利要求1中所述的重組人血管內皮 抑制素緩沖液可以是醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液中的 一種，其中緩沖液PH值在2 9之間。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述殼聚糖分子量范圍在10000 500000道爾頓，醋酸溶液濃度為0. 5 2mg/mL，殼聚糖濃度為1. 0 10mg/mL。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的凝聚劑為強親水性物質，選自 硫酸鈉、氯化鈉或硫酸銨中的一種。
5.根據權利要求1或4所述的制備方法，凝聚劑可以以固體形式加入，也可以以水溶液 形式加入，凝聚劑水溶液的濃度為5 100mM。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于超聲時間在0 lOmin，離心采用冷凍 離心，離心轉數在6000-16000轉/分鐘，溫度控制在0 10攝氏度，離心時間在10 60 分鐘。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于殼聚糖與凝聚劑質量比為1 5 5 I0
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的重組人血管內皮抑制素殼聚 糖納米粒中重組人血管內皮抑制素重量百分數占wt 50% wt，納米粒平均粒徑在 400nm 900nm 之間。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的制備方法，在加入含有重組人血管內皮抑制素的 緩沖液前還可以在殼聚糖醋酸溶液中加入表面活性劑，所述表面活性劑可以是脂肪酸甘油 酯，脂肪酸山梨坦(司盤)，聚山梨酯(吐溫)中的一種；表面活性劑的加入量為0. 2% wt。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的制備方法，其特征在于所述的重組人血管內皮 抑制素為重組人血管內皮抑制素Endostar。
全文摘要
本發明涉及一種注射用重組人血管內皮抑制素納米粒的制備方法，該納米粒子包括殼聚糖和重組人血管內皮抑制素。納米粒制備方法采用凝聚法，即將凝聚劑加入含有重組人血管內皮抑制素的殼聚糖溶液中，通過攪拌、超聲、離心；最后將沉淀重新混懸于水中，即得納米粒。制備方法簡單，獲得的納米粒粒徑在400nm至900nm。
文檔編號A61K47/36GK101905017SQ201010231319
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者劉春暉, 李玲, 王青松, 許向陽 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司