專利名稱：硫酸多糖片斷psc,其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及硫酸多糖片斷PSC，其制備方法及其抗血管生成和抗乙酰肝素酶藥物 的應用。背景介紹腫瘤的侵襲轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因，尋找引發腫瘤細胞侵襲與轉移 的因素并進行有效阻斷是治療腫瘤的重要方法之一。腫瘤細胞要實現侵襲和轉移首先要穿 越由細胞夕卜基質(extracellular matrix, ECM)及基底膜(basement menbrane, BM)組成 的屏障。該屏障主要由IV膠原(collagen IV)、層黏連蛋白(Iaminin)以及硫酸乙酰肝素 蛋白多糖(heparan sulfate proteogycans, HSPGs)等構成，而乙酰肝素酶(heparanase, Hpa)被證明是目前為止在哺乳動物中發現的唯一一個可以剪切HSPGs上硫酸乙酰肝素 (heparansulfate,HS)側鏈的一種糖苷內切酶。由于乙酰肝素酶在腫瘤的侵襲與轉移中扮 演的重要作用，因此目前以乙酰肝素酶為靶點的腫瘤治療成為腫瘤治療研究的熱點。由于乙酰肝素酶在腫瘤的侵襲轉移中扮演的重要作用，其抑制劑的研究和篩選已 成為人類尋找癌癥治療潛在藥物的新方向。現在對乙酰肝素酶抑制劑的研究取得了較大進 展，主要有天然產物及化學修飾后的天然產物、小分子抑制劑和抗體等，根據檢索已有十個 在研的乙酰肝素酶抑制劑，并已有1個候選藥物(PI-88)進入二期臨床，是個應當注意的新 方向。其中研究的天然產物及其化學修飾后的天然產物最多。早在1987年，Matia等 制備了各種低硫化或低分子量的肝素，研究發現這些肝素葡糖胺殘基上的氧硫酸酯和氮 硫酸酯基團、糖醛酸殘基上的羧基都是對乙酰肝素酶活性進行抑制的重要部分，這些肝素 可以抑制黑素瘤細胞的轉移等。Borgenstrom等從細菌E. coli K5 (K5PS)中分離得到的 兩種多糖氧硫酸酯和氮氧硫酸酯多糖用于抑制鼠黑素瘤B16-BL6細胞的轉移和人乳腺癌 MDA-MB-231細胞株。Borsig等也研究了一種修飾后的肝素同時具有抑制選凝素介導的黏 附作用和抑制乙酰肝素酶的活性。青島海洋大學耿美玉等報道了一種來源于海洋的寡糖，寡聚的硫酸甘露糖醛 酸(οligomannurarate sulfate, JG3)作為乙酰肝素酶抑制劑。JG3在體內和體外都 抑制血管生成和腫瘤轉移。它與乙酰肝素酶的相互作用受到低分子量的肝素(4000Da) 的競爭，但不受其他黏多糖的影響。另外，這種化合物還能抑制堿性成纖維細胞生長因 子(bFGF)從細胞外基質中的釋放和隨后的血管生成。Shiozawa等從真菌(Talaromyce trachyspermusSANK 12191)培養物中分離得到新的代謝物trachyspic acid，分子式為 C2tlH28O9。，它對乙酰肝素酶的IC50為36μπι01/1。此外，Parish等發現磷酸甘露糖戊糖硫酸 ik (phosphomannopentaose sulfate,PI-88)禾口胃(maltohexaose sulfate) 這些硫酸寡糖類具有與HS相似的結構，可能干擾許多血管生長因子與HS的識別，同時抑制 乙酰肝素酶對HS的切割。此外，Parish等發現在乙酰肝素酶活性和血管生長兩種測活系統中，高硫酸化的 長度為5個以上的線性多糖才具有以上兩種抑制活性。其中PI-88和麥芽己糖硫酸鹽就有
3這些活性，PI-88 (P-6-Man- α - (1 — 3) -Man- α - (1 — 3) -Man- α - (1 — 3) -Man- α - (1 — 2) -Ma η)是從二倍體酵母Pichia holstii的外多糖中制備的。它有低毒性的特點，同時兼具抗血 管增生及防止癌細胞擴散的雙重功能，它既能夠抑制血管生成，又能夠抑制血管內皮生長 因子(VEGF)、成纖維母細胞生長因子1和2(FGF-1和2)以及肝素酶(h印aranase)這種與 腫瘤轉移相關的酶等各種腫瘤促進因子的活性。其抑制大鼠高度浸潤性腺癌生長為50%， 抑制淋巴癌轉移為40%，抑制血源性癌轉移為90%，降低腫瘤新生血管形成為30%。作為 藥物，該化合物已于1990年由澳大利亞的Progen公司研發成功，并已通過英國人體第一階 段無毒測試。目前，美國和澳大利亞各大城市正在進行以黑色素細胞癌、肺癌及多發性骨髓 癌等為主要臨床應用的第二期臨床試驗。2007年9月，Progen宣布PI_88250mg合并多西 他塞治療IIIB/IV非小細胞肺癌沒有達到主要治療終點，和單用多西他塞相比未能顯著的 提高無病生存率，同時也未達到第二治療終點，延長進展時間、反應率、總生存期和生活質 量，但是PI-88給藥組可見生存改善的趨勢。另外PI-88原發性肝癌術后預防復發目前處 于III期臨床。
發明內容
本發明提供了一種通式為I的一種硫酸多糖片斷PSC 其中η = 12 36 ；RU R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RIO、Rll 可以相同或者不同，為 H 或 S03Na 或 S03H ；每個葡萄糖單元上的活性羥基被硫酸取代的量在2. 5 3。優選取代的量是2. 6。本發明所述的硫酸多糖片段PSC為直鏈線性結構，優選無支鏈的直鏈線性結構。本發明還提供了一種硫酸多糖片斷PSC的制備方法將酵母葡聚糖經硫酸水解反 應降解，分離純化得到分子量5000 10000多糖片斷，再經過磺化反應，獲得硫酸多糖片斷 PSC。上述制備方法中的硫酸水解反應溫度在65_85°C，硫酸濃度在1 1. 5M，反應時間 為6 8小時。上述制備方法中的磺化反應是多糖片斷與氯磺酸反應，其中溶劑為甲酰胺或吡 啶，反應溫度為80 120°C，反應時間為2. 5 5小時。本發明還提供了上述硫酸多糖片斷PSC在制備抑制乙酰肝素酶活性的藥物中的 用途。本發明所述的抑制乙酰肝素酶活性的藥物可以用于包括治療和預防實體腫瘤和血液腫瘤及其轉移和復發。本發明還提供了上述硫酸多糖片斷PSC在制備抗血管生成藥物中的應用。本發明 所述的抗血管生成藥物包括治療與腫瘤生長有關的血管生成、增生性視網膜疾病。
圖1硫酸多糖片斷PSC核磁共振碳譜
具體實施例方式以下通過實施例對本發明做進一步的說明，但不能將其解釋為限制本發明的保護 范圍。本發明中沒有具體描述的提取、分離方法均為本領域普通技術人員熟知的方法， 本領域普通技術人員可以根據說明書的提示采用藥典規定的方法或者其他操作規程限定 的方法結合所使用儀器的說明書進行操作，即可實現本發明。實施例1稱取5g酵母葡聚糖，加入IM硫酸500ml，70°C水浴反應6小時，反應液用碳酸鋇 中和至PH = 7，過濾去除沉淀，取上清，旋蒸濃縮，加入95 %乙醇醇沉，使乙醇終濃度達到 70%，離心去除沉淀，上清液使用透析袋，蒸餾水透析24小時。透析內液冷凍干燥。4ml氯 磺酸在冰鹽浴加入無水吡啶20ml，制成酯化試劑，加入凍干粉末，在100°C下反應3小時。反 應液用NaOH中和至PH7. 5后，用透析袋，蒸餾水透析24小時脫鹽，然后用DE-52離子交換 柱層析，用1.5M NaCl溶液作為流動相，收集洗脫峰，再經G-25分子篩柱脫鹽，得到組分硫 酸多糖片斷PSC。實施例2硫酸多糖片斷PSC的結構，通過核磁共振碳譜氫譜，分子篩凝膠排阻色譜測定分 子量以及元素分析方法進行鑒定。硫酸多糖片斷PSC溶解于D2O,使用300Hz核磁共振儀， 測定碳譜氫譜，相關結果見圖1。分子篩凝膠排阻色譜測定分子量，色譜條件為二根多糖 專用凝膠色譜柱串聯(分子量分離范圍在400萬-100道爾頓)，流動相為0. ImoVLNaNO3 溶液，柱溫45 °C，流速為每分鐘0. 4ml，示差折光檢測器，理論板數按葡萄糖峰計算(不小 于)。葡聚糖系列標準品Mw 為 39. 3X 104、21X104、4. 88X 104、2. 17 X ΙΟ4、IX IO4 6 X ΙΟ3、 0. 18 X 103，試驗結果顯示數均分子量為0.8X104g/mol，重均分子量為0. 9 X 104g/mol。元 素分析結果見表1。綜合核磁共振碳譜氫譜，分子篩凝膠排阻色譜測定分子量以及元素分 析結果推斷硫酸多糖PSC具有通式(I)的結構，其中n = 12 36;禮、1 2、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、 R8、R9、R10, R11可以相同或者不同，為H或SO3Na或S03H。該硫酸多糖片斷PSC，每個葡萄糖 單元上的活性羥基被硫酸取代的量即硫酸取代度在2. 6。表1.硫酸多糖片斷PSC元素分析結果
實施例3硫酸多糖片斷PSC的乙酰肝素酶抑制活性測定試驗方法96孔板分別加入硫酸多糖片斷PSC水溶液或陽性對照藥suramin，肝素 酶(3 X IO-6IU/孔)，底物(璜達肝素100 μ M)，和40mM醋酸鈉緩沖液(PH = 5. 0)，37°C孵育 24小時，加入100 μ 1 1. 69mM WST，0. INaOH溶液終止反應，并在60°C顯色1小時，用酶標儀 檢測584nm處OD值，根據GraphPad Prism 5軟件計算硫酸多糖片斷PSC樣品對肝素酶抑 制活性IC50 = 0. 4 μ g/ml, Suramin IC50 = 8 μ g/ml。硫酸多糖片斷PSC對肝素酶抑制活性 是 Suramin 的 20 倍。實施例4bFGF誘導HUVEC遷移的實驗遷移實驗取處于指數生長期狀態良好的HUVEC細 胞一瓶，加入0. 25%胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，以1.8X104個細胞/180 μ 1 的HUVEC細胞(懸于含FBS的1640培養基)接種于內室，并加入20ul不同濃度的的 藥物。外室中加入600ul含1% FBS的培液和bFGF(60ng/ml)37°C孵育6h，棄孔中培液。 4%多聚甲醛固定細胞lOmin。0. 1 %結晶紫染色lOmin，PBS漂凈多余染料。用棉簽輕輕 擦去內室上層未遷移的細胞。在顯微鏡下拍照觀察，隨機取五個視野，取平均值，根據以下 公式計算遷移抑制率遷移抑制率=(細胞個數control-細胞個數treated) /細胞個數 control X 100% ο 結果見表 2，硫酸多糖片斷 PSC IC50 = 18. 3ng/ml, SuraminIC50 = 50 μ g/ ml，硫酸多糖片段PSC的抑制效果接近Suramin的3000倍。表2 bFGF誘導HUVEC遷移的實驗結果
權利要求
通式為I的一種硫酸多糖片斷PSC其中n＝12～36；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11可以相同或者不同，為H或SO3Na或SO3H；每個葡萄糖單元上的活性羥基被硫酸取代的量在2.5～3。FSA00000197309300011.tif
2.根據權利要求1的硫酸多糖片斷PSC，其特征在于每個葡萄糖單元上的活性羥基被 硫酸取代的量是2. 6。
3.根據權利要求1或2的硫酸多糖片斷PSC，其特征在于該片段為直鏈線性結構。
4.權利要求1-3中任何一項的硫酸多糖片斷PSC的制備方法，其特征在于將酵母葡聚 糖經硫酸水解反應降解，分離純化得到分子量5000 10000多糖片斷，再經過磺化反應，獲 得硫酸多糖片斷PSC。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的硫酸水解反應溫度在65-85°C， 硫酸濃度在1 1. 5M,反應時間為6 8小時。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的磺化反應是多糖片斷與氯磺酸 反應，其中溶劑為甲酰胺或吡啶，反應溫度為80 120°C，反應時間為2. 5 5小時。
7.權利要求1-3中任何一項所述的硫酸多糖片斷PSC在制備抑制乙酰肝素酶活性的藥 物中的用途。
8.按照權利要求7所述的用途，其特征在于包括治療和預防實體腫瘤和血液腫瘤及其 轉移和復發。
9.權利要求1-3中任何一項所述的硫酸多糖片斷PSC在制備抗血管生成藥物中的應用。
10.按照權利要求9所述的用途，其特征在于包括治療與腫瘤生長有關的血管生成、增 生性視網膜疾病。
全文摘要
本發明涉及了具有式I結構通式的硫酸多糖片段PSC及其制備方法，以及該硫酸多糖片段在抗血管生成和抗乙酰肝素酶藥物的應用。其中n＝12～36；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11可以相同或者不同，為H或SO3Na或SO3H，硫酸取代的量在2.5～3。
文檔編號A61P9/00GK101891834SQ20101023131
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者王婷 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司