專利名稱：脫氧核酶在制備增強腫瘤化療敏感性的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向細胞凋亡基因家族的脫氧核酶，具體地說涉及一種脫氧核酶 的用途，該脫氧核酶通過抑制特定基因的表達，從而促進腫瘤細胞凋亡，實現化療增敏。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一。目前對于惡性腫瘤的治療，主要采取 以手術治療、放射治療、化學治療等相結合的綜合治療方式。盡管化療藥物使許多腫瘤患者 獲益，但療效仍難以讓人滿意。造成化療失敗的主要原因是腫瘤細胞的原發性和獲得性耐 藥。通過化療增敏策略提高化療藥物的療效，降低其毒副反應是根治腫瘤的重要措施。因 此，低毒高效的化療增敏劑具有廣泛的應用前景和較高的應用價值，加快化療增敏劑的開 發和研究將會為腫瘤治愈帶來新的希望。腫瘤細胞產生化療抗藥性的重要分子機制之一是細胞對化療藥物誘導的凋亡敏 感性降低。細胞凋亡是一種機體發育、應急和清除變異細胞等的重要生理過程。這一過程 的異常可導致機體發生許多病理改變，包括腫瘤、病毒感染、神經性疾病等。細胞凋亡的途 徑主要有兩條一條是通過胞外信號激活細胞內的凋亡酶(caspase)，一條是通過線粒體 釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細胞內的重要蛋白降解，引 起細胞凋亡。細胞凋亡的調控涉及許多基因，包括ICE、Apaf-l、Bcl-2、Fas/AP0-l、c-myc、 p53、ATM 等。bcl-2為凋亡抑制基因，編碼膜整合蛋白，現已發現至少19個同源物，統稱為 bcl-2家族，它們在線粒體參與的凋亡途徑中起調控作用，能控制線粒體中細胞色素C等 凋亡因子的釋放。Bcl-2家族成員都含有1-4個Bcl-2同源結構域(BH1-4)，并且通常有 一個羧端跨膜結構域(transmembrane region，TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結 構域，BH3是與促進凋亡有關的結構域。根據功能和結構可將Bcl-2家族分為兩類一 類是抗凋亡的(anti-apoptotic)，如:Bcl_2、Bcl-xl、Bcl_w、Mcl-I ；一類是促進凋亡的 (pro-apoptotic)，如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。在促凋亡蛋白中還有一類是僅含BH3結構 域的，如Bid、Bad。雖然Bcl-2蛋白存在于線粒體膜、內質網膜以及外核膜上，但主要定位 于線粒體外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多數促凋亡蛋白則主要定位于細胞質，一旦 細胞受到凋亡因子的誘導，它們可以向線粒體轉位，通過寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通 道，或者開啟線粒體的PT孔，從而導致線粒體中的凋亡因子釋放，激活caspase，導致細胞 凋亡。研究表明，許多腫瘤均出現細胞凋亡的失調，并伴隨著抗凋亡基因的高表達，導致腫 瘤細胞過度生長和化療抵抗。特異性地抑制抗凋亡基因表達可望增加腫瘤細胞對化療藥物 的敏感性。脫氧核酶(deoxyribozyme，又稱DNAzyme)是利用體外分子進化技術獲得的一種 具有催化功能的短片段單鏈DNA，具有高效的催化活性和結構識別能力。脫氧核酶將高效 的催化降解能力與反義的靶向識別能力結合，能夠特異地針對靶標從mRNA水平關閉靶基 因，從而調控目標蛋白質的表達，是一種高效特異的靶向基因治療的新策略。脫氧核酶獨特的化學本質為脫氧寡核苷酸，性質相對穩定；分子量小，結構相對簡單，對底物的趨近性好； 催化效率及特異性高，副作用低；靶位點選擇的限制更少；易于合成，價格低廉。研究表明， 與其他幾種從mRNA水平關閉致病基因的方法相比，脫氧核酶能夠特異地針對靶標從mRNA 水平關閉靶基因，是一種高效的靶向基因治療的新的策略，并已在抗病毒及抗腫瘤等領域 廣泛應用。利用脫氧核酶抑制疾病相關基因，例如，癌基因和抗細胞凋亡基因，是一種新型 的靶向治療腫瘤的手段。
發明內容
本發明的目的是提供一類有效的治療或輔助治療腫瘤的靶向藥物。本發明的脫氧核酶通過抑制抗凋亡基因的表達，增強腫瘤化療敏感性。脫氧核酶 是一種新型的基因抑制劑，其具有反義寡核苷酸的化學穩定性，同時又具有核酶的催化切 割RNA的功能，且其合成費用很低。基于這些獨特的優點，該技術已被廣泛用于體內和體外 的基因調控(Sun 等 Pharmacol. Rev. 52 (3) :325_347)。本發明提供一種脫氧核酶，用于制備增強腫瘤化療敏感性的藥物，其包含一催化功能序列，為脫氧核苷酸序列5’ -GGCTAGCTACAACGA-3，；連接催化功能序列5’端的第一結合序列，由7-12個核苷酸組成，互補于bcl-2家 族中細胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位點的3’端序列，其中*代表切割點， R代表A或G，Y代表U或C;和連接催化功能序列3’端的第二結合序列，由7-12個核苷酸組成，互補于bcl-2家 族中細胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位點的5’端序列。所述脫氧核酶是一種DNA分子，可特異性地識別并切割靶mRNA或pre-mRNA中任 一嘌呤核苷酸與嘧啶核苷酸的連接鍵，其結構和作用機制如圖1所示，其中N = G，U，C或 A ；R*Y為切割位點；R = A或G ;Y = U或C ；5’端結合序列(即上述第一結合序列)互補于 包括所述Y在內的切割位點的3’端序列；3’端結合序列(即上述第二結合序列)互補于 不包括所述R在內的切割位點的5’端序列。本發明脫氧核酶靶向的Bcl-2家族基因包括Bcl-2，Bcl-xL, Bcl-w, Bf 1-1， brag-1, Mcl-I，Al等細胞凋亡抑制基因。Bcl_2家族基因的異常表達可引起細胞高度增殖 和凋亡受阻。對Bcl-2家族基因表達的抑制可促進腫瘤細胞的凋亡，增強對化療藥物的敏 感性。首選的靶基因為Bcl-2和Bcl-xL。代表性的脫氧核酶序列如序列表中SEQ ID No. 1 和2。所述脫氧核酶一般由29 39核苷酸組成，自5’到3’的方向由磷酸二酯鍵連接。 為增強脫氧核酶的穩定性，可對其結合序列中的磷酸二酯鍵進行化學修飾以提高脫氧核酶 的抗酸和抗酶降解的能力，例如，采用硫代磷酸二酯鍵，使所述第一結合序列和/或第二結 合序列各含有1-6個硫代磷酸二酯鍵。采用鎖核酸(Locked nucleic acids, LNA)和肽核 酸(ρ印tide nucleic acids, PNA)形式的修飾也能夠提高脫氧核酶的穩定性。此外，脫氧 核酶穩定性的增強還可以通過對結合序列進行其他化學修飾實現，包括1)對堿基、糖基的修飾和主干結構的修飾。對堿基的修飾，例如，甲基化堿基、羥 甲基化的堿基等。對糖基的修飾，例如2’位、3’位取代的核糖核酸或脫氧核糖核酸。核糖 基和單核苷酸之間的連接鍵稱為核酸的主干結構。對主干結構的修飾包括連接鍵以及其它可以增強穩定性和親和性的修飾，例如，對糖基結構的修飾。具體的例子有，在堿基相對 于天然右旋異構體糖為反向時，可使用左旋(L-)異構體脫氧核糖；或將糖基的2’_羥基用 2’ -鹵素元素，2’ -0-烷基，2’ -0-烷基-η (0-烷基)取代；或者使用下列連接鍵甲基磷酸 二酯鍵。本發明的脫氧核酶可具有部分修飾，或全部修飾，或是不同修飾的組合。優選的是 2’ -0-甲基修飾。2)末端保護在分子的末端加入保護基因，以防止分子的降解。這種保護可以是 5’端，也可以是3’端，或是兩端均被保護。例如，在末端反向連接核苷酸殘基；末端核苷 酸為雙脫氧核苷酸；末端肽鍵連接；在末端核苷酸的糖基2’或3’位連接甲磷酸基、烷基、 芳基、蟲草素(cordyc印in)，阿糖胞苷(cytosine arabanoside)、烷氧基(如甲氧基、乙氧 基等)、熒光素、二氮苯基、膽固醇、生物素、吖啶(acridine)、羅丹明補骨脂素(rhodamine psoralen)、甘油基(glyceryl)、丁醇基、丁基或己醇基。優選的是在3’端3’_3’反向連接。用本發明所述的脫氧核酶作為活性物質可以制備多種抑制腫瘤生長和增強腫 瘤化療敏感性的藥物。所述脫氧核酶可以與化療藥物組成藥物組合物使用，其中所述化 療藥物主要包括，但不限于柔紅霉素(daunorubicin)、更生霉素(dactinomycin)、阿 霉素(doxorubicin)、博來霉素(bleomycin)、絲裂霉素(mitomycin)、氮芥(nitrogen mustard)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(苯丙氨酸氮芥，melphalan)、環磷酰胺 (cyclophosphamide)、6_ 疏基口票吟(6-mercaptopurine)、6_ 硫鳥 O票吟(6-thioguanine)、 阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-f lurouracil)、氟尿苷(f loxuridine)、甲氨 蝶呤(methotrexate)、秋水仙堿(colchicine)、長春新堿(vincristine)、長春花堿 (vinblastin)、依托泊甙(etoposide)、順鉬(cisplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)等。所述 藥物組合物中可以含有各種藥學上可接受的賦形劑、輔劑。所述藥物組合物中，可以含有一 種或幾種所述脫氧核酶，比如含有二種、三種、四種、五種或五種以上的脫氧核酶，靶向相同 或不同的bcl-2家族中的細胞凋亡抑制基因。本發明提供的脫氧核酶對于動物或人的給藥劑量為每公斤體重1 50mg。本發明所提供的脫氧核酶藥物或藥物組合物的功能效應可用本領域熟知的方法 進行測定。這些方法包括體內和體外的，例如，通過體外選擇獲取有效脫氧核酶；在細胞培 養系統中分析其對靶基因表達的影響和對細胞表型的影響；在體內模型和臨床試驗中，測 定藥物或藥物組合物的生物學效應，包括藥效、藥理、藥劑、毒理等。體內模型包括建立的疾 病動物模型和正常動物。本發明的藥物或藥物組合物可以采用非腸道的，口服或局部的給藥方式。本發明的藥物或藥物組合物可按本技術領域熟知的技術進行制備。藥用載體的選 擇可根據制劑類型和給藥途徑而定，制劑類型例如噴霧劑、栓劑、片劑、液體等，給藥途徑例 如靜脈注射、口服、骨髓注射等。賦形劑可含幾種藥用載體。另外，藥物組合物中所含的穩 定劑、防腐劑以及其它的成份一般為藥物組合物重量的0. 5 % 2 %。本技術領域的技術人 員可確定出適當的給藥方式和遞藥系統。本發明的藥物組合物可按要求制成不同的劑型，包括液體、片劑、藥丸、粒狀、粉 末、軟膏、乳劑、針劑或栓劑。任何藥物可接受的介質和輔劑均可使用，例如，水、甘油、油類、 乙醇、調味劑、防腐劑、食物染料等用于液體制劑，淀粉、糖、稀釋劑、顆粒劑、潤滑劑、粘合 劑、分散劑等用于制備固體制劑。
注射用制劑為脫氧核酶的水溶液，溶劑為符合藥用標準的水或生理鹽水。注射用 液體還可以含適當的液體介質、懸浮劑以及可以調節滲透壓的制劑、防腐劑等。實際制作方 法和程序對于一個本領域的技術人員來說是熟知的。局部用藥劑型可以制成乳劑、敷料、凝膠、洗液、軟膏、液體等。可以加入表面活性 劑，以增加藥物的深層穿透。這些表面活性劑包括天然的，也可以是化學合成的，例如異丙 十四烷酸鹽。噴霧劑型的制備可采用將脫氧核酶溶于或懸浮于噴發劑或噴發劑與溶劑中，例如 乙醇作為溶劑。在局部用藥劑型和噴霧劑型中，藥物比例(脫氧核酶)一般為總重量的 0. 001% 40%。栓劑的制備可以將脫氧核酶與脂質介質混合而制成，例如可可油(theobroma oil)、可可奶油、甘油、明膠或聚氧乙烯二醇。脫氧核酶還可以制成脂質體，以增加寡核苷酸在體內的半衰期。所用脂 類包括，但不限于，心磷脂(Cardiolipin)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(dimyristoyl phosphatidylcholine)、二棕櫚酉先磷月旨酉先膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine)、二油 酰磷脂酰膽堿(dioleoyl phosphatidylcholine)、磷脂酰甘油(phosphatidyl glycerol)、 palmitoyloleoyl phosphatidylcholine、palmitoyloleoyl phosphatidyl glycerol> 磷脂酸(phosphatidic acid)、溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid)、磷脂酰絲氨酸 (phosphatidyl serine)、憐月旨酷肌醇(phosphatidyl inositol)、膽固醇(cholesterol)。當實施腫瘤內注射給藥時，每1 10天可給藥一個劑量單位，或每天給藥1 10 個劑量單位，直到治愈，或癥狀得到減輕。在有些情況下，在化療前1-24小時給藥，用藥劑 量為每天1 4個劑量單位。在有些情況下，病人按醫囑每天用藥2 3個劑量單位。
圖1是脫氧核酶的結構和作用機制示意圖。圖2顯示了靶向Bcl-2的脫氧核酶DT895在前列腺癌細胞PC3、膀胱癌細胞T24和 乳腺癌細胞MDA-MB231中對Bcl_2表達的抑制作用，其中=Cells指未對細胞進行轉染的情 況；TMP指只用轉染試劑TMP轉染細胞的情況；ctrl指無關對照；DT895指利用轉染試劑TMP 用2mM濃度的脫氧核酶DT895轉染細胞的情況。圖3顯示了靶向Bcl-xL的脫氧核酶DT882在前列腺癌細胞PC3、膀胱癌細胞T24、 肺癌細胞A549、鼻咽癌細胞CNE-I和結腸癌細胞HCTl 16中對Bcl_xL表達的抑制作用，其 中=Cells指未對細胞進行轉染的情況；TMP指只用轉染試劑TMP轉染細胞的情況；ctrl指 無關對照；DT882指利用轉染試劑TMP用2mM濃度的脫氧核酶DT882轉染細胞的情況。圖4顯示了實施例3中Bcl-2的脫氧核酶DT895體內化療增敏效應實驗結果，其 中A為前列腺癌模型，B為乳腺癌模型。圖5顯示了實施例4中Bcl-xL的脫氧核酶DT882體內化療增敏效應實驗結果，其 中A為前列腺癌模型，B為乳腺癌模型
具體實施例方式下面通過實施例進一步詳細描述本發明，但不以任何方式限制本發明的范圍。
實施例1 靶向bcl-2和bcl-xL mRNA的脫氧核酶對靶基因表達的抑制作用Bcl-2和Bcl-xL在許多腫瘤中均為高表達，包括惡性皮膚腫瘤、鼻咽癌、乳腺癌、 結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等。靶向抑制Bcl-2或Bcl-xL表達可促進腫瘤細胞凋亡， 增強化療敏感性。本實施例中，通過對bcl-2和bcl-xLmRNA的掃描，找出AU和⑶切割位點，并設計 脫氧核酶，進行酶-底物復合物熱動力學穩定性分析kcal/mol)，體外切割能力的 評價，篩選出兩個分別靶向bcl-2和bcl-xL的脫氧核酶DT895和DT882。其序列為DT895 :5’ -CCCAGTTCAGGCTAGCTACAACGACCCGTCCCT-3’ (SEQ ID No. 1)DT882 5' -TTTTTATAAGGCTAGCTACAACGAAGGGATGGG-3’ (SEQ ID No. 2)進一步對DT895和DT882進行了化學修飾(在最5，端和最3，端，分別引入3個 硫代磷酸二酯鍵；3’端引入一個反向連接的T)后，分別將DT895和DT912脫氧核酶轉染至 不同腫瘤細胞中，提取細胞蛋白，利用Western blot分析脫氧核酶對bcl_2和bcl_xL表達 的抑制效應。如圖2所示，DT895脫氧核酶可抑制Bcl-2在前列腺癌細胞PC3、膀胱癌細胞 T24和乳腺癌細胞MDA-MB231中的表達。如圖3所示，DT882脫氧核酶可抑制Bcl-xL在前 列腺癌細胞PC3、膀胱癌細胞系T24、肺癌細胞系A549，結腸癌細胞系HCTl 16和鼻咽癌細胞 系CNEl中的表達。實施例2 靶向Bcl-2和bcl-xL的脫氧核酶體外化療增敏效應在確認了靶向Bcl-2和Bcl-xL的脫氧核酶在細胞內可特異性地抑制靶基因的表 達后，分別將DT895和DT882脫氧核酶轉染進入一系列腫瘤細胞，觀察脫氧核酶本身及脫氧 核酶與抗癌藥物紫杉醇(Taxol)合用對腫瘤細胞凋亡的影響。細胞凋亡分析采用流式細胞 儀，以PI染色方法測定sub-Gl細胞群(凋亡細胞群)的比例。如表1所示，靶向Bcl-2或 Bcl-xL的脫氧核酶單獨使用(2mM)均可誘導腫瘤細胞發生凋亡。當靶向Bcl_2或Bcl-xL 的脫氧核酶(2mM)與TaXOl(50nM)合用時，受處理細胞的凋亡比例顯著增強，且這種促化療 敏感性作用對不同腫瘤均有效果。對照為無關寡核苷酸。表1.靶向Bcl-2和Bcl-xL脫氧核酶的體外化療增敏效應
權利要求
一種脫氧核酶在制備增強腫瘤化療敏感性的藥物中的應用，其特征在于，所述脫氧核酶包含一催化功能序列，為脫氧核苷酸序列5’ GGCTAGCTACAACGA 3’；連接催化功能序列5’端的第一結合序列，由7 12個核苷酸組成，互補于bcl 2家族中細胞凋亡抑制基因mRNA或pre mRNA的R*Y切割位點的3’端序列；和連接催化功能序列3’端的第二結合序列，由7 12個核苷酸組成，互補于bcl 2家族中細胞凋亡抑制基因mRNA或pre mRNA的R*Y切割位點的5’端序列；在R*Y中，*代表切割點，R代表A或G，Y代表U或C。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述脫氧核酶是由29-39個核苷酸連接而成 的寡核苷酸。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述細胞凋亡抑制基因是Bcl-2，Bcl-xL, Bcl-w, Bfl-1, brag-1, Mcl-1 或 Al。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述脫氧核酶為序列表中SEQID No. 1或2 所示的核苷酸序列。
5.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述脫氧核酶在第一和第二結合序列中至 少具有一種化學修飾。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述脫氧核酶的第一結合序列和/或第二結 合序列中各含有1-6個硫代磷酸二酯鍵。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述化學修飾選自末端反向連接，核糖基 2’ -0-甲基，鎖核酸和肽核酸。
8.如權利要求1所述的應用，其特征在于，將所述脫氧核酶與化療藥物組成藥物組合 物，該藥物組合物中含有一種或多種所述脫氧核酶，靶向相同或不同的bcl-2家族中的細 胞凋亡抑制基因。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述化療藥物選自下列藥物中的一種或多 種柔紅霉素、更生霉素、阿霉素、博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法侖、環磷酰 胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、秋水仙堿、長春新 堿、長春花堿、依托泊甙、順鉬和紫杉醇。
全文摘要
本發明公開了脫氧核酶在制備增強腫瘤化療敏感性的藥物中的應用，所述脫氧核酶包含一具有催化功能的脫氧核苷酸序列5’-GGCTAGCTACAACGA-3’；分別連接催化功能序列5’端和3’端的第一和第二結合序列，分別由7-12個核苷酸組成，互補于bcl-2家族中細胞凋亡抑制基因mRNA或pre-mRNA的R*Y切割位點的3’端和5’端序列。通過該脫氧核酶特異性識別并切割凋亡抑制基因的mRNA或pre-mRNA，降低凋亡抑制基因的表達，使腫瘤細胞對化療藥物的敏感性增強。
文檔編號A61P35/00GK101940783SQ20101024590
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者孫侖泉 申請人:孫侖泉