放射線敏感性腫瘤靶向啟動子及用途的制作方法

專利名稱：放射線敏感性腫瘤靶向啟動子及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，更具體涉及一種放射線敏感性腫瘤靶向啟動子，即對腫瘤靶向性端粒酶逆轉錄酶基因啟動子進行修飾而得到修飾的啟動子，還涉及利用該修飾了的啟動子調控辣根過氧化物酶(HRP)/吲哚乙酸(IAA)自殺基因系統在破壞和抑制宮頸癌、肺癌、肝癌細胞生長的藥物中的應用。

背景技術：
縱觀國內外的疾病譜變化模式，惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的重大疾病。隨著分子生物學的進步，基因治療為戰勝腫瘤帶來了希望。各國在惡性腫瘤基因治療方面開展了大量研究并取得了一定成果，部分基因治療方案已經用于臨床，從安全性考慮，可以說適于腫瘤治療。例如，中國擁有自主知識產權的重組人p53腺病毒注射液已獲得國家食品藥品監督管理局批準的新藥證書，用于治療頭頸部癌癥和胃癌等惡性腫瘤。
基因治療的關鍵是靶向性問題，也就是把治療效應限定在特定的靶細胞、靶組織或靶器官內，既達到治療作用又不影響正常細胞和組織。外源調控在基因治療中尤為重要。為了能特異而有效地殺傷腫瘤細胞，需要建立一種特異性高、活性強的啟動子，來控制下游目的基因的表達。
啟動子是基因的組成部分之一，控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達的程度。基因治療中，基因表達載體(質粒、病毒載體等)通過啟動子調控其下游治療基因的表達，達到特定的治療目的。腫瘤特異性啟動子能夠調控治療基因只在腫瘤細胞中表達，從而降低對正常細胞的損傷。通過腫瘤特異性啟動子調控目的基因的表達被廣泛地運用于腫瘤靶向基因治療的研究中，這種方法遇到的困難在于，1.絕大多數選擇性啟動子只針對特殊的組織來源，而沒有能夠適用于不同組織來源的啟動子；2.絕大多數選擇性啟動子啟動效力較弱，很難達到治療水平的轉基因表達。到目前為止，幾乎沒有既有高特異性，又有高活性的腫瘤特異性啟動子，這直接阻礙了基因治療的發展。目前，hTERT基因啟動子已被大多數學者公認為是針對惡性腫瘤普遍性較好的腫瘤特異性啟動子，是較有希望應用于腫瘤靶向基因治療的啟動子。提高基因治療中hTERT啟動子活性，將有助于下游治療基因的表達、提高療效，這一點我們在治療過程中應當重點考慮。
端粒酶是一種核糖核蛋白復合物，能夠維持染色體末端的端粒長度。端粒酶在超過85％的人類惡性腫瘤細胞中具有高活性，而在正常組織(除生殖細胞和有高度復制潛能的體細胞)中被抑制或不表達(見參考文獻Shay JW，BacchettiS.A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer，1997，33787-791)。細胞中hTERT的表達是端粒酶活性的主要決定因素，它在大部分腫瘤細胞中高表達(見參考文獻Cong YS，Wright WE，Shay JW.Human telomeraseand its regulation.Microbiol Mol Biol Rev，2002，66407-425)。hTERT基因啟動子作為腫瘤特異性啟動子被運用到多種腫瘤的靶向基因治療方案中，但其活性較弱，下游基因表達產物往往難以實現理想的效果(見參考文獻Gu J andFang BTelomerase promoter-driven cancer gene therapy.Cancer Biol Ther，2003，2S64-S70)。如果能夠增強hTERT基因啟動子的活性，必將推動腫瘤靶向治療的進步，具有重要的理論和臨床意義。
hTERT基因啟動子雖然具有明顯的腫瘤特異性，但其活性較弱，下游基因表達產物往往難以達到理想的效果(見參考文獻J.Gu，B.Fang，Telomerasepromoter-driven cancer gene therapy，Cancer Biol Ther，2003，2S64-70；W.N.Keith，A.Bilsland，M.Hardie，T.R.Evans，Drug insightCancer cellimmortality-telomerase as a target for novel cancer gene therapies，NatClin Pract Oncol，2004，188-96)。研究發現射線能夠增強人端粒酶逆轉錄酶基因(hTERT)啟動子活性，在基因治療時提高其下游治療基因的表達。在細胞和動物水平，聯合治療組與單純基因治療和單純放療相比，具有更加明顯的殺傷效果(見參考文獻廖正凱，周云峰，謝叢華等，γ射線增強喉癌細胞hTERT啟動子活性研究，中華放射醫學與防護雜志，2008，28；104-107；黃成虎，廖正凱，周福祥等.hTERT啟動子在腫瘤基因放療中的動物研究，中華腫瘤雜志，2008，30；733-736)。Wang等運用SV40增強子，CMV增強子，CMV增強子/啟動子及SV40-CMV雙增強子分別增強啟動子轉錄活性，調控雙自殺融合基因CDTK載體對宮頸癌Hela的殺傷作用，發現均能提高hTERT啟動子的活性(見參考文獻WANG Lina，ZHANGYakun，ZHOU Yin，et al.In vitro research of enhanced suicide gene vectorfor cervix cancer therapy.ChinMed Eng，2006，14567-570)。可見對hTERT啟動子的修飾和改造可能提高其活性，且不影響其腫瘤特異性表達。
在1992年首次證明早期生長反應因子-1(EGR-1)基因啟動子輻射反應元件(CArG)賦予了EGR-1基因啟動子對X線的敏感性后(見參考文獻Datta R，Rubin E，Sukhatme V，et al..Ionizing radiation activates transcriptionof the EGR-1 gene via CArG elements.Proc Natl Acad Sci USA 1992，89(21)10149-10153)，又有證明表明人工合成的CArG啟動子經放射線照射后具有有效、特異的啟動活性(見參考文獻Marples B，Scott SK，Hendry JH，etal.，Development of synthetic promoters for radiation-mediated genetherapy.Cene Ther，2000，7(6)511-517；Scott SD，Marples B，Hendry JH，et al..A radiation-controlled molecular switch for use in gene therapyof cancer.Cene Ther，2000，7(13)1121-1125)，近年來多項研究證實，CArG元件可直接感受電離輻射的刺激而誘導其下游基因的表達(見參考文獻MarplesB，Greco O Joiner MC，et al..Molecul arapproaches to chemo-radiotherapy.Eur J Cancer 2002，38(2)231-239；Scott SD，Joiner MC，Marples B.Optimizing radiation-responsive gene promoters for radiogenetic cancertherapy.Gene Ther，2002，9(20)；1396-1402)。人工合成Egr-1啟動子比野生型啟動子有明顯優勢。Marples報道人工合成單純含有若干串聯的CArG元件的堿基序列具有與野生型Egr-1啟動子相同的放射誘導功能，甚至這種合成的啟動子有更強的誘導能力(見參考文獻Marples B，Scott SK，Hendry JH，et al.，Development of synthetic promoters for radiation-mediated gene therapy.Cene Ther，2000，7(6)511-517；Scott SD，Marples B，Hendry JH et al..A radiation-controlled molecular switch for use in gene therapy of cancer.Cene Ther，2000，7(13)1121-1125；Weichselbaum RR，Hallahan DE，BeckettMA，et al..Gene therapy targeted by radiation preferentiallyradiosensitizes tumor cells.Cancer Res，1994，54(16)4266-4269；MarplesB，Greco O，Joiner MC，et al..Molecular approaches to chemo-radiotherapy.Eur J Cancer，2002，38(2)231-239；Scott SD，Joiner MC，Marples B.Optimizing radiation-responsive gene promoters for radiogenetic cancertherapy.Gene Ther，2002，9(20)1396-1402)，提示以CArG元件為基礎而合成的放射誘導啟動子有望在將來基因治療中發揮重要作用。另一些學者將CArG元件與另一種啟動子組成雙啟動子，發現在CArG元件與CMV核心啟動子組成的雙啟動子中，4個CArG元件可以明顯地加強后者的啟動作用(見參考文獻Marples B，Scott SK，Hendry JH，et al.，Development of synthetic promotersfor radiation-mediated gene therapy.Cene Ther，2000，7(6)511-517)。
國內外目前沒有將放射反應元件CArG與端粒酶逆轉錄酶啟動子hTERT串聯，以及將嵌合啟動子串聯CMV啟動子的雙啟動子，并聯合放射線提高他們調控下游基因表達的相關研究，但有理由相信，對于啟動子的有目的的改造可以有效的提高其啟動活性，增加下游治療基因的表達，是有前景的提高基因治療療效的途徑。
基因導向性酶前體藥物療法(gene-directed enzymeprodrug therapy，GDEPT)，亦稱自殺基因療法，是目前基因治療領域研究的熱點。其原理為當基因在腫瘤細胞中表達時可將全身給藥的無毒性或毒性極低的藥物前體轉變成毒性代謝產物，在腫瘤局部殺傷腫瘤細胞，避免全身或局部直接給藥的副作用。人單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鳥苷(GCV)系統和胞嘧啶脫氨酶(CD)/5-氟胞嘧啶(5-FU)系統都是被廣泛研究的自殺基因治療體系。辣根過氧化物酶(HRP)/吲哚乙酸(IAA)系統是新一代前藥系統，與經典的HSV-TK/GCV系統相比具有更加快速和高效的腫瘤細胞殺傷作用(見參考文獻Greco O，Folkes LK，Wardman P，et al.Development of a novel enzyme/prodrug combination forgene therapy of cancerhorseradish peroxidase/indole-3-acetic acid.Cancer Gene Ther，2000，71414-1420)。無毒的HRP/IAA系統顯示出不依賴于細胞連接的細胞毒性和旁觀者效應，在極端的腫瘤細胞缺氧條件下甚至更加高效，而且它能夠有效地增強腫瘤細胞的放射敏感性(見參考文獻Greco O，Rossiter S，Kanthou C，et al.Horseradish peroxidase-mediated gene therapychoice of prodrugs in oxic and anoxic tumor conditions.Mol Cancer Ther，2001，1151-160；Greco O，Tozer GM，Dachs GU.Oxic and anoxic enhancementof radiation-mediated toxicity by horseradish peroxidase/indole-3-acetic acid gene therapy.Int J Radiat Biol，2002，78173-81)，HRP/IAA系統是一種理想的基因治療選擇。HRP基因在腫瘤細胞中特異性表達是HRP/IAA系統發揮優勢的關鍵。同時提示了將HRP/IAA系統與放射線的協同作用的誘人前景。


發明內容
本發明的目的是在于提供了放射線可誘導的腫瘤靶向啟動子。它在大部分腫瘤細胞具有啟動活性，而在正常細胞中活性很低，即具有針對腫瘤細胞的特異性活性。同時，射線照射可提高啟動子下游治療基因的表達。利用放射線的可控性，能夠實現靶向增強啟動子活性。因此，本發明所述的嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp以及(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4、6、8、10)具有腫瘤靶向和高效的特點，適用于腫瘤靶向基因治療。
本發明再一個目的是提供了放射線可誘導的腫瘤靶向啟動子調控辣根過氧化物酶(HRP)/吲哚乙酸(IAA)自殺基因系統在制備治療或預防宮頸癌、肺癌、肝癌細胞藥物中的應用，即(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA聯合放療作為在制備治療或預防宮頸癌、肺癌、肝癌細胞藥物中的應用。此方案與單用放療方案、單用(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA、以及兩者療效簡單相加比較，對宮頸癌、肺癌、肝癌細胞具有更加明顯的殺傷作用。嵌合啟動子保證HRP/IAA只在腫瘤細胞局部發揮殺傷作用，具有腫瘤特異性。而且，放射線具有可控性的特點，即增強腫瘤局部療效的同時不增加對正常細胞的損傷。
本發明采用多種人類腫瘤(宮頸癌、肺癌、肝癌)細胞進行研究，通過放射線聯合嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp或(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4、6、8、10)調控的下游熒光素酶報告基因(Luc)的表達，評價啟動子在腫瘤細胞和正常細胞中的活性，以及射線對嵌合啟動子活性的影響。構建含嵌合啟動子調控下游HRP基因表達的質粒，通過RT-PCR在mRNA水平、Western blot在蛋白質水平評價嵌合啟動子調控下游治療基因表達的可行性及放射誘導性，并且，通過檢測細胞增殖率、細胞凋亡率來評價射線聯合嵌合啟動子調控HRP/IAA系統的協同殺傷作用和機制。具體發明內容如下 放射線可誘導的腫瘤靶向啟動子，其步驟是 A.嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp的構建 1)在hTERT啟動子上下游添加酶切位點Horikawa Izumi教授(NIH/NCI)通過PCR擴增出hTERT啟動子全長(-3915至+40)通過酶切截取不同長度的啟動子序列并比較它們的啟動活性，結果發現含有-385至+40的hTERT啟動子具有較高活性(見參考文獻Horikawa，I.，Cable，P.L.，Mazur，S.J.et al..DownstreamE-box-mediated regulation of the human telomerase reverse transcriptase(hTERT)gene transcriptionevidence for an endogenous mechanism of transcriptionalrepression.Mol Biol Cell，2002；13(8)2585-2597)，Horikawa Izumi教授提供的質粒pBasic-hTERT promoter中含有-385至+40的hTERT啟動子，為了在hTERT前后創造更多的酶切位點以便于后期研究，依據質粒pBasic-hTERT promoter測序結果，參考Genbank數據庫中的核酸序列(AF098956)設計引物hTERT-f5’-CTAGCTAGCGGAATTCGTTACCCCACAGCTTAGGCCGATT-3’；hTERT-r5’-CCGCTCGAGAACTGCAGGGCCAGGGCTTCCCACGTG-3’，并送大連寶生物公司合成。
2)PCR擴增hTERT目的片斷以質粒pBasic-hTERT promoter作為模板，用合成的引物進行PCR擴增，反應條件為94oC預變性5min；然后進入循環94℃30sec，65℃ 30sec，72℃ 30sec 30個循環；72℃延伸5min。將hTERT啟動子的DNA片段擴增出來。用1％(W/V)瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳，用DNA純化回收試劑盒(Qiagen公司)純化。
3)質粒phTERTp-Luc的構建連接PCR產物至Takara公司的pMD-19Tsimple載體中，篩選出正確的質粒pTS-hTERTp，用NheI/XhoI(Fermentas公司)將pTS-hTERTp及目的載體pGL3-Basic(Promega公司)雙酶切，1％(W/V)瓊脂糖凝膠電泳回收純化酶切片段，連接反應后將連接產物轉化至轉化感受態大腸桿菌DH5α(Takara公司)，篩選陽性克隆，將正確的克隆送交Invetrogene公司測序，與Genbank數據庫中的核酸序列(AF098956)比對，正確的克隆命名為質粒phTERTp-Luc，含有hTERTp啟動子(E0)用于后續研究。
4)(CArG)n序列的設計和合成設計并合成四對互補的寡脫氧核糖核酸鏈5′-CGCGTGATAT(CCTTATTTGG)n-3′，5′-AATT(CCAAATAAGG)nATATCA-3′)(n＝4、6、8、10)94℃退火合成串聯的輻射誘導元件，分別命名為(CArG)4、(CArG)6、(CArG)8、(CArG)10。
5)(CArG)n-hTERTp的構建上下游以Mlu I/EcoR I酶切位點為粘性末端；將輻射誘導元件插入MluI/EcoRI(Fermentas公司)雙酶切后的質粒phTERTp-Luc，得到質粒p(CArG)n-hTERTp-luc(n＝4，6，8，10)。將正確的克隆送交測序。測序結果如下 ①.通過測序鑒定(CArG)4-hTERTp啟動子(E4)的序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。構建過程見實施例1。(CArG)4-hTERTp啟動子(E4)具有腫瘤特異性活性，即在正常組織細胞中無活性或活性很低(見實施例2)，而在腫瘤細胞中具有明顯的活性(見實施例3、4、5)。構建含有該啟動子調控下游HRP基因的質粒p(CArG)4-hTERTp-HRP后，轉染不同腫瘤細胞(見實施例1)，發現嵌合啟動子(CArG)4-hTERTp可以調控下游HRP治療基因表達。并且，放射線照射后，嵌合啟動子調控下游治療基因HRP表達量明顯升高(見實施例6)。
②.通過測序鑒定(CArG)6-hTERTp啟動子(E6)的序列為SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。構建過程見實施例1。(CArG)6-hTERTp啟動子(E6)具有腫瘤特異性活性，即在正常組織細胞中無活性或活性很低(見實施例2)，而在腫瘤細胞中具有明顯的活性(見實施例3、4、5)。構建含有該啟動子調控下游HRP基因的質粒p(CArG)6-hTERTp-HRP后，轉染不同腫瘤細胞(見實施例1)，發現嵌合啟動子(CArG)6-hTERTp可以調控下游HRP治療基因表達；放射線照射后，嵌合啟動子調控下游治療基因HRP表達量明顯升高(見實施例6)。放射線與p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA聯合后對人宮頸癌、肺癌、肝癌細胞的殺傷作用明顯增強(見實施例7、8、9)。
③.通過測序鑒定(CArG)8-hTERTp啟動子(E8)的序列為SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。構建過程見實施例1。(CArG)8-hTERTp啟動子(E8)具有腫瘤特異性活性，即在正常組織細胞中無活性或活性很低(見實施例2)，而在腫瘤細胞中具有明顯的活性(見實施例3、4、5)。
④.通過測序鑒定(CArG)10-hTERTp啟動子(E10)的序列為SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。構建過程見實施例1。(CArG)10-hTERTp啟動子(E10)具有腫瘤特異性活性，即在正常組織細胞中無活性或活性很低(見實施例2)，而在腫瘤細胞中具有明顯的活性(見實施例3、4、5)。
B.通過在(CArG)n-hTERTp下游添加CMV啟動子序列得到嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp-CMVp 1)CMV啟動子序列的擴增以質粒pCI-neo(Promega公司)為模板PCR擴增CMV啟動子核心序列，上下游分別添加Pst I/Xho I酶切位點(框內序列)(上游引物5’-ATTCTGCAGGCGATCGCCGG-3’；下游引物5’-GGCCTCGAGAAGCTTCTAGTGATCT-3’)。
2)質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc的構建用Pst I/Xho I分別雙酶切PCR產物和質粒p(CArG)4-hTERTp-luc(見實施例2)，即將CMV啟動子序列插入(CArG)4-hTERTp啟動子下游得到(CArG)4-hTERTp-CMVp啟動子，連接后送交測序，得到的正確克隆命名為質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-Luc。
3)通過測序鑒定(CArG)4-hTERTp-CMVp啟動子(ET)序列為SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。構建過程見實施例1。(CArG)4-hTERTp-CMVp啟動子(ET)具有腫瘤特異性活性，即在正常組織細胞中無活性或活性很低(見實施例2)，而在腫瘤細胞中具有明顯的活性(見實施例3、4、5)。構建質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP后轉染不同腫瘤細胞(見實施例1)，發現嵌合啟動子(CArG)4-hTERTp-CMVp可以調控下游HRP治療基因表達，并且，放射線照射后，嵌合啟動子調控下游治療基因HRP表達相應提高(見實施例6)。放射線與p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA聯合后對人宮頸癌、肺癌、肝癌細胞的殺傷作用明顯增強(見實施例7、8、9)。
C.質粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP、p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP的構建和鑒定 1)pRK-HRP(見實施例1)質粒含有辣根過氧化物酶(HRP)編碼序列，由Cutler教授等通過人工合成的方法得到(見參考文獻Connolly CN，FutterCE，Gibson A，et al.Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase.J Cell Biol，1994，127(3)641-652)經BamHI單酶切回收得到HRP片段，通過BglII同尾酶分別插入質粒phTERTp-luc、質粒p(CArG)6-hTERTp-luc和質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc中啟動子的下游，得到質粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP(見實施例1)。
2)酶切鑒定PstI單酶切質粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP，1.7％(W/V)瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切片段。
3)實驗結果如圖1顯示，質粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP經酶切后分別得到1040bp，1040bp，1140bp片段，與預期結果相符，說明構建成功。
D.放射線對嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp，(CArG)n-hTERTp-CMVp活性的增強作用(見實施例3、4、5)如圖3所示，質粒p(CArG)n-hTERTp-luc(n＝4、6、8、10，見實施例1)、質粒p(CArG)n-hTERTp-CMVp-luc(n＝4，見實施例1)，質粒pGL3-Basic(陰性對照)和pGL3-control(陽性對照)購于Promega公司，分別和內參質粒pRL-TK(Promega公司)通過脂質體lipofectamine 2000(Invitrogen公司)共轉染人宮頸癌Hela細胞、人肺癌A549細胞、人肝癌MHCC97細胞(中國典型培養物保藏中心)，細胞轉染后24h，分為給予0、2、4、6、8、10Gyγ射線照射，孵育24小時，雙熒光試劑盒(Promega公司)檢測螢火蟲熒光素酶(Luc)和海腎熒光素酶(RL)活性。結果顯示嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp(n＝4、6、8、10，見實施例1)或(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4，見實施例1)在腫瘤細胞Hela，A549，MHCC97細胞中接受放射線照射后活性增強。
E.嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp、(CArG)n-hTERTp-CMVp的腫瘤特異性(見實施例2)如圖2所示，質粒p(CArG)n-hTERTp-luc、質粒p(CArG)n-hTERTp-CMVp-luc，對照質粒pGL3-Basic(陰性對照)和pGL3-control(陽性對照)購于Promega公司，分別和內參質粒pRL-TK(Promega公司)通過脂質體lipofectamine 2000(Invitrogen公司)共轉染人胚肺細胞hEL(中國典型培養物保藏中心)，分為0、2、4、6、8、10Gyγ射線照射組，結果嵌合啟動子活性在正常細胞株hEL中活性明顯低于在對照腫瘤細胞中的活性和放射誘導性，聯系嵌合啟動子在腫瘤細胞中的活性研究結果，證明嵌合啟動子具有腫瘤特異性。
F.放射線與嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp，(CArG)n-hTERTp-CMVp調控HRP/IAA系統基因治療對三種腫瘤細胞Hela，A549，MHCC97的協同殺傷作用(見實施例7、8、9)三種腫瘤細胞分為4組A對照組，B放療組，C基因組，D聯合組；基因組和聯合組轉染p(CArG)n-hTERTp-HRP，p(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP質粒24h后加入終濃度為0.5mmol/L的IAA，放療組和聯合組分別給予6Gy的γ射線照射，孵育24小時，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測各組細胞增殖率，結果顯示，聯合組與放療組、基因組分別比較，增殖率降低更明顯；流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI試劑盒(Invitrogen公司)比較各組細胞凋亡率。結果顯示，聯合組與其它各組比較，早期凋亡率最高。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果 1、將放射反應元件和hTERT啟動子組成的嵌合啟動子為國際首創。
2、本發明表明，嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp、(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4、6、8、10)具有腫瘤特異性和較強的啟動活性，調控下游基因在腫瘤細胞中表達，而在正常細胞中不表達，因此，嵌合啟動子介導的基因治療可以實現腫瘤靶向治療。(見實施例1、2) 3、放射線能增強嵌合啟動子(CArG)n-hTERTp和(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4、6、8、10)的活性，增強下游基因的表達，日益完善的適形放射技術將射線準確地照射到腫瘤組織，實現外源基因表達的時空調控。(見實施例3、4、5、6) 4、本發明表明，放射線與(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA，(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA聯合比單純射線，單純phTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA，及兩者簡單相加獲得的殺傷效果都要明顯，說明他們具有明顯的協同殺傷作用。(見實施例7、8、9) 5、放射治療是臨床治療腫瘤最常規、最重要的方法，hTERT啟動子介導的針對大多數腫瘤細胞的靶向基因治療方案有數百種，改造后的啟動子與hTERT啟動子相比具有靶向高效的特點，應用前景廣闊。
6、放射線敏感性腫瘤靶向啟動子下游可以根據治療目的攜帶不同治療基因，滿足多種腫瘤治療目的需要。而且，聯合放療增強殺傷基因的表達，提高療效。應用于臨床可能實現有效的個體化治療。



圖1嵌合啟動子攜帶下游HRP基因的真核表達載體的酶切鑒定。E0質粒hTERTp-HRP經PstI單酶切后得到1040bp片段；E6質粒p(CArG)6-hTERTp-HRP經PstI單酶切后得到1040bp片段；ETp(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc經PstI單酶切后得到1140bp片段；ControlpGL3-Control-HRP經PstI單酶切后。酶切結果說明成功構建了質粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP。
圖2不同劑量放射線照射后人胚肺細胞hEL中各種啟動子(E0、E4、E6、E8、E10、ET和陰性對照)調控下游熒光素酶基因的相對表達量明顯低于對照組。說明嵌合啟動子聯合放射線在腫瘤細胞中具有高活性，而在端粒酶陰性的正常細胞中無明顯活性，即嵌合啟動子具有腫瘤特異性。
圖3宮頸癌Hela細胞(A)、肺癌A549細胞(B)和肝癌MHCC97細胞(C)中嵌合啟動子(E0、E4、E6、E8、E10、ET和陰性對照)聯合不同劑量放射線誘導下游熒光素酶基因的相對表達量。說明放射線對嵌合啟動子具有明顯的放射可誘導性，且以6Gyγ射線誘導作用最為明顯；而且，(CArG)6-hTERTp啟動子和(CArG)4-hTERTp-CMVp啟動子射線誘導作用最強。
圖4宮頸癌Hela細胞(A)、肺癌A549細胞(B)和肝癌MHCC97細胞(C)中各種啟動子(E0、E6、ET和陰性對照)聯合放射線(0Gy或6Gy照射)調控下游HRP基因mRNA的表達。Hela和A549細胞中，10Gy-EO；20Gy-E6；30Gy-ET；40Gy-陰性對照；66Gy-EO；76Gy-E6；86Gy-ET；96Gy-陰性對照。MHCC97細胞中10Gy-EO；20Gy-陰性對照；30Gy-E6；40Gy-ET；66Gy-EO；76Gy-陰性對照；86Gy-E6；96Gy-ET。結果證明各種嵌合啟動子可以調控下游基因表達，放射線照射后，嵌合啟動子調控下游治療基因HRP的mRNA表達升高。
圖5宮頸癌Hela細胞(A)、肺癌A549細胞(B)和肝癌MHCC97細胞(C)中各種啟動子(E0、E4、E6、ET和陽性對照)聯合放射線調控下游HRP基因HRP蛋白的表達。1pGL3-Control-HRP；2p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP；3p(CArG)6-hTERTp-HRP；4phTERTp-HRP；5p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc；6p(CArG)6-hTERTp-luc。結果證明各種嵌合啟動子可以調控下游基因表達，放射線照射后，嵌合啟動子調控下游治療基因HRP的蛋白水平表達升高。
圖6 MTT法檢測放射線聯合嵌合啟動子攜帶治療基因(HRP)加IAA對不同腫瘤細胞的抑制率。結果顯示在宮頸癌Hela細胞(A)、肺癌A549細胞(B)和肝癌MHCC97細胞(C)中p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA、p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP聯合放射線組中細胞的存活率明顯低于單純放療和單純基因治療組，可見兩者聯合應用對腫瘤細胞的生長起到更顯著的抑制作用。
圖7 Annexin V-FITC/PI法檢測各組細胞早期凋亡率。結果顯示在宮頸癌Hela細胞(A)、肺癌A549細胞(B)和肝癌MHCC97細胞(C)中p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA、p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP聯合放射線組與單純放療和單純基因治療組分別比較，早期凋亡率升高更顯著，可見兩者聯合應用能更加明顯地誘導腫瘤細胞凋亡。

具體實施例方式 下面結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1 嵌合啟動子的構建 1 實驗材料 1.1 質粒質粒pBasic-hTERT promoter由Horikawa教授通過PCR擴增出hTERT啟動子全長(-3915至+40)后通過酶切截取獲得，含有-385至+40的hTERT啟動子(見參考文獻Horikawa，I.，Cable，P.L.，Mazur，S.J.et al..Downstream E-box-mediated regulation of the human telomerasereverse transcriptase(hTERT)gene transcriptionevidence for anendogenous mechanism of transcriptional repression.Mol Biol Cell，2002；13(8)2585-2597)，載體pGL3-Basic、pGL3-Control購于Promega公司。
1.2 試劑及儀器質粒DNA抽提試劑盒(Tiangen公司)；膠回收試劑盒(Omega公司)；PCRMix(Tiangen公司)；限制性內切酶Mlu I、EcoRI、Pst I、Xho I、BamHI、HindIII、T4連接酶、Marker(Fermentas公司)。

530紫外可見光分光光度計(美國Beckman Coulter公司)。
2 實驗方法 1.1 hTERT啟動子添加酶切位點為了在hTERT前后創造更多的酶切位點以便于后期研究，方法如下依據質粒pBasic-hTERT promoter測序結果，參考Genbank中的核酸序列(AF098956)設計引物hTERT-f5’-CTAGCTAGCGGAATTCGTTACCCCACAGCTTAGGCCGATT-3’；hTERT-r5’-CCGCTCGAGAACTGCAGGGCCAGGGCTTCCCACGTG-3’，并送大連寶生物公司合成。
1.2 PCR擴增hTERT目的片斷以質粒pBasic-hTERT promoter作為模板，用合成的一對引物進行PCR擴增，反應條件為94℃預變性5min；然后進入循環94℃ 30sec，65℃ 30sec，72℃ 30sec 30個循環；72℃延伸5min。將hTERT啟動子的DNA片段擴增出來。用1％(W/V)瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳，用Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化。
1.3 質粒phTERTp-Luc的構建連接PCR產物至Takara公司的pMD-19T simple載體中，篩選出正確的質粒pTS-hTERTp，用NheI/XhoI(Fermentas公司)將pTS-hTERTp及目的載體pGL3-Basic(Promega公司)雙酶切，1％(W/V)瓊脂糖凝膠電泳回收純化酶切片段，連接反應后將連接產物轉化至轉化感受態大腸桿菌DH5α(Takara公司)，篩選陽性克隆，將正確的克隆送交測序，與Genbank中的核酸序列(AF098956)比對，正確的克隆phTERTp-Luc用于后續研究。
1.4 質粒p(CArG)n-hTERTp-luc的構建設計四對互補的寡脫氧核糖核酸鏈5′-CGCGTGATAT(CCTTATTTGG)n-3′，5′-AATT(CCAAATAAGG)nATATCA-3′)，n分別為4，6，8，10；94℃退火合成串聯的輻射誘導元件(CArG)4，(CArG)6，(CArG)8，(CArG)10，上下游以Mlu I/EcoR I酶切位點為粘性末端；將輻射誘導元件插入MluI/EcoRI雙酶切后的phTERTp-Luc載體，得到質粒p(CArG)n-hTERTp-luc(n＝4，6，8，10)。
1.5 質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc的構建以pCI-neo(Promega公司)質粒為模板PCR擴增CMV啟動子，上下游分別添加Pst I/Xho I酶切位點(框內序列)(上游引物5’-ATT

GCGATCGCCGG-3’；下游引物5’-GGC

AAGCTTCTAGTGATCT-3’)，用Pst I/XhoI分別雙酶切PCR產物和質粒p(CArG)4-hTERTp-luc，連接后得到質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-Luc。
1.6 質粒phTERTp-HRP、質粒p(CArG)6-hTERTp-HRP、質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP的構建pRK-HRP質粒含有辣根過氧化物酶(HRP)編碼序列，由Cutler教授等通過人工合成的方法得到(見參考文獻Connolly CN，Futter CE，Gibson A，et al.Transport intoand out of the Golgi complex studied by transfecting cells withcDNAs encoding horseradish peroxidase.J Cell Biol，1994，127(3)641-652)經BamHI單酶切回收得到HRP片段，通過BglII同尾酶分別插入質粒phTERTp-luc、p(CArG)6-hTERTp-luc(見實施例1)和質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc，分別得到質粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP。
1.7 酶切鑒定雙酶切質粒p(CArG)n-hTERTp-Luc，2％(W/V)瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切片段；EcoRV/XhoI雙酶切質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-Luc，1.5％(W/V)瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切片段；PstI單酶切phTERTp-HRP，p(CArG)6-hTERTp-HRP，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP，1.7％(W/V)瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切片段。
2 實驗結果 ①.通過測序鑒定(CArG)4-hTERTp啟動子(E4)的序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，與預期結果一致； ②.通過測序鑒定(CArG)6-hTERTp啟動子(E6)的序列為SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，與預期結果一致； ③.通過測序鑒定(CArG)8-hTERTp啟動子(E8)的序列為SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，與預期結果一致； ④.通過測序鑒定(CArG)10-hTERTp啟動子(E10)的序列為SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，與預期結果一致； ⑤通過測序鑒定(CArG)4-hTERTp-CMVp啟動子(ET)序列為SEQ ID NO5所示的核苷酸序列，與預期結果一致； ⑥酶切鑒定結果如圖1所示，質粒phTERTp-HRP，p(CArG)6-hTERTp-HRP，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP經酶切后分別得到1040bp，1040bp，1140bp片段，與預期結果一致，說明構建成果。
實施例2 嵌合啟動子特異性研究 1 實驗材料 1.1 細胞人胚肺細胞hEL，購于中國典型培養物保藏中心。
1.2 質粒嵌合啟動子質粒已由申請人成功構建；內參質粒pRL-TK(Promega公司)和對照質粒pGL3-Basic，pGL3-Control(購于Promega公司)。
1.3 試劑脂質體lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，雙熒光檢測試劑盒購于PROMEGA公司。含10％(V/V)小牛血清的RPMI-1640培養液購自Gibco公司。
1.4 儀器TD-20/20型熒光發光計(美國Tumer Designs公司)，

530紫外可見光分光光度計(美國Beckman Coulter公司)。
2 實驗方法 2.1 細胞轉染轉染前1天，取指數生長期的細胞，胰酶消化，以每孔1×105接種于24孔板，用含5％(V/V)CO2的37℃溫箱孵育24h。將嵌合啟動子質粒、pGL3-Control(陽性對照)和pRL-TK(做為內對照)共同以脂質體Lipofectamine2000介導轉染至hEL細胞，按DNA(μg)Lipofectamine2000(μl)＝0.42轉染，具體操作按脂質體Lipofectamine2000試劑盒說明書進行。細胞轉染后放入含5％(V/V)CO2的37℃溫箱孵育5h后，換含10％(V/V)的小牛血清的RPMI-1640培養基繼續培養。
2.2 放射線處理細胞轉染后24h，分為0、2、4、6、8、10Gyγ射線照射組，每組4個平行孔，用含5％(V/V)CO2的37℃溫箱繼續培養24h，按照雙熒光檢測試劑盒說明書裂解并收集細胞. 2.3 檢測TD-20/20型熒光發光計檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，使用熒光發光計按照雙熒光檢測試劑盒說明書對裂解細胞進行熒光檢測，記錄數據。
2.4 統計學處理各組數據用SPSS 13.0統計軟件(SPSS公司，美國)進行方差分析和組間q檢驗，以p<0.05為差異有統計學意義。
3 實驗結果圖2結果顯示，嵌合啟動子活性在正常細胞株hEL中活性明顯低于在對照腫瘤細胞中的活性，證明嵌合啟動子具有腫瘤特異性。
實施例3 在人宮頸癌Hela細胞中放射線增強嵌合啟動子活性的作用 1 實驗材料 1.1 細胞人宮頸癌Hela細胞(中國典型培養物保藏中心)，常規細胞培養和傳代。
1.2 質粒質粒p(CArG)n-hTERTp-Luc，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-Luc已由申請人成功構建(見實施例1)，內參質粒pRL-TK、陰性對照質粒pGL3-Basic和陽性對照質粒pGL3-Control購于Promega公司。
1.3 試劑脂質體lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，雙熒光檢測試劑盒購于PROMEGA公司。含10％(V/V)小牛血清的RPMI-1640培養液購自Gibco公司。
1.4 儀器TD-20/20型熒光發光計(美國Turner Designs公司)，

530紫外可見光分光光度計(美國Beckman Coulter公司)。
2 實驗方法 2.1 細胞轉染轉染前1天，取指數生長期的細胞，胰酶消化，以每孔1×105接種于24孔板，用含5％(V/V)CO2的37℃溫箱孵育24h。將嵌合啟動子質粒及對照質粒和pRL-TK(做為內對照)共同以脂質體Lipofectamine2000介導轉染至Hela細胞，按DNA(μg)Lipofectamine2000(μl)＝0.42轉染，具體操作按脂質體Lipofectamine2000試劑盒說明書進行。細胞轉染后放入含5％(V/V)CO2的37℃溫箱孵育5h后，換含10％(V/V)的小牛血清的RPMI-1640培養基繼續培養。
2.2 放射線處理細胞轉染后24h，分為0、2、4、6、8、10Gyγ射線照射組，每組4個平行孔，用含5％(V/V)CO2的37℃溫箱繼續培養24h，按照雙熒光檢測試劑盒說明書裂解并收集細胞. 2.3 檢測采用TD-20/20型熒光發光計檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，按照雙熒光檢測試劑盒說明書對裂解細胞進行熒光檢測，記錄數據。
2.4 統計學處理各組數據用SPSS 13.0統計軟件(SPSS公司，美國)進行方差分析和組間q檢驗，以p<0.05為差異有統計學意義。
3 實驗結果請見圖3A。在Hela細胞中，放射線對嵌合啟動子具有明顯的放射誘導作用，且以6Gy γ射線誘導作用最為明顯。而且，射線對啟動子(CArG)6-hTERTp，(CArG)4-hTERTp-CMVp的誘導作用最強。
實施例4 在人肺腺癌A549細胞中放射線增強嵌合啟動子活性的作用 1 實驗材料 1.1 細胞人宮頸癌Hela細胞(中國典型培養物保藏中心)，常規細胞培養和傳代。
1.2 質粒、試劑和儀器同實施例3。
2 實驗方法 2.1 細胞轉染方法同實施例3，細胞為人宮頸癌Hela細胞。
2.2 放射線處理、檢測和統計學處理同實施例3。
3 實驗結果請見圖3B。在A549細胞中，放射線對嵌合啟動子具有明顯的放射誘導作用，且以6Gy γ射線誘導作用最為明顯。而且，射線對啟動子(CArG)6-hTERTp，(CArG)4-hTERTp-CMVp的誘導作用最強。
實施例5 在人肝癌MHCC97細胞中放射線增強嵌合啟動子活性的作用 1 實驗材料 1.1 細胞人肝癌MHCC97細胞(中國典型培養物保藏中心)，常規細胞培養和傳代。
1.2 質粒、試劑和儀器同實施例3。
4 實驗方法 4.1 細胞轉染方法同實施例3，細胞為人肝癌MHCC97細胞。
4.2 放射線處理、檢測和統計學處理同同實施例3。
5 實驗結果請見圖3C。在MHCC97細胞中，放射線對嵌合啟動子具有明顯的放射誘導作用，且以6Gy γ射線誘導作用最為明顯。而且，射線對啟動子(CArG)6-hTERTp，(CArG)4-hTERTp-CMVp的誘導作用最強。
實施例6 嵌合啟動子調控下游治療基因HRP表達的研究 1 實驗材料 1.1 細胞人宮頸癌Hela細胞、人肺癌A549細胞、人肝癌MHCC97細胞均購自中國典型培養物保藏中心，常規細胞培養和傳代。
1.2 質粒p(CArG)4-hTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP及p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP已由申請人構建(見實施例1)。
1.3 試劑含10％(V/V)小牛血清的RPMI-1640培養液購自Gibco公司，脂質體lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，其它試劑見實驗方法部分。十二烷基磺酸鈉(SDS)購自Sigma公司。聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)購自Sigma公司。
2 實驗方法 1.1 逆轉錄酶PCR(RT-PCR)三種腫瘤細胞利用LipofectamineTM 2000試劑(invitrogen公司)瞬時轉染相應質粒載體后24h，用Trizol試劑(MRC公司)提取細胞總RNA，用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)合成cDNA，根據設計的HRP基因引物(正義引物5′CATTCGGGAACGCTAACA3′，反義引物5′CGGACAGAGCCACAAGGT 3′)進行PCR擴增，PCR條件為95°C3分鐘，30個循環(94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘)，72℃延伸7分鐘。PCR產物在2.5％瓊脂糖凝膠中電泳。電泳結果用Genesnap凝膠成像系統(Syngene公司)拍攝圖像，并用Genetools 3.06軟件(Syngene公司)進行條帶分析。以GADPH作為對照，以HRP與GAPDH產量的比值進行比較 1.2 Western blot三種腫瘤細胞利用LipofectamineTM 2000試劑(invitrogen公司)瞬時轉染相應質粒載體后24h，以細胞裂解液(江蘇碧云天生物技術研究所)裂解6孔板細胞，提取蛋白，進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)，轉移至硝酸纖維素薄膜、封閉、加入兔抗辣根過氧化物酶IgG(北京博奧森生物技術有限公司)40C 5h，漂洗后加入辣根酶標記羊抗兔IgG(Pierce公司)常溫2h，漂洗后DAB試劑盒(Zsbio公司)顯色，拍照。GADPH作為內參對照。
1.3 統計分析實驗數據用SPSS 11.5統計軟件進行分析。計量資料用均數±標準差來表示，兩組間比較采用均數t檢驗，采用雙變量相關分析評價兩組數據間的相關性，P<0.05表明差異有顯著性。
3 實驗結果 1.1 嵌合啟動子調控下游治療基因HRP mRNA的表達 RT-PCR檢測放射線誘導后mRNA表達的改變，結果見圖46Gy劑量照射后，p(CArG)4-hTERTp-HRP(E4)和p(CArG)6-hTERTp-HRP(E6)轉染的腫瘤細胞可見明顯的HRP mRNA表達升高(照射后與照射前的比值在HeLa細胞中分別為2.16和2.04，A549細胞中分別為1.32和1.64，MHCC97細胞中分別為1.33和1.43)，然而在pGL3-Control-HRP和phTERTp-HRP轉染的細胞中未見放射后HRPmRNA的顯著升高(照射后與照射前的比值在HeLa細胞中分別為0.997和1.05，A549細胞中為0.66和0.98，MHCC97細胞中為1.02和1.07，均具有統計學差異)。
1.2 嵌合啟動子調控下游治療基因HRP蛋白的表達 Western blotting檢測蛋白的表達見圖5，p(CArG)4-hTERTp-HRP(E4)，p(CArG)6-hTERTp-HRP(E6)，和phTERTp-HRP轉染的三種腫瘤細胞可見到明顯的HRP蛋白表達，而pGL3-Control-luc(陽性對照)轉染的腫瘤細胞未見HRP表達。
4 實驗結論 4.1 構建的質粒p(CArG)4-hTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP及p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP中，嵌合啟動子(CArG)4-hTERTp、(CArG)6-hTERTp、(CArG)4-hTERTp-CMVp可以調控下游基因表達，可以用于基因治療； 4.2 放射線照射后，嵌合啟動子(CArG)4-hTERTp、(CArG)6-hTERTp、(CArG)4-hTERTp-CMVp活性增高(見實施例3、4、5)，在本實驗中證明放射線照射后，嵌合啟動子調控下游治療基因HRP表達相應提高，即射線聯合嵌合啟動子可以提高治療基因的表達。
實施例7 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA或p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA與放射線聯合對人宮頸癌Hela細胞的殺傷作用 1 實驗材料 1.1 細胞人宮頸癌Hela細胞，購自中國典型培養物保藏中心，常規細胞培養和傳代。
1.2 質粒質粒p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP已由申請人成功構建(見實施例1)。
1.3 試劑脂質體lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。吲哚乙酸購于武漢科瑞公司，凋亡試劑盒Annexin V-FITC試劑盒購于武漢博士德公司，Rnase和PI購于天源生物技術公司，MTT和DMSO購于Amresco公司，含10％(V/V)小牛血清的RPMI-1640培養液購自Gibco公司。
1.4 儀器

530紫外可見光分光光度計(美國Beckman Coulter公司)，FC500全自動流式細胞分析儀(美國Beckman Coulter公司)，RT-6000酶標儀(北京六一儀器廠)。
2 實驗方法 2.1 實驗分組實驗分為四組A對照組，Hela細胞未經任何處理；B放療組，6Gy γ射線作用于Hela細胞；C基因組，嵌合啟動子質粒(p(CArG)6-hTERTp-HRP或p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP)轉染Hela細胞后，聯合吲哚乙酸(IAA)；D聯合組，嵌合啟動子質粒轉染Hela細胞后，聯合吲哚乙酸和放射線。
2.2 藥物處理IAA溶于滅菌PBS溶液中，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌備用，細胞轉染后24h，在基因組和聯合組分別加入終濃度為0.5mmol/L的IAA，未加藥組用等體積液體培養基替代IAA。
2.3 放射線處理在細胞轉染24h后，給予放療組和聯合組各6Gy γ射線照射。
2.4 MTT檢測細胞增殖率檢測取指數生長期細胞，胰酶消化后以每孔3×104細胞接種于96孔板(分5組，每組6個平行孔，并設一組空白培養基)，每孔總液量為200ul。用含5％CO2的37℃溫箱孵育24h，將嵌合啟動子質粒按DNA(μg)METAFECTENE(μl)(Biontex公司)＝25轉染介導轉染基因組和聯合組細胞。轉染后24h，處理如2.2，2.3。在處理后24h加入5g/L MTT液20ul，37℃、5％CO2下繼續孵育至48h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150ul，振蕩10min，于30min內在RT-6000酶標儀上測定每孔492nm光的吸收值(A492)。計算各組增殖率增殖率＝(實驗孔A值—空白組A值)/(對照孔A值—空白組A值)×100％。
2.5 Annexin V/PI凋亡檢測試劑檢測細胞凋亡率轉染前1天，取指數生長期的細胞，胰酶消化，以每孔5×105接種于6孔板，用含5％(V/V)CO2的37℃溫箱孵育24h。將嵌合啟動子質粒以脂質體Lipofectamine2000介導轉染細胞，按DNA(μg)Lipofectamine2000(μl)＝25轉染，具體操作按脂質體Lipofectamine2000試劑盒說明書進行。細胞轉染后放入含5％(V/V)CO2的37℃溫箱孵育5h后，換含10％(V/V)的小牛血清的RPMI-1640培養基繼續培養。細胞轉染后24h，處理如2.2，2.3。用去離子水按14稀釋結合緩沖液(20ml結合緩沖液+60ml去離子水)；將每組單細胞懸液離心沉淀(2000rpm，10min)，棄去上清，用4℃預冷的PBS洗細胞兩次，用250ul結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為1×106/ml；取100μl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5ul Annexin V/FITC和10ul 20ug/ml的碘化丙錠溶液；混勻后于室溫(20-25℃)避光孵育15min；在反應管中加400ul PBS，流式細胞儀(FCS)分析；本實驗每組設三個平行樣本，重復三次。
2.6 統計學處理各組數據用SPSS 13.0統計軟件(SPSS公司，美國)進行方差分析和組間q檢驗，以p<0.05為差異有統計學意義。
3 實驗結果 3.1 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA對宮頸癌Hela細胞生長的抑制作用 結果顯示，C組(HRP/IAA基因治療組)細胞增殖率明顯低于A組(對照組)(表1-1，圖6-A，p<0.01)，可見HRP/IAA系統能抑制Hela細胞；C組(HRP/IAA基因治療組)細胞早期凋亡率明顯高于A組(對照組)(圖7-A，表1-2，p<0.01)，可見HRP/IAA系統能有效誘導Hela細胞凋亡。
3.2 放射線聯合p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA對宮頸癌Hela細胞的生長抑制作用 結果顯示，A組(聯合治療組)細胞增殖率分別高于B(放射治療組)、C(基因治療組)兩組；D組細胞早期凋亡率分別高于B、C兩組(圖7-A，表1-2，p<0.01)，可見兩者聯合應用可進一步誘導細胞凋亡。p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA聯合射線組細胞存活率明顯低于單純放療和單純基因治療組(表1-1，圖6-A，p<0.05)，可見兩者聯合應用對宮頸癌Hela細胞的生長起到更顯著的抑制作用。
表1-1 Hela細胞增殖率(x±s％，n＝6)
注與A組相比ap<0.01；與B組相比bp<0.05；與C組相比cp<0.05 表1-2 Hela細胞早期凋亡率(x±s％，n＝3)
注與A組相比ap<0.01；與B組相比bp<0.01；與C組相比cp<0.01 實施例8 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA或p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA與放射線聯合對人肺癌A549細胞的殺傷作用 1 實驗材料 1.1 細胞細胞人肺癌A549細胞，購自中國典型培養物保藏中心，常規細胞培養和傳代。
1.2 質粒、試劑、儀器同實施例6。
2 實驗方法 2.1 實驗分組同實施例6，細胞為人肺癌A549細胞。
2.2 藥物處理、放射線處理、MTT檢測細胞增殖率檢測、Annexin V/PI凋亡檢測試劑檢測細胞凋亡率同實施例6。
3 實驗結果 3.1 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA對人肺癌A549細胞生長的抑制作用 結果顯示，C組(HRP/IAA基因治療組)細胞增殖率明顯低于A組(對照組)(表2-1，圖6-A，p<0.01)，可見HRP/IAA系統能抑制Hela細胞；C組(HRP/IAA基因治療組)細胞早期凋亡率明顯高于A組(對照組)(圖7-A，表2-2，p<0.01)，可見HRP/IAA系統能有效誘導肺癌A549細胞凋亡。
3.2 放射線聯合p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA對肺癌A549細胞的生長抑制作用 結果顯示，A組(聯合治療組)細胞增殖率分別高于B(放射治療組)、C(基因治療組)兩組；D組細胞早期凋亡率分別高于B、C兩組(圖7-A，表2-2，p<0.01)，可見兩者聯合應用可進一步誘導細胞凋亡。p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA聯合射線組細胞存活率明顯低于單純放療和單純基因治療組(表2-1，圖6-A，p<0.05)，可見兩者聯合應用對肺癌A549細胞的生長起到更顯著的抑制作用。
表2-1 A549細胞增殖率(x±s％，n＝6)
注與A組相比ap<0.01；與B組相比bp<0.05；與C組相比cp<0.05 表2-2 A549細胞早期凋亡率(x±s％，n＝3)
注與A組相比ap<0.01；與B組相比bp<0.01；與C組相比cp<0.01 實施例9 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA或p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA與放射線聯合對人肝癌MHCC97細胞的殺傷作用 1 實驗材料 1.1 細胞人肝癌MHCC97細胞，購自中國典型培養物保藏中心，常規細胞培養和傳代。
1.2 質粒、試劑、儀器同實施例6。
2 實驗方法 2.1 實驗分組同實施例6，細胞為人肝癌MHCC97細胞。
2.2 藥物處理、放射線處理、MTT檢測細胞增殖率檢測、Annexin V/PI凋亡檢測試劑檢測細胞凋亡率同實施例6。
3 實驗結果 3.1 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA對人肝癌MHCC97細胞生長的抑制作用 結果顯示，C組(HRP/IAA基因治療組)細胞增殖率明顯低于A組(對照組)(表3-1，圖6-A，p<0.01)，可見HRP/IAA系統能抑制Hela細胞；C組(HRP/IAA基因治療組)細胞早期凋亡率明顯高于A組(對照組)(圖7-A，表3-2，p<0.01)，可見HRP/IAA系統能有效誘導肝癌MHCC97細胞凋亡。
3.2 放射線聯合p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA對肝癌MHCC97細胞的生長抑制作用 結果顯示，A組(聯合治療組)細胞增殖率分別高于B(放射治療組)、C(基因治療組)兩組；D組細胞早期凋亡率分別高于B、C兩組(圖7-A，表3-2，p<0.01)，可見兩者聯合應用可進一步誘導細胞凋亡。p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA聯合射線組細胞存活率明顯低于單純放療和單純基因治療組(表3-1，圖6-A，p<0.05)，可見兩者聯合應用對肝癌MHCC97細胞的生長起到更顯著的抑制作用。
表3-1 MHCC97細胞增殖率(x±s％，n＝6)
注與A組相比ap<0.01；與B組相比bp<0.05；與C組相比cp<0.05 表3-2 MHCC97細胞早期凋亡率(x±s％，n＝3)
注與A組相比ap<0.01；與B組相比bp<0.01；與C組相比cp<0.01
SEQUENCE LISTING
<110>武漢大學
<120>放射線敏感性腫瘤靶向啟動子及用途
<130>放射線敏感性腫瘤靶向啟動子及用途
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
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<213>Cloning vector pGL3-Promoter
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<211>567
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<400>權利要求
1.一種嵌合啟動子(CArG)4-hTERTp，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一種嵌合啟動子(CArG)6-hTERTp，其序列為SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
3.一種嵌合啟動子(CArG)8-hTERTp，其序列為SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
4.一種嵌合啟動子(CArG)10-hTERTp，其序列為SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.一種嵌合啟動子(CArG)4-hTERTp-CMVp，其序列為SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
6.一種質粒p(CArG)6-hTERTp-HRP，其結構含有權利要求2所訴的一種嵌合啟動子，并含有辣根過氧化物酶(HRP)編碼序列。
7.一種質粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP，其結構含有權利要求5所訴的一種嵌合啟動子，并含有辣根過氧化物酶(HRP)編碼序列。
8.權利要求1或2或3或4或5所述的一種嵌合啟動子在通過放射線增強啟動子下游基因表達中的應用。
9.權利要求6或7所述的一種質粒在制備治療或預防宮頸癌藥物中的應用。
10.權利要求6或7所述的一種質粒在制備治療或預防肺癌藥物中的應用。
11.權利要求6或7所述的一種質粒在制備治療或預防肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種放射線敏感性腫瘤靶向啟動子及用途，涉及嵌合啟動子的構建，放射線對嵌合啟動子活性的增強作用，放射線與基因治療聯合用于殺傷腫瘤細胞的協同作用。采用正常細胞和三種不同腫瘤細胞進行研究，通過嵌合啟動子調控的下游熒光素酶報告基因的表達，評價嵌合啟動子的特異性和放射線對嵌合啟動子活性的影響。并通過檢測細胞增殖率、細胞凋亡率來評價放射線與嵌合啟動子調控HRP/IAA聯合使用時的協同殺傷作用。結果證實，嵌合啟動子具有腫瘤特異性，同時放射線可以增強嵌合啟動子活性，放射線與其聯用時對多種腫瘤(宮頸癌、肝癌和肺癌)細胞有顯著的殺傷作用。即(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA聯合放療作為在制備治療或預防肺癌、肝癌、宮頸癌細胞藥物中的應用。
文檔編號A61P35/00GK101508989SQ20091006139
公開日2009年8月19日 申請日期2009年4月3日 優先權日2009年4月3日
發明者周云峰, 廖正凱, 周福祥, 謝叢華, 杰 熊, 孫文潔 申請人:武漢大學