¹³¹I標記SAP在制備診斷淀粉樣變的藥物中的應用的制作方法

專利名稱：¹³¹I標記SAP在制備診斷淀粉樣變的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及131I標記SAP在制備診斷淀粉樣變的藥物中的應用。
背景技術：
淀粉樣變疾病是細胞附屬結構的病變，細胞合成和分泌的可溶性蛋白質分子形成 不溶性纖維組織沉積，并最終導致器官功能障礙而致患者死亡。目前對于淀粉樣變的診斷 多來自于組織活檢，但是該檢查具有創傷性而且組織來源有限，難以提供病變范圍、定位、 進展或退化的信息。血清淀粉樣P成分(SAP)是一種常見血漿蛋白，是淀粉樣沉積中的非纖維性成分， 在淀粉樣變性物質形成穩定的不溶性結構中起了關鍵、特異的作用，并存在于所有不同類 型的淀粉樣變性物質中。

發明內容
本發明的目的是提供131I標記SAP作為診斷淀粉樣變的試劑，即作為一種新型的 手段診斷淀粉樣變性。本發明所提供的新應用為131I標記SAP (碘131標記的SAP)在制備診斷淀粉樣變的 試劑中的應用；特別是在制備診斷肝器官和/或腎器官的淀粉樣變的藥物中的應用。本發明還提供診斷淀粉樣變的試劑，其活性成分為131I標記SAP。本發明利用SAP的特異性作用，并在其適合分子功能基團上進行放射性核素碘 [131I]標記，研究活體狀態下淀粉樣變的無創、特異性檢查方法的可行性。SAP是一種常見血漿蛋白，是淀粉樣沉積中的非纖維性成分。其通過鈣依賴性結合 反應特異、可逆地表達在各種類型的淀粉纖維上，可以對淀粉樣沉淀在體內定量多次的評 價。該示蹤劑在無淀粉樣變的正常個體中不聚集，但是會迅速特異地定位于患病個體的淀 粉樣變部位。相比組織活檢技術更安全，提供的信息也更多。放射性核素標記的血清淀粉 樣P成分(SAP)作為一種特異性淀粉樣變的核醫學示蹤劑克服了目前臨床診斷方法的諸多 缺點。本發明采用碘131標記的SAP進行完整的動物體內試驗及臨床前試驗研究，建立了 淀粉樣變的小鼠模型，經病理證實后進行mI-SAP顯像，結果顯示實驗小鼠腹部有明顯濃 聚，與對照組形成顯著區別。并進一步通過生物分布實驗證明了 131I-SAP作為診斷淀粉樣 變的藥物準確性高。從而建立有效的核醫學診斷方法，填補國內淀粉樣變診斷的核醫學技 術的空白，滿足臨床早期發現并及早干預淀粉樣變性發展改善預后并便于隨訪的需要。下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
具體實施例方式
下述實施例所述的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1、放射性碘標記SAP診斷淀粉樣變的實驗研究摘要一、實驗材料
1、實驗動物
6-8周雌性KM小鼠(20-25g)68只，由北京大學醫學部動物室提供。
2、主要試劑
SAP (免疫化學純度> 99% )Merck 公司，500 μ g
Sephadex G25(Fine)GE公司
Iodogen (1，3，4，6-四氯 3 α，6 α - 二苯-甘脲)Sigma 公司，250mg
酪蛋白(Casein)Merck 公司，IOOg
PB (0. 5M) 100ml 的配制=Na2HPO4 (14. 5047g)、容于81ml蒸餾水；
NaH2PO4 (1. 482g)溶于19ml蒸餾水中，然后二者混合即得。
以上PB稀釋10倍即成0. 05M PBS0
3、主要設備
井型測量儀，放射性測量儀，SPECT顯像儀。
二、淀粉樣變動物模型的建立
8只6-8周雌性KM小鼠(20-25g)，北京大學醫學部動物室，均經顆粒飼料喂
養，符合實驗動物質量標準，SPF級飼養環境。先隨機取5只依據文獻[Mcadam KPffJ, SipeJD. Murine mode for human secondary amyloidosis :cenetic variability of the accute-phase serum protein SAA response to endotoxins and casein. The journal of experimental medicine,1976, (144) 1121-1128 ；Wall JS, Kennel SJ, Paulus MJ. et al. Quantitative high-resolution microradiographic imaging of amyloid deposits in a novel murine model of AA amyloidosis. Amyloid,2005,12, (3) 149-156]用 0. 5M NaHCO3溶液為溶劑配置10%酪蛋白(Casein)溶液(0. 4205g NaHCO3溶于100ml蒸餾水中， 待全部溶解后、在攪拌下逐漸加入Casein IOg得到溶液)，取4°C冰箱冷藏備用的酪蛋白 (Casein)溶液，每次0. 5ml背部皮下多點注射連續21天，另3只同步背部注射0. 5ml生理 鹽水對照。5只中隨機取兩只解剖分別取肝、脾、雙腎、主動脈、腦等10%福爾馬林固定后送 病理行HE及剛果紅染色，確定淀粉樣變模型建立；另兩組6只小鼠待顯像。上述取實驗組小鼠肝、脾、腎、主動脈、腦組織，冰凍、切片、HE染色及剛果紅染色， 可見小鼠腎臟基底層間質血管壁內多處染色呈明顯磚紅色，脾臟內小血管亦可見少許磚紅 色，證實模型建立成功。三、131I-SAP的制備將500 μ g人SAP用蒸餾水500 μ 1溶解后分裝成十份，即每份含50 μ g人SAP，置 于2-4°C冰箱備用；取Img Iodogen溶于7. 5ml三氯甲烷中，分裝于分別含20μ g、40y g、 60μ g、80y g Iodogen的無菌EP管，氬氣吹干后成功鋪管，密封、-20°C保存；s印hadexG25 浸泡、裝柱并用10% BSA溶液(lg BSA溶于IOml蒸餾水中)飽和后備用；先后取用不同含量 Iodogen管并加入上述配置的SAP 50 μ g及Na131I溶液(Na131I溶液分別試用30 μ 1、40 μ 1、 50μ 1、60μ 1、70μ 1、80μ 1(放射性濃度為 IMBq/μ 1))，用 0. 05Μ PBS 加至 200 μ 1，充分搖 勻2分鐘后，加入層析柱中心，待液平面逐漸浸沒后沿管壁緩慢加滿PBS，接管、測量，分別 計算標記率，摸索最佳反應比例。標記率=(蛋白峰各管放射性記數總和)/(蛋白峰+游離峰放射性記數總 和)X 100%。
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比活度=(放射性核素投入量X標記率)/投入的SAP質量。結果表明，7(^1(1111(^)恥1311、5(^85六？與8(^10. 05M PBS，Iodogen 用量 80 μ g 的反應條件下，室溫反應2分鐘為最佳反應條件條件，制備的131I標記SAP (131I-SAP)的標記 率為70. 6%，經分離純化后的放化純度> 90%。按照上述最佳反應條件進行mI標記SAP的制備，并對其進行體外及血清穩定性 測定131I標記SAP放化純度及體外穩定性至96h。4°C冰箱放置及體外37°C人新鮮血清中 0h、24h、48h、72h、96h的放射化學純度分別為均超過90%。結果表明131I-SAP有良好的體外穩定性。四、顯像各取200 μ 1 131I-SAP (7. 4MBq)分別注入步驟二獲得的兩組KM小鼠尾靜脈后分別 于 lh、3h、6h、24h、48h 及 72h 顯像。顯像結果提示，lh、3h、6h兩組小鼠全身均可顯影，但對照組攝取較淡、模糊，范圍 廣，提示為血池相，實驗組小鼠腹部較濃，24h后實驗組小鼠腹部攝取顯著增濃而對照組無 明顯攝取。五、131I-SAP作為診斷淀粉樣變的藥物的準確率驗證1、建立動物模型按照步驟二的預實驗方法建立30只6-8周雌性KM小鼠(20_25g)動物模型，并設 置相同數量、種系、性別、周齡昆明小鼠，同步背部注射0. 5ml生理鹽水連續21天作為對照。2、放射性攝取分布及準確率生物分布所有60只小鼠分為lh、3h、6h、24h、48h及72h的實驗和對照組，分別 經尾靜脈注入200 μ 1上述稀釋131I-SAP,剩余131I-SAP取10 μ 1用PBS稀釋至Iml混勻后抽 取100 μ 1留作標準源。分別于lh、3h、6h、24h、48h及72h斷頸處死各組小鼠，抽取100 μ 1
新鮮不凝血液連同吸頭放入試管、密封，解剖分別取其心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、膀胱、長骨、 肌肉、主動脈、腦用統一大小、重量稱量紙包裹并裝入玻璃管，放置于放射專用冰箱2周后 用井型測量儀測量放射性記數。體內分布實驗組和對照組小鼠在靜脈注射131I-SAP后lh、3h、6h時的生物分布無 明顯差異，靜脈注射后24h、48h及72h實驗組肝、脾、腎中的放射性攝取高于對照組。用SPSS 13. 0軟件進行單因素獨立樣本t檢驗得出24h每克肝、脾、腎組織放射 性計數實驗組與對照組的P值分別為0.001 (t = 10. 747),0. 001 (t = 11. 626),0. 001 (t =15. 135)，48h每克肝、脾、腎組織放射性計數實驗組與對照組的P值分別為0. 002 (t = 15. 128)、0· 002 (t = 4. 558)、0· 003 (t = 16. 96)，72h每克肝、脾、腎組織放射性計數實驗組 與對照組的 P 值分別為 0. 004 (t = 7. 801)、0· 057 (t = 3. 022)、0· 008 (t = 6. 442)。可見， 肝、腎攝取的差異有顯著性統計學意義。北京大學第一醫院腎內科在腎臟疾病的診治方面處于國內領先水平，在收治的腎 臟病人中，淀粉樣變病例并不少見，非常需要無創性的核醫學顯像方法進行明確診斷及療 效的監測，這是本研究的原動力。在放射性核素選擇方面，99mTc是核醫學顯像常用的優良放射性核素，但99mTc標記 的SAP在體內與靶組織親和力下降，易脫標，99mTc-SAP降解產物不能完全從體內清除，增加 了本底。而碘標記SAP，其體內穩定性及顯像效果大大優于99mTc標記SAP。
綜上所述，本研究采用碘131標記的SAP進行完整的動物體內試驗及臨床前試驗 研究，建立有效的核醫學診斷方法，從而填補國內淀粉樣變診斷的核醫學技術的空白，同國 外應用123I (加速器生產的放射性核素，目前國內空白)標記SAP相比具有價格低廉、簡便 易得的優點，符合我國國情、利于普及，能滿足臨床早期發現并及早干預淀粉樣變性發展改 善預后并便于隨訪的需要。
權利要求
131I標記SAP在制備診斷淀粉樣變的試劑中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述淀粉樣變為肝器官和/或腎器官的 淀粉樣變。
3.一種診斷淀粉樣變的試劑，其活性成分為131I標記SAP。
全文摘要
本發明公開了一種131I標記SAP的新應用。該新應用為131I標記SAP在制備診斷淀粉樣變的試劑中的應用。本發明采用碘131標記的SAP進行完整的動物體內試驗及臨床前試驗研究，建立了淀粉樣變的小鼠模型，經病理證實后進行131I標記SAP顯像，結果顯示小鼠腹部有濃聚。并進一步通過實驗證明了131I標記SAP作為診斷淀粉樣變的藥物準確性高。該新應用，填補國內淀粉樣變診斷的核醫學技術的空白，滿足臨床早期發現并及早干預淀粉樣變性發展改善預后并便于隨訪的需要。
文檔編號A61K51/00GK101985045SQ20101051734
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月18日 優先權日2010年10月18日
發明者張春麗, 王榮福, 閆平, 魏海亮 申請人:北京大學第一醫院