專利名稱：基因修飾CDR3δ移植型γδT淋巴細胞及其抑癌用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因修飾細胞及腫瘤治療領域。具體而言，本發明涉及對T淋巴細胞進行基因修飾以及通過所修飾的δ 2Τ淋巴細胞治療腫瘤的領域。
背景技術：
腫瘤的免疫治療被人們寄予厚望，尤其是腫瘤特異性T淋巴細胞過繼性免疫療法被認為是有發展潛力的治療策略。然而，目前實驗性或臨床性試驗并沒有出現令人滿意的療效。這可能與大多數腫瘤抗原性極其微弱甚至缺失、抗原提呈功能缺陷、表面MHC分子或協同刺激分子表達水平低下、荷瘤機體免疫抑制狀態等因素密切有關。此外，腫瘤病人體內腫瘤特異性的細胞毒T淋巴細胞(CTL)數量少，在體外很難分離和擴增；體外長時間的培養難以維持其腫瘤識別的特異性及其抗腫瘤的能力；T細胞系或者T細胞克隆的產生費時，費力。這些因素都限制了 T淋巴細胞過繼性免疫治療的廣泛應用。最近，有科學家應用基因工程技術能夠使α β T淋巴細胞表達腫瘤特異性的T細胞受體，從而提高T淋巴細胞對腫瘤抗原的特異識別能力。眾多實驗室都獲得了病毒特異性或腫瘤特異性的基因工程淋巴細胞，并且在體外和動物實驗中證明了其抗腫瘤的能力。然而，α β T細胞識別腫瘤抗原的MHC限制性使得基因修飾的α β T淋巴細胞的臨床使用受到限制。腫瘤細胞表面MHC分子表達低下或者丟失，難以被基因修飾的α βΤ淋巴細胞識別，導致腫瘤免疫逃逸。而且，基因修飾的α β T淋巴細胞既要識別抗原，又同時識別遞呈抗原的MHC分子，因此，臨床應用時需要分離各種各樣的不同MHC限制性抗原特異的T細胞克隆，并根據病人遞呈的肽段的MHC分子類型來確定能夠對腫瘤反應的TCR。目前發現的腫瘤抗原特異性的TCR數目很少，而且只是針對少數如黑素數瘤等癌癥的腫瘤相關性抗原。再者，用于轉染的α β T細胞受體主要識別蛋白抗原，很少識別另外兩種類型的腫瘤抗原碳水化合物和糖脂抗原。最后，內源性和外源性的α鏈和β鏈可能形成混合TCR， 產生意外的抗原識別特異性，從而引發自身免疫性疾病。作為T細胞群體的另一類，Y δΤ細胞在抗腫瘤免疫治療中具有獨特的作用 ①Y S τ細胞主要以MHC非限制性方式識別抗原，它克服了 α β T細胞抗腫瘤免疫的MHC 限制性的局限；②抗原識別譜廣泛，如肽類、非肽類、醇類等，并且可識別α β T細胞不能識別的抗原，因此，在功能上可作為α β T細胞免疫監視的重要補充；③腫瘤浸潤的γ δ T淋巴細胞表達Fc受體，在TCR-CD3復合體的表達或/和組裝上有缺陷時，仍可傳遞信號，這是 α βΤ細胞所不具備的；④通過細胞毒作用和產生細胞因子來發揮效應功能；⑤對血液系統腫瘤和實體瘤均有殺傷作用。但是，用于治療的Y δ T細胞制劑制備在方法上仍存在一些問題亟待解決。如中晚期腫瘤患者或化療后患者體內免疫抑制，導致種子細胞數量減少和免疫活性下降，致使體外擴增細胞數量受限，難以達到治療所需量的細胞制劑。因此，利用基因工程技術，制備足夠數量的具有細胞腫瘤反應特異性的、無/低毒性的Y S T免疫效應細胞的研究勢在必行。
本實驗室長期從事γ δ T細胞的研究，對γ δ TCR識別抗原的機制進行了深入的探討。Y δ TCR的抗原識別位點主要存在于V δ鏈的互補決定區(⑶R)，其中⑶Rl和⑶R2 區是由胚系基因V編碼，而⑶R3區則是通過V(D)和J基因的體細胞重組形成的。以往的研究結果表明，Y S TCR與BCR和抗體在結構上高度類似。CDR3長度分布圖表明，抗體重鏈 (H)和TCR δ鏈⑶R3的長度變化最大，且較輕鏈(L)和γ鏈者明顯的長。這些結構基礎提示與抗體識別抗原過程中抗體重鏈⑶R3序列起著關鍵識別作用一樣，⑶R3S在Υ δΤ細胞識別抗原中也起著關鍵作用。實驗室前期對卵巢癌和正常卵巢組織中的TCR δ 2-⑶R3基因掃描及長度多態性分析的結果顯示，正常卵巢組織中的TCRS 2-⑶R3基因片段呈多克隆表達；相比之下，卵巢癌組織中的TCR δ 2-⑶R3基因片段則呈寡克隆表達。二者片段長度分布不均，后者長度分布更為廣泛，并且具有更為明顯的優勢片段長度，這種長度分布差異顯示Y ST細胞在卵巢癌的免疫反應中有重要作用。
發明內容
發明人根據實驗室前期從10例卵巢癌的TIL中分析得出的TCR δ 2_⑶R3序列，選取與腫瘤細胞有結合的0Τ3序列(FPSHIFHSTVVHT)。分別包裝含有0T3序列的全長、δ TCR δ 2鏈與γ δ TCR γ 9鏈的逆轉錄病毒顆粒，獲得的高滴度病毒后，感染經抗⑶3抗體刺激的正常人PBMC，使其細胞膜表面表達TCR δ 2，命名為γ 9 δ 2 (0Τ3) T細胞。實驗結果顯示γ9δ2(0Τ3)Τ細胞被多種腫瘤細胞蛋白刺激后，其TNF-α和IFN-γ分泌增加。同時，對多種腫瘤細胞也具有細胞毒作用。而且，這種細胞毒作用能被抗TCRy δ的單克隆抗體所阻斷。這些結果提示，Υ9 δ 2(0T3)T細胞能夠被腫瘤抗原活化，且具有抗腫瘤作用。 為了研究轉染細胞細胞毒的作用機制，發明人使用hs/i^sL途徑的抑制劑BFA和穿孔素 /顆粒酶途徑的抑制劑CMA進行γ9δ2(0Τ3)Τ細胞的細胞毒阻斷實驗。結果發現，BFA對 Υ9 δ 2(0Τ3)Τ細胞腫瘤殺傷作用的最大抑制率僅有20 30% ；CMA對δ 2(0Τ3)Τ殺傷 Fas低表達的SK0V3細胞的殺傷活性抑制率可達56. 71%，對Fas高表達的H08910細胞的殺傷活性抑制率達33. 93%。聯合應用CMA和BFA對γ 9 δ 2 (0Τ3) T細胞的細胞毒作用抑制率達60%以上。以上結果提示，γ9δ2(0Τ3)Τ細胞對腫瘤的細胞毒作用中，穿孔素/顆粒酶和hs/i^sL途徑都發揮作用，但穿孔素/顆粒酶途徑起主要作用，尤其在對Fas低表達的腫瘤細胞的細胞毒作用中更為重要。發明人進一步對Υ9δ2(0Τ3)Τ細胞體內抑癌作用進行了研究。通過荷人卵巢癌移植瘤裸鼠模型，腫瘤局部注射Υ9δ2(0Τ3)Τ細胞，觀察其對腫瘤的治療效果。結果顯示，Υ9δ2(0Τ3)Τ細胞配合IL-2治療，相對于空載體感染的細胞配合IL-2治療組，腫瘤的生長明顯受到抑制，裸鼠的生存期也有所延長。因此本發明一方面提供一種基因修飾⑶R3 δ移植型Υ9 δ 2Τ淋巴細胞，所述細胞的Y δ TCR γ 9鏈與γ δ TCRδ2鏈的CDR3區被0T3序列所置換，其中0T3序列是SEQ ID No :1。在本發明的實施方案中，本發明的基因修飾⑶R3 δ移植型γ9δ2Τ淋巴細胞經下述步驟獲得1)分別包裝含有0Τ3序列全長的γ δ TCR δ 2鏈與γ δ TCR γ 9鏈的逆轉錄病毒顆粒；幻使用獲得的逆轉錄病毒顆粒感染經抗CD3抗體刺激的正常人PBMC，使其細胞膜表面表達TCR γ δ。
實驗證明，本發明提供的基因修飾⑶R3 δ移植型Υ9 δ 2Τ淋巴細胞經腫瘤細胞蛋白刺激后，TNF-α和IFN-Y分泌增加。這表明本發明的、δ T淋巴細胞具有廣泛的抗腫瘤作用。本發明提供的基因修飾⑶R3 δ移植型Υ 9 δ 2Τ淋巴細胞對腫瘤細胞具有細胞毒作用。實驗證明，在細胞毒作用中，穿孔素/顆粒酶和hs/i^sL途徑都發揮作用，但穿孔素 /顆粒酶途徑起主要作用，尤其在對Fas低表達的腫瘤細胞的細胞毒作用中更為重要。本發明還提供本發明的基因修飾⑶R3 δ移植型γ9δ2Τ淋巴細胞用于制備抗腫瘤細胞制劑。本發明提供的抗腫瘤細細胞制劑可用于治療多種腫瘤，可治療的腫瘤包括Fas低表達的腫瘤。可治療的腫瘤還包括卵巢癌、宮頸癌和B淋巴瘤等。本發明另一方面還提供將本發明的抗腫瘤細胞制劑與IL-2聯合使用，以獲得更好的治療效果。
圖1 轉染的PBLs細胞表達Y δ TCR(A)PCR擴增移植特異性CDR3序列的全長δ 2和γ 9鏈。1 γ 9鏈；2 δ 2。(B) 將含有pMSCVhyg- γ 9質粒和pMSCVneo- δ (0Τ3)質粒的逆轉錄病毒顆粒感染經抗CD3抗體活化的PBMC細胞，同時將空載體病毒顆粒感染的PBMC細胞作為對照。RT-PCR擴增TCR γ 9 和TCR δ 2鏈全長及各自的⑶R3區。左面1 提取自空載體病毒顆粒感染的PBMC細胞的 RNA, 2 含有TCR的逆轉錄病毒顆粒感染的PBMC細胞的RNA ；右面使用含有TCR的逆轉錄病毒顆粒感染的PBMC細胞的RNA作為模板進行RT-PCR(1-5) 1 β -actin ；2 Y 9全長；3 δ 2全長；4 γ 9鏈的CDR3序列；5 δ 2鏈移植的來源于卵巢癌的CDR3序列；M :marker ；提取自空載體病毒顆粒感染的PBMC細胞的RNA作為模板，進行RT-PCR(6-10) 6 β -actin ；7 Y 9全長；8 δ 2全長；9 γ 9鏈的⑶R3序列；10 δ 2鏈移植的來源于卵巢癌的⑶R3序列。
(C)Westernblotting檢測、δ TCR的表達。1 為轉染空載體的細胞蛋白提取物(陰性對照)；2為TCR病毒感染的細胞蛋白提取物；3正常人、δ T細胞蛋白提取物(陽性對照)。
(D)收集整合Y9和δ 2鏈的細胞(Y 9 δ 2 (0Τ3) T細胞)，空載體對照細胞，通過流式細胞術檢測轉染細胞TCR γ δ的表達情況。左邊是空載體對照細胞；右邊是γ9δ2(0Τ3)Τ細胞。圖2 γ9δ2(0Τ3)Τ細胞的生物學功能(A) γ 9 δ 2 (0Τ3) T細胞以及空載體轉染的對照細胞與Daudi，Hela，SK0V3, H08910 以及Raji細胞蛋白提取物共同孵育72小時后，收集上清ELISA雙抗體夾心法檢測各組細胞IFN-γ分泌。(B) δ 2(0T3)T細胞以及空載體轉染的對照細胞與Daudi，Hela，SK0V3， H08910以及Raji細胞蛋白提取物共同孵育M小時后，收集上清ELISA雙抗體夾心法檢測各組細胞 TNF- α 分泌。*Ρ < 0. 05 ；< 0. 01。(C)MTT法檢測γ 9 δ 2 (0Τ3) T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。Y 9 δ 2 (0Τ3) T細胞為效應細胞，與腫瘤細胞(Hela，SK0V3, H08910)在不同的效靶比37°C孵育8小時，然后每孔加入10 μ L濃度為5mg/mL的MTT，繼續孵育4小時。加入DMSO終止反應。圖3 γ 9 δ 2 (0Τ3) T細胞對腫瘤細胞的作用被抗Y δ TCR抗體阻斷。(A) Υ9 δ 2(0Τ3)Τ細胞預先用抗、δ TCR抗體或同種型無關抗體(鼠IgGl對照抗體)封閉處理2小時，然后與不同腫瘤細胞蛋白提取物孵育72小時，收集上清ELISA雙抗體夾心法檢測各組IFN- γ的分泌。(B，C，D)作為效應細胞的Y 9 δ 2 (0Τ3) T細胞預先用抗、S TCR抗體或同種型無關抗體(鼠IgGl對照抗體)處理2小時，然后與不同的腫瘤細胞在不同的效靶比下混合培養8小時，用MTT法檢測γ 9 δ 2 (0Τ3) T細胞對靶細胞的殺傷活性。*Ρ < 0. 05 ；**Ρ < 0. 01圖4 流式細胞術檢測腫瘤細胞表面!^s的表達。圖5 γ 9 δ 2 (0Τ3) T細胞的殺傷機制。(A)BFA對γ9δ2(0Τ3)Τ細胞的細胞毒作用的影響。分別以不同濃度的BFA處理Υ9 δ 2(0T3)T細胞池后，再與靶細胞混合做殺傷試驗，同時設溶劑對照。(B)CMA對 γ9δ2(0Τ3)Τ細胞的細胞毒作用的影響。分別以不同濃度的CMA處理γ9δ2(0Τ3)Τ細胞
后，再與靶細胞混合作殺傷試驗，同時設溶劑對照。(C) CMA (IOOnM)，BFA (25 μ Μ)以及聯合處理效應細胞后，檢測Y 9 δ 2 (0Τ3) T對腫瘤細胞的細胞毒作用。圖6 γ9δ2(0Τ3)Τ細胞體內抗腫瘤作用。腫瘤細胞接種后，待皮下腫瘤結節長到IOOmm3左右(約為10天)，將裸鼠隨機分成三個實驗組，治療組瘤內注射Y 9 δ 2 (0Τ3) T細胞(1 X IO6細胞/50 μ L/只，共8只)，空載體組瘤內注射空載體感染的細胞(1 X IO6細胞/50 μ L/只，共8只)，PBS對照組瘤內注射PBS (50 μ L/只，共8只)。除了 PBS組，其他兩組的動物給予腹腔注射IL-25000U/只， 每隔三天治療一次，共進行四次。每天觀察并記錄裸鼠的一般情況及生存情況；每隔2天測量腫瘤生長情況和裸鼠體重。(A)治療M天后，荷人卵巢癌裸鼠外形以及其移植瘤的大小的照片。A, B :γ9δ2 (0Τ3)Τ ；C, D 空載體對照組；Ε, F =PBS對照組。(B)荷人卵巢癌裸鼠的腫瘤生長。(C)荷人卵巢癌裸鼠的生長曲線。(D)荷人卵巢癌裸鼠的體重變化。
具體實施例方式一、材料和方法1、細胞培養PBMC,為新鮮分離的正常人外周血單個核細胞；Retrol^ack PT67是NIH3T3來源的包裝復制逆轉錄病毒細胞系，購自Clontech Laboratories，hc。NIH3T3為小鼠成纖維細胞系。SKOV3，人類卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞系；H08910，人卵巢漿液性囊腺癌細胞系； Hela，人宮頸癌腫瘤細胞系；Daudi，人B淋巴瘤細胞系；Raji，人Burkitt淋巴瘤細胞系，均可從中國醫學科學院基礎學院細胞中心購得。SK0V3細胞，以含10% FCS的McCoy 5A培養基進行貼壁培養。Hela，NIH3T3和RetroPack PT67細胞，以含10% FCS的DMEM高糖培養基進行貼壁培養。H08910，RajiJP Daudi，以含10% FCS的RPMI-1640培養基進行貼壁或懸浮培養。2、動物BALB/c裸小鼠，鼠齡4 6周，體重15 20g，雌性，購于生物制品檢定所動物中心，于中國醫學科學院基礎醫學研究所實驗動物中心無特定病原體(specific pathogen free, SPF)條件下的層流架中飼養。3、菌株和質粒載體大腸桿菌DH5a，購自寶生物工程有限公司。基因型為supE44 Δ lacU169 ( Cp801acZAM15)hsdR17 recAl endl gyr96 thi-1 relAl，用于質粒的擴增與轉化。pGEM-T或pGEM-T Easy Vector System用于Taq酶擴增的PCR產物的克隆，購自 Promega 公司。表達 γ δ TCR用 pMSCVhyg 和 pMSCVneo 質粒，購自 Clontech Laboratories, Inc0 pcDNA3. 1- γ 9禾口 pcDNA3. 1- δ (0Τ3)分別為Y 9全長基因的重組質粒和CDR3區為0Τ3 序列替代的δ，由郗雪燕博士構建，引自文獻X. Xi, Y. Guo, H. Chen, C. Xu, H. Zhang, H. Hu, L. Cui,D. Ba,and W. He,Antigen specificity of gammadelta T cells depends primarily on the flanking sequences of CDR3delta，J. Biol. Chem. 284(2009)27449-27455.4、引物(見表1)表1.用于擴增Y δ TCR的Y和δ基因全長的引物
權利要求
1.一種基因修飾⑶R3 δ移植型γ δ T淋巴細胞，其特征在于所述細胞的γ δ TCR是由Y 9鏈及⑶R3區被0Τ3序列置換的δ 2鏈組成，其中0Τ3序列是SEQ ID No :1。
2.根據權利要求1所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細胞，其特征在于所述細胞經下述步驟獲得1)分別包裝含有0Τ3序列全長的γ δ TCR δ 2鏈與γ δ TCR 鏈的逆轉錄病毒顆粒；幻使用獲得的逆轉錄病毒顆粒感染經抗CD3抗體刺激的正常人PBMC， 使其細胞膜表面表達TCR γ 9 δ 2。
3.根據權利要求1所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細胞，其特征在于所述細胞經腫瘤細胞蛋白刺激后，TNF-α和IFN-Y分泌增加。
4.根據權利要求1所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細胞，其特征在于所述細胞對腫瘤細胞具有細胞毒作用。
5.根據權利要求4所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細胞，其特征在于所述細胞主要通過穿孔素/顆粒酶途徑發揮其對腫瘤細胞的細胞毒作用。
6.根據權利要求4或5所述的基因修飾CDR3δ移植型γ9δ2Τ淋巴細胞，其特征在于所述腫瘤細胞也可以是Fas低表達的腫瘤細胞。
7.根據權利要求4所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細胞，其特征在于所述細胞通過i^s/i^sL途徑發揮其對腫瘤細胞的細胞毒作用。
8.根據權利要求1-4任一項所述的基因修飾CDR3δ移植型γ 9 δ 2Τ淋巴細胞在制備抗腫瘤細胞制劑中的用途。
9.根據權利要求8所述的基因修飾CDR3δ移植型δ 2Τ淋巴細胞在制備抗腫瘤細胞制劑中的用途，其中所述的腫瘤選自卵巢癌、宮頸癌、B淋巴瘤。
10.根據權利要求8-9任一項所述的基因修飾⑶R3δ移植型γ9δ2Τ淋巴細胞在制備抗腫瘤細胞制劑中的用途，其中所述的細胞制劑與IL-2聯合使用。
全文摘要
本發明涉及基因修飾CDR3δ移植型γδT淋巴細胞及其抑癌用途。發明人通過分別包裝含有OT3序列(FPSHTFHSTVVHT)全長的γδ TCRδ2鏈與γδ TCRγ9鏈的逆轉錄病毒顆粒感染經抗CD3抗體刺激的正常人PBMC，使其細胞膜表面表達TCRγδ，獲得基因修飾CDR3δ移植型γ9δ2T淋巴細胞，實驗證明該細胞對多種腫瘤細胞具有細胞毒作用。本發明因此為腫瘤的過繼性免疫治療提供了新的方法和策略。
文檔編號A61P15/00GK102453701SQ201010518490
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月26日 優先權日2010年10月26日
發明者何維, 崔蓮仙, 趙慧, 郗雪艷 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所