以蛋白質降解途徑為靶點的抗瘧藥物的制作方法

專利名稱：以蛋白質降解途徑為靶點的抗瘧藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及以蛋白質降解途徑為靶點的抗瘧藥物。具體而言，本發明涉及雷公藤紅素或其衍生物在制備治療瘧疾用的藥物中的用途。
背景技術：
對于蛋白質降解的研究人們最初集中在對動物消化蛋白質食物過程的理解。這是在細胞外發生的不需要消耗能量的過程。如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等參與這些細胞外蛋白質降解過程的蛋白水解酶一直是研究蛋白質的常用工具。對于發生在細胞內的蛋白質降解過程，在很長時間里人們關注的焦點是發生在溶酶體中的蛋白質的降解過程。 這是一種降解包括蛋白質、核酸、糖類和脂類等主要生物大分子的酸性環境下的水解酶作用的過程。對于發生在溶酶體中蛋白質降解，人們關心的是細胞內什么樣的蛋白質被運輸到溶酶體中，又是怎么被運送進去的等問題。
對于細胞內耗能性的(即依賴于ATP的)主動蛋白質降解過程，盡管在20世紀 50年代就已經被發現，但在很長時間里蛋白質降解方面的工作主要集中在溶酶體上，所以對這種發生在細胞內的能量依賴的蛋白質降解過程的機制長期都無進展。直到1977年， Goldberg及其同事在這個領域邁出了第一步。他們從不成熟的紅血球及網狀細胞中獲得了一種提取液，這種提取液在催化異常細胞降解時需要ATP的參與。正是應用這種提取物， Ciechanover,Hershko,Rose在70年代晚期和80年代早期進行了一系列研究，分析清楚了參與這種蛋白質降解過程的各種蛋白質成分，揭示出細胞內耗能性的蛋白質降解的分子機制。
細胞內蛋白質水平的動態變化是細胞保持活力和進行生命活動的基本特征和必要前提。任何時間點，細胞內特定蛋白質的水平取決于其合成與降解過程之間的動態平衡。 蛋白質的適時降解代表蛋白質功能的一種終端調控。正常的蛋白質降解是細胞基本的生命過程所必需的。真核細胞中含有6000至30000個蛋白質合成基因，編碼至少同等數量的蛋白質，主要有兩種蛋白質降解途徑一種是溶酶體途徑，主要降解經胞吞細胞中的胞外蛋白質；另一種是非溶酶體途徑，主要是通過細胞顆粒中的蛋白酶體降解泛素化的細胞內蛋白質。已有的研究發現，蛋白質降解途徑的不正常會導致如癌癥，神經退行性疾病等。
泛素存在于所有真核細胞中，是一種高度保守的76個氨基酸殘基的蛋白質，游離存在或共價綴合到各種細胞漿、核及整合到膜蛋白上。生物體內泛素化過程主要由泛素連接酶催化完成。泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、結合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應 (Wolf DH, 2004)首先在ATP供能的情況下泛素激活酶El激活泛素，然后將其轉移到泛素結合酶E2上通過硫酯鍵與E2的活性位點的半胱氨酸相連。E2可以在泛素連接酶E3的介導下將泛素轉移到靶蛋白的賴氨酸殘基上，進而完成對特異性蛋白質的泛素化標記。
蛋白酶體是一種分布在細胞核和細胞漿，具有糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣及caspase 樣酶活性的蛋白酶復合體，是細胞降解內源性蛋白質的場所，對維持細胞正常生理功能具有極其重要的作用。蛋白酶體的組分通常根據它們的斯韋德貝里沉降系數(以“S”來標記)來命名。最普遍的蛋白酶體的形式是26S蛋白酶體，其分子量約為2000kDa，包含有一個20S核心顆粒和兩個19S調節顆粒。核心顆粒為中空結構，包括一個由四個堆積在一起的環所組成的“核心”，核心中空，形成一個空腔。其中，每一個環由七個蛋白質分子組成。中間的兩個環各由七個β亞基組成，并含有六個蛋白酶的活性位點。這些位點位于環的內表面，所以蛋白質必須進入到蛋白酶體的“空腔”中才能夠被降解。外部的兩個環各含有七個 α亞基，可以發揮“門”的作用，是蛋白質進入“空腔”中的必由之路。這些α亞基是由結合在它們上的“帽”狀結構(即調節顆粒)進行控制；將核心顆粒的兩端敞開，目的蛋白質就可以進入“洞”中。核心顆粒的每一端都連接著一個19S調節顆粒，每個調節顆粒都含有多個ATP酶活性位點和泛素結合位點；調節顆粒可以識別多泛素化的蛋白質，并將它們傳送到核心顆粒中，啟動降解過程。包括泛素化和蛋白酶體降解的整個系統被稱為“泛素-蛋 (Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP) ”。
泛素-蛋白酶體途徑是細胞質和細胞核內依賴ATP不同于溶酶體途徑的蛋白質降解通路，80%以上的細胞內蛋白質，包括調節細胞周期的多種蛋白的降解均由此途徑完成。 通常蛋白酶體只識別和降解被泛素化的蛋白。泛素連接酶E3對靶蛋白的特異性識別起關鍵作用。酵母細胞中大約有30多種E3連接酶，人類細胞中大約有600多種。許多功能篩選試驗發現E3連接酶調控了眾多的生命過程。但是這些E3連接酶是通過調控哪些底物進而影響這些生命過程的卻不為人知，介導許多生命活動中的關鍵蛋白的降解也少見報道。現階段，蛋白質降解領域所面臨的最大挑戰就是理解在特殊的細胞環境中蛋白質組是如何被重構的以及如何確立E3連接酶與其底物的對應關系。
對蛋白質降解過程的研究近年來已經發展成為現代生物學的一個非常重要的研究領域。這是因為所有的蛋白都必須被適時的降解，細胞的基本的生命過程例如細胞周期的進行才得以成為可能。無數的證據表明，許多受到損傷的或者折疊錯誤的蛋白也都必須被降解掉，否則正常的細胞功能就會受到影響，從而導致如癌癥，神經退行性疾病等。很多疾病的病理過程都與蛋白質降解途徑的不正常有關，許多腫瘤細胞與病毒也是利用泛素蛋白酶體系統擾亂蛋白質的降解，從而達到腫瘤細胞的擴散或對宿主細胞的入侵。泛素-蛋白酶體通路不僅是一種去除錯誤折疊的蛋白質的重要機制之一，而且還參與調節細胞周期進程、基因轉錄調節、受體胞吞、抗原呈遞、細胞增生與分化以及信號轉導等各種細胞生理過程。泛素-蛋白酶體通路的異常與諸多疾病如惡性腫瘤、神經變性疾病、遺傳性疾病、炎癥、心肌病有關。闡明泛素-蛋白酶體通路將有助于制定治療這些疾病的新策略。
目前許多影響蛋白質降解途徑的藥物已經或正在發展之中。已有的研究結果和臨床試驗的數據都顯示這類藥物對很多目前難以治愈的疾病都具有極高的潛在藥用價值。蛋白酶體抑制劑對于人工培養的細胞具有有效的抗腫瘤活性，通過降解受調控的促生長細胞周期蛋白來誘導腫瘤細胞的凋亡。研究表明腫瘤細胞比正常細胞更依賴泛素-蛋白酶體系統，使得腫瘤細胞對蛋白酶體抑制劑更為敏感。在腫瘤的發生上，相當值得注意的即是和轉錄因子NF-kB有關的細胞轉錄過程。NF-kB的活性在免疫細胞以及腫瘤細胞常常很活躍，在正常情況下細胞內多余的NF-kB會在細胞質中和一種抑制性蛋白質IkB結合，而無法進入細胞核中表現其功能。但在癌細胞中，磷酸化的IkB會和泛蛋白結合而被蛋白酶體所辨識及分解，因此NF-kB就可以進入細胞核中，進一步啟動許多與細胞周期進展及抗凋亡因子 (anti-apoptotic factors)產生有關的基因，使腫瘤細胞得以進一步增殖、壯大。但當使用4蛋白酶體抑制劑(如bortezomib)后，IkB被蛋白酶體破壞的程度減少，因此NF_kB就會一直處于和IkB結合的狀態，無法進入細胞核中發揮其轉錄功能，因而抑制癌細胞的生長，并促進其凋亡。
小分子蛋白酶體抑制劑通常是通過其COOH端的反應基團利用蛋白酶體亞基獨特的催化機理來實現其特異性的類肽物。例如經常使用到的研究試劑 MG-132(Z-Leu-Leu-Leu-al)是一種肽醛，它可以可逆性抑制蛋白酶體的糜蛋白酶位點，在高濃度時也能抑制溶酶體的自溶酵素。抑制劑的其他種類可以對蛋白酶體抑制達到更高的特異性和藥效，例如肽硼酸鹽(P印tide boronates)，乳胞素和印oxomcin，可作為藥物研發選擇。
化合物PS341/BorteZomib是一種二肽硼酸衍生物，這是一種緩慢作用于糜蛋白酶位點的可逆抑制劑，可強烈而可逆地抑制蛋白酶體的功能，導致一些本應被清除的蛋白質在細胞內大量堆積，進而引起細胞凋亡。硼替佐米(Bortezomib)是第一種用作化學治療藥物的蛋白酶體抑制劑，由千年制藥公司(Millennium Pharmaceuticals)開發，市場名稱為Velcade，2003年被美國食品藥品監督管理局(the Food and Drug Administration, FDA)批準用于治療復發、難治性多發性骨髓瘤(multiple myeloma)病人。數據顯示PS-341 可靶向作用于細胞內蛋白酶體的亞基(β 5和β )及相應的免疫蛋白酶體組分(i3 5i和 β Ii)，抑制其活性，從而抑制蛋白酶體功能，值得一提的是，多發性骨髓瘤會導致血清中蛋白酶體水平的提高，而成功的化療可以將蛋白酶體的水平恢復到正常范圍，在臨床上硼替佐米治療多發性骨髓瘤可顯著延長患者生存期。動物研究顯示硼替佐米可能對死亡率極高的胰腺癌也有顯著的臨床效果。對于硼替佐米在治療B細胞相關癌癥的臨床前和早期臨床研究已經開始，特別是一些類型的非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma) 0 PS341/ Bortezomib在臨床試驗的巨大成功說明蛋白酶體是一個可靠并且有效的腫瘤治療新靶點。
利托那韋(ritonavir)，市場名稱為Norvir，是用于治療艾滋病的一種蛋白酶抑制劑。近期的研究發現，利托那韋不僅可以抑制蛋白酶，對蛋白酶體也有抑制作用，特別是對類胰凝乳蛋白酶型的蛋白酶體，但對類胰蛋白酶的蛋白酶體則有部分的促進作用。對于動物模型的研究表明利托那韋可能對神經膠質瘤(glioma)細胞的生長有抑制作用。
將蛋白酶體抑制劑應用于自體免疫性疾病也大有前景。目前這一方面的研究主要是利用動物模型來進行。例如，在對植有人類皮膚的小鼠的研究中發現，用蛋白酶體抑制劑處理過后，原本因患牛皮癬而受損的皮膚所有減少；在一些嚙齒動物模型中發現，蛋白酶體抑制劑對于哮喘也有一定的治療作用。
蛋白酶體抑制劑在臨床上的成功不僅給病人以希望，它更提出了一種觀念，通過調整泛素-蛋白酶體通路能達到治療的效果。藥物研究發現已經向抑制E3連接酶引起的底物泛素化及DUBs (去泛素化酶)催化的逆反應方面發展。重點是辨別并證實，在數以百計的E3s或DUBs中存在的新靶點。進一步弄清它們的反應機制和底物特異性。針對這些混合物篩選并設計小分子抑制劑。鑒于基礎和應用研究中對UPS領域的活性的開發，我們有理由期待，就像幾十年前的蛋白激酶一樣，或者更為激動人心的時刻就要到來——藥物研發定位于蛋白降解。
瘧疾是嚴重危害人類健康的疾病之一，也是全球最為嚴重的公共衛生問題之一。 瘧疾是一種由瘧原蟲造成的，通過瘧蚊傳播的全球性急性寄生蟲傳染病。臨床以周期性寒戰、發熱、頭痛、出汗和貧血、脾腫大為特征。瘧疾患者多呈現高熱發燒癥狀，由于早期跡象與流行性感冒有相似之處，許多對該疾病不熟悉的外來旅游者容易將瘧疾誤認為感冒，從而因為沒有得到及時的藥物治療而使得病情惡化。瘧原蟲生活周期具有很明顯的生理節奏，這使得病患的發燒癥狀呈現周期性反復的特征。舉例來說，因為間日瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)導致的瘧疾發熱周期為48小時。瘧疾患者常有的其他癥狀包括瘧原性貧血，酸毒癥，呼吸窘迫等等。如果瘧原蟲侵入腦部血管，則會導致最為嚴重的腦部瘧疾，這通常會造成病者昏迷。按照瘧疾病征的嚴重程度不同，瘧疾可以分為非重癥瘧疾 (uncomplicated malaria)禾口重癥癥疾(complicated /severe malaria)，會邑有效治療這兩類瘧疾的藥物不太相同。如果沒有得到及時和有效的治療，瘧疾患者的死亡率會非常高。
瘧原蟲屬(Plasmodium)是一類單細胞、寄生性的原生動物。感染人的瘧原蟲主要有惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)、間日皰原蟲(Plasmodium vivax)、卵形皰原蟲 (Plasmodium ovale)及三間瘧原蟲(Plasmodium malariae)，大部分瘧疾的死亡是由惡性 _原蟲(Plsamodium falciparum) $) 白勺。
寄生于人體的4種瘧原蟲生活史基本相同，需要人和按蚊二個宿主。在人體內先后寄生于肝細胞和紅細胞內，進行裂體增殖(schizogony)。在紅細胞內，除進行裂體增殖外，部分裂殖子形成配子體，開始有性生殖的初期發育。在蚊體內，完成配子生殖 (gametogony)，繼而進行孢子增殖(sporogony)。瘧原蟲可通過表膜的滲透或經胞口以吞飲方式攝取營養。在肝細胞內寄生的紅細胞外期瘧原蟲，以肝細胞的胞質為營養。
據世界衛生組織(WHO)統計，目前世界上仍有90多個國家為瘧疾流行區，處于瘧疾疫區的人數達到22億，超過世界人口的三分之一。世界范圍內，僅是呈現臨床癥狀的患者病例每年就在3億到5億之間，而每年因患瘧疾而死亡的人數則則在100萬到300萬之間，這其中大部分為兒童。兒童、孕婦、旅游者和各地的新移民對本地流行的瘧原蟲免疫力較差，故是易患瘧疾的高危人群。瘧疾主要的流行地區是非洲中部、南亞、東南亞及南美北部的熱帶地區，這其中又以非洲的疫情最甚。就中國而言，瘧疾主要的流行地帶為華中華南的叢林多山地區，但疫情遠較非洲為輕。
1946年DDT殺滅成蚊的試驗取得成效后，使得消滅瘧疾成為可能，1955年第8屆世界衛生大會把以前的控制瘧疾策略改為消滅瘧疾策略，隨著時間的推移，人們發現利用殺蟲劑消滅媒介按蚊面臨著越來越多的問題，諸如耐藥蚊種的出現，殺蟲劑造成的環境污染以及生態平衡等問題，終使全球滅瘧規劃受到嚴重挫折。1978年第31次世界衛生大會決定放棄全球限期滅瘧的規劃，把對瘧疾的防治對策改回到控制的策略。
目前各國對于瘧疾的控制主要采取預防和治療并舉的方式。預防包括個體預防和群體預防。預防措施有蚊媒防制和預防服藥。蚊媒防制包括殺滅蚊和使用蚊帳及驅蚊劑。 預防服藥是保護易感人群的重要措施之一。常用的預防性抗瘧藥有氯喹(chloroquine)， 對抗氯喹的惡性瘧，可用哌喹(piperaquine)或哌喹加乙胺嘧啶(pyrimethamine)或乙胺嘧啶加伯氨喹啉(primaquine)。不論個體或群體進行預防服藥，每種藥物療法不宜超過半年。瘧疾治療應包括對現癥病人的治療(殺滅紅細胞內期瘧原蟲)和瘧疾發作休止期的治療(殺滅紅細胞外期休眠子)。休止期的治療是指在瘧疾傳播休止期，對1 2年內有瘧疾史和帶蟲者的治療，以控制間日瘧的復發和減少傳染源。按抗瘧藥對瘧原蟲不同蟲期的作用，可將其分為殺滅紅細胞外期裂子體及休眠子的抗復發藥，如伯氨喹啉；殺滅紅細胞內裂體增殖期的抗臨床發作藥，如氯喹、咯萘啶(pyronaridine)、青蒿素(artmi sinin)類和殺滅子孢子抑制蚊體內孢子增殖的藥，如乙胺嘧啶。磷酸氯喹(Chi oropui ne phosphate)簡稱氯喹，該藥吸收快且安全，服后1 2小時血濃度即達高峰；半衰期120小時；療程短；毒性較小，是目前控制發作的首選藥。該類藥還有羥基哌基(Hydroxypiperaquine)及磷酸羥基喊Rf (Hydroxypiperaquine phosphate)。it酸查寧(Quinine sulfate)系金雞 內豐對皮中的一種生物堿，抗瘧作用與氯喹大致相同，除較迅速殺滅紅內期原蟲外，還有退熱作用。硝喹(Nitro quinum,CI679)對各種瘧疾及抗氯喹蟲株均有效。青蒿素，該藥作用于原蟲膜系結構，損害核膜、線粒體外膜等而起抗瘧作用，其吸收特快，很適用于兇險瘧疾的搶救。
在全球控制瘧疾的過程中，瘧原蟲——特別是惡性瘧原蟲抗藥性的產生是瘧疾流行不斷死灰復燃的一個重要原因。20世紀50年代在泰國和哥倫比亞同時發現惡性瘧原蟲對氯喹(chl0r0quine，CQ)產生抗性[21，22]后以來，對多種抗瘧藥具有抗藥性的惡性瘧原蟲迅速出現并擴散，成為全球瘧疾控制面臨的最大挑戰之一，除了海地島和西南亞的部分地區外，其抗性幾乎遍布全球。氯喹作為一種高效、廉價的抗瘧藥，因其良好的安全性和耐受性曾在臨床上發揮重要作用，但抗藥性的產生限制了其使用。青蒿素類復方藥作為各國抗擊瘧疾的保留用藥，曾被認為是“治療瘧疾的最大希望”。然而，2008年在泰國和柬埔寨邊境首次發現，惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物產生了耐藥性。
因此，發現針對新靶標和新作用機制的抗瘧藥物和發展新的治療瘧疾的策略具有重要的現實意義。瘧疾疫苗就是正在發展中有重大應用前景的抗瘧策略。在抗瘧小分子化合物篩選上，2009年，中國科學院上海藥物研究所蔣華良課題組與華東理工大學藥學院李洪林、李劍和德國呂貝克大學RolfHilgenfeld教授等合作，在解析出惡性瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶falcipain-2的晶體結構后，綜合運用計算藥物設計、藥物化學和分子生物學方法和技術，發現了 20余個活性及多樣性較好的falcipain-2非肽類小分子抑制劑。近年來， 以蛋白質降解途徑為靶點的抗腫瘤藥物的開發正逐漸興起。考慮到蛋白質降解過程在生物體生命活動過程中的重要作用，并且瘧原蟲作為紅細胞內寄生蟲，其生長繁殖所需包括氨基酸在內的營養物質更多依賴宿主血紅蛋白等蛋白質降解，因此蛋白質降解途徑對其生命活動有很大的影響，而該過程中有很大的可能發現能夠用于抗瘧藥物開發的新靶點。發明內容
本申請提供雷公藤紅素或其衍生物在制備治療瘧疾用的藥物中的用途。
在一個具體實施方式
中，所述衍生物選自下式II
權利要求
1.雷公藤紅素或其衍生物在制備治療瘧疾用的藥物中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述衍生物選自下式II其中 η = 10 20，m = 2n+l,2n-l 或 &1-3。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述衍生物選自雷公藤紅素十六醇酯、雷公藤紅素十醇酯、雷公藤紅素十八醇酯、雷公藤紅素十二醇酯和雷公藤紅素二十醇酯。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述衍生物選自雷公藤紅素甲酯、雷公藤紅素芐酯、雷公藤紅素環氧丙酯和雷公藤紅素酰胺。
5.雷公藤紅素或其衍生物在制備用于抑制蛋白酶體的藥物中的用途。
6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途為制備用于抑制瘧原蟲的蛋白酶體的藥物的用途。
7.雷公藤紅素或其衍生物在制備用于抑制瘧原蟲用的藥物中的用途。
8.如權利要求5 7中任一項所述的用途，其特征在于，所述衍生物選自下式II其中 η = 10 20，m = 2n+l,2n-l 或 &1-3。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述衍生物選自雷公藤紅素十六醇酯、雷公藤紅素十醇酯、雷公藤紅素十八醇酯、雷公藤紅素十二醇酯和雷公藤紅素二十醇酯。
10.如權利要求5 7中任一項所述的用途，其特征在于，所述衍生物選自雷公藤紅素甲酯、雷公藤紅素芐酯、雷公藤紅素環氧丙酯和雷公藤紅素酰胺。
全文摘要
本發明涉及以蛋白質降解途徑為靶點的抗瘧藥物。具體而言，本發明涉及雷公藤紅素或其衍生物在制備治療瘧疾用的藥物中的用途，以及所述雷公藤紅素或其衍生物在制備抑制蛋白酶體用的藥物中的用途。本申請也涉及含有雷公藤紅素或其衍生物的藥物組合物。
文檔編號A61K31/56GK102526067SQ20101059625
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月20日 優先權日2010年12月20日
發明者眭飛, 胡榮貴 申請人:中國科學院上海生命科學研究院