專利名稱：金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白及其編碼基因與應用技術領域
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種葉綠素降解代謝途徑相關蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及金絲慈竹的葉綠素降解代謝途徑相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
葉綠素是光合作用中捕獲光的主要成分，在植物生長發育后期、葉片衰老或果實成熟時，葉綠素被大規模降解。葉綠素降解對葉片衰老過程中蛋白質氮的循環再利用具有重要意義(H5rtensteiner S，Annu Rev Plant Biol, 57: 55-77，2006);同時葉綠素降解是衰老葉肉細胞的一種解毒方式(Matile et al. Plant Physiology and Biochemistry, 27: 595-604， 1989; Matile et al. Plant Physiology, 112: 1403-1409， 1996)。最新的葉綠素降解途徑為葉綠素首先脫去鎂離子，生成脫鎂葉綠素(pheophytin),然后脫續葉綠素在 PPH (Pheophytin Pheophorbide Hydrolase) [Silvia Schelbert, et al. The Plant Cell, 21: 767 - 785，2009]，又稱 CRNl (Co-regulated with NYEI) [Ren G, et al. Journal of Integrative Plant Biology, 52(5) :496-504, 2010]的作用下被脫去植醇形成脫鎂葉綠酸(Phaeophorbide a, Pheide)。脫鎂葉綠酸是葉綠素降解中最后的綠色色素，它的B卜啉大環在脫鎂葉綠酸加氧酶(Pheophorbide a oxygenase, PaO)和紅色葉綠素降解物還原酶(red chlorophyll catabolite reductase, RCCR)的作用下經過兩步反應被氧化開環。由于卟啉環裂解與葉片色素(綠色)喪失有關，因此這一步是葉片衰老時葉色黃化的關鍵步驟。該氧化過程的中間產物是紅色葉綠素代謝產物(RCC)，最終產物是原初突光葉綠素降解產物(primer fluorescent Chl catabolite, pFCC),它是有突光的四卩比咯線性分子。然后PFCC被運出葉綠體，其C (82)位被羥基化并運送入液泡。在液泡里因為 PH值偏酸性，修飾過的FCCs的D環和次甲基橋上發生非酶催化的異構，最后生成葉綠素最終代謝產物非突光葉綠素代謝產物(non- fluorescent Chl catabolite, NCCs)。葉綠素降解途徑中的許多酶都已經被發現。CRN1/PPH基因是最近通過突變體阻斷分析的方法，在擬南芥和水稻中被鑒定出來與葉片葉綠素降解代謝途徑相關的一個關鍵基因，該基因突變之后，突變體植株葉片葉綠素降解過程基本被阻斷[Ren G, et al. Journal of Integrative Plant Biology, 52(5):496-504, 2010; Silvia Schelbert, et al. The Plant Cell, 21: 767 - 785,2009; Morita R, et al. Plant Journal 59: 940-952,2009]。
竹類植物是禾本科(Ggramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物的總稱，是重要的森林資源，主要分布于熱帶和亞熱帶地區，在溫帶和寒溫帶也有少量分布。中國是亞洲竹子的分布中心，是竹子種類最豐富、分布最廣的國家，不論是竹林面積、竹種數量、竹筍和竹材產量均居世界首位，被譽為“竹子王國”。竹類植物因其開花周期長，難以預測且開花后植株通常死亡，所以難以運用傳統的雜交方法進行育種。轉基因技術在竹類植物育種中則越來越體現出其無可比擬的優越性。但是，目前為止竹類植物可利用的基因資源還非常的少。因此，運用最新的分子生物學手段，挖掘可運用于竹類植物遺傳改良的基因資源顯得越來越為重要。
本發明通過RACE-PCR的方法從一種重要的觀賞竹-金絲慈竹(Bambusa emeiensis ‘Viridif lavus’ )中分離到了一個可用于改良竹類植物綠色性狀的基因， BeCRNl，該基因可用于竹類植物葉綠素降解的分子機制研究，并可用于觀賞竹類植物色澤性狀改良。發明內容
本發明的目的是提供一種金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白及其編碼基因與應用。
本發明所提供的金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白，是具有SEQ ID NO. 2所不氣基酸殘基序列的蛋白質。
金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白的編碼基因，是下列核苷酸之一I)SEQ ID NO. I所示的DNA序列。
2)編碼SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
SEQ ID NO. I由1646個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第46位至1518位堿基；SEQ ID NO. 2由490個氨基酸殘基組成。
本發明還包括含有本發明基因的表達載體和細胞系。
本發明還包括上述基因在金絲慈竹滯綠研究中的應用，以及在竹類植物葉綠素降解途徑中的應用。
圖IBeCRNl基因保守區域I RT-PCR產物電泳圖。
圖2BeCRNl基因保守區域2 RT-PCR產物電泳圖。
圖3BeCRNl基因保守區域3 RT-PCR產物電泳圖。
圖4BeCRNl基因3’ RACE產物電泳圖。
圖5BeCRNl基因5’ RACE產物電泳圖。
圖6BeCRNl基因全長電泳圖。
圖7BeCRNl與其他物種來源的CRNl的進化樹分析及多重序列比較。
圖8BeCRNl互補擬南芥突變體cr/ 7表型分析圖。其中，a，黑暗處理4天后的各植株離體葉片表型；b，a中葉片及的表達量。Col-0，野生型擬南芥；0X_1，0X_3，0X-6， OX-7, OX-9 和 OX-16, BeCRNl 轉基因植株。
具體實施方式
實施例I、金絲慈竹葉綠素降解代謝調控相關蛋白編碼基因ifeOW/的獲得。
I. I RNA 提取。
取衰老的金絲慈竹葉片材料約0. lg。液氮充分研磨后，轉移到1.5ml離心管， 加Iml TRIzol ( invitrogen公司)，混勻后，室溫放置15分鐘,加0. 2ml氯仿異戍醇 (24:1),劇烈搖動15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。取上清液并加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉淀， 室溫干燥15分鐘。溶解于適量的經0. 1% DEPC處理過的ddH20水中，貯存于_80°C備用。
1.2 cDNA第一鏈合成和反轉錄PCR。
采用上海申能博彩生物技術公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指南將總RNA反轉錄成cDNA。反應體系和反應條件分別為2呢制備的總RNA，0. 5W Rnase inhibitor,加DEPC處理過的去離子水至 8. 5Ml, 2Ml 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C , 5min, 室溫放置 IOmin, 13000rpm 簡短離心 5s。再依次加入 4Ml 5 X First-Strand buffer, 0. 5M-1 RNase Inhibitor, 2M-1 IOOmM DTT, 2M-I dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混勻；37°C反轉錄I小時，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離心5秒鐘，存放于_20°C 待用1.3及基因三段保守片段的獲得。
1.3.1 ifeOW基因第一段保守片段的獲得。
以金絲慈竹cDNA第一鏈作為RT-PCR的模板，設計了兩條引物CRNlFl和CRNlRl 作為RT-PCR-I反應的引物。
CRNlFl :5’_ TGAACCAGTTTATATTGTGGGGAA- 3’ (SEQ ID NO 3)CRNlRl :5’ -CCAAATAGGTCTAACCCAAGGATC-3’ (SEQ ID NO 4)RT-PCR反應體系如下(50W體系)
權利要求
1.一種金絲慈竹葉綠素降解代謝調控相關蛋白，其特征在于為SEQ ID NO. 2所示氨基酸殘基序列的蛋白質，記為BeCRNl。
2.金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白BeCRNl編碼基因，其特征在于其DNA序列為SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，或者為編碼SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于該基因的編碼框為自5’端第46位到第 1518位堿基的DNA序列。
4.含有如權利要求2或3所述金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白BeCRNl的編碼基因的表達載體。
5.含有如權利要求2或3所述金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白BeCRNl的編碼基因的細胞系。
6.如權利要求2或3所述金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白的編碼基因在竹類植物綠色性狀改良中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體公開一種金絲慈竹葉綠素降解代謝途徑相關蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的葉綠素降解代謝相關蛋白，來源于金絲慈竹。蛋白名稱為BeCRN1,其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。金絲慈竹葉綠素降解代謝相關蛋白BeCRN1的編碼基因，其核苷酸序列為SEQIDNO:1所示，或者為編碼SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸序列。本發明的基因可用于金絲慈竹葉綠素降解分子機制研究，并用于觀賞竹類植物色澤性狀改良，包括改善觀賞竹類植物綠色性狀等。
文檔編號C07K14/415GK102532293SQ201210043769
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月26日 優先權日2012年2月26日
發明者丁雨龍, 曹慧敏, 胡佩, 魏強 申請人:南京林業大學