用于治療動脈粥樣硬化的b細胞耗竭劑的制作方法

專利名稱：用于治療動脈粥樣硬化的b細胞耗竭劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及動脈粥樣硬化的預防或治療，尤其涉及用于預防或治療動脈粥樣硬化的B細胞耗竭劑(cbpleting agent)。
背景技術：
動脈粥樣硬化是西方社會最常見的死亡原因，并預期在二十年內將成為世界上心血管疾病的主要原因。動脈粥樣硬化導致可以影響冠狀動脈(引起缺血性心臟病)、腦循環(引起腦血管疾病)、主動脈(產生有血栓形成和破裂傾向的動脈瘤)和周圍血管(通常是腿)(引起周圍性血管疾病和間歇性跛行)的動脈粥樣硬化性血管疾病(AVD)的發生。缺血性心臟病 (IHD)包括心絞痛(由心肌供血不足引起的胸痛)和心肌梗死(心肌的死亡)，而腦血管疾病包括中風和短暫性腦缺血發作。三分之一的男性和四分之一的女性會死于IHD，且在 1990年IHD死亡率是每100，000人中58人。動脈粥樣硬化斑塊從位于大動脈內皮下的脂肪痕(fatty streaks)開始。巨噬細胞的募集及其隨后LDL源的膽固醇的攝取是引起脂肪痕形成的主要細胞事件。許多證據表明脂質和LDL的載脂蛋白B (apo B)成分的氧化性或非氧化性修飾驅動最初的脂肪痕形成。通常在天然LDL的體外氧化后進行研究的氧化LDL(oxLDL)的特定性質取決于修飾的程度。這可以從其中LDL顆粒仍可以被LDL受體識別的“最小”修飾(mmLDL)至其中apoB 成分是碎裂和賴氨酸殘基由氧化脂質的反應性分解產物共價修飾的過度氧化(extensive oxidation)。這種顆粒不被LDL受體結合，而是被巨噬細胞和平滑肌細胞上表達的所謂的清道夫受體結合。許多促炎性和致動脈粥樣硬化性質歸因于mmLDL和oxLDL及其組分。例如，溶血磷脂酰膽堿或氧化磷脂提高單核細胞的粘附、單核細胞和T細胞的趨化性，并可以誘導促炎性基因表達。雖然單核細胞募集到動脈壁及其隨后分化成巨噬細胞初始可以起到去除細胞毒素的和促炎性的oxLDL顆粒或凋亡細胞的作用，但巨噬細胞的逐漸積聚及其攝入oxLDL最終導致動脈粥樣硬化損害的發生。從相對簡單的脂肪痕到更復雜的斑塊的轉變的特征在于平滑肌細胞從動脈壁的中間層遷移到內彈性膜和遷移到內膜空間或內皮下空間，或特征在于平滑肌細胞祖細胞的募集。內膜平滑肌細胞可以增殖并攝取修飾的脂蛋白，由此引起泡沫細胞形成，并合成導致纖維帽(fibrous cap)發生的細胞外基質蛋白。因此，發展的動脈粥樣硬化斑塊簡略地分成兩部分構成表層的纖維帽和構成深層的脂質核心。該細胞外基質(ECM)由極大地不同的大分子(包括膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白和蛋白聚糖)組成。大量ECM沉積在纖維帽中， 使得斑塊的強度得到保持，而在脂質核心中，除脂質沉積外，ECM降解增強，導致組織脆性增加。這種斑塊脆性引起斑塊易損性，隨之成為斑塊破裂的原因。該階段的斑塊發生受單核細胞/巨噬細胞與T細胞之間的相互作用影響，該相互作用導致大范圍的細胞和體液反應以及獲得慢性炎性狀態的許多特征。似乎在發展中損害的細胞成分之間發生明顯的串擾(cross talk)。損害的T細胞似乎被激活并同時表達Thl和Th2細胞因子。類似地，基于其表達MHCII類分子的和眾多的炎性產物例如TNF、IL-6和 MCP 1，巨噬細胞、內皮細胞和平滑肌細胞表現為被激活。因此，本領域對用于治療動脈粥樣硬化癥的新的可靠方法存在著公認的和持續的需要。用于治療動脈粥樣硬化癥的現有方法是基于Thl和Th2途徑似乎發揮關鍵作用的跡象。因此促進調節性免疫的免疫調節治療可代表治療和/或預防動脈粥樣硬化癥的有吸引力的工具。這可以由促進調節性T細胞(Treg)產生(例如Trl細胞、⑶4+⑶25+細胞或 Th3細胞)來實現。在這一點上，已經顯示自然產生的⑶4(+)⑶25(+)調節性T細胞(其主動地保持對自身抗原和非自身抗原的免疫耐受性)在幾種小鼠模型中是動脈粥樣硬化的有力抑制劑。另一方面，最近的研究表明，B細胞缺陷增加小鼠模型中的動脈粥樣硬化 (Major al.2002)。另一個最近的研究表明，對抗動脈粥樣硬化的保護作用由B細胞賦予(Caligiuri等人，2002)。因此，現有技術暗示，耗竭B細胞不是治療動脈粥樣硬化的可行方法，與以下專利申請中公開的但非證明的相反US2004/202658、US2005/186206、 US2008/26064UW02007/053661 和 US2004/167619。

發明內容
本發明涉及用于治療或預防動脈粥樣硬化的B細胞耗竭劑。本發明也涉及用于治療或預防動脈粥樣硬化的藥物組合物。發明詳述本發明人已經證明，施用B細胞耗竭劑(S卩，抗-⑶20抗體)使得小鼠模型中的動脈粥樣硬化斑塊尺寸明顯減小。B細胞依賴性反應與(自身)_免疫病癥的發病機理有關且B細胞耗竭明顯減少幾種免疫介導的疾病的負擔。然而，B細胞的活化到目前與抗動脈粥樣硬化的保護作用相關(Caligiuri 等人，2002 ；Major 等人，2002 ；Binder 等人，2004 ；Miller 等人，2008)，暗示 B細胞耗竭療法將提高心血管風險。本發明人在此出人意料地證明，利用CD20單克隆抗體耗竭成熟B細胞在動脈粥樣硬化癥的各種小鼠模型中誘導動脈粥樣硬化的明顯降低。這種治療相對于IgG型抗-oxLDL 抗體保持了天然的和潛在保護性的抗氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)IgM自身抗體的產生， 并顯著減少致病性的T細胞活化。B細胞耗竭的動脈粥樣硬化保護(atheroprotective)機制包括導致T細胞來源的Y -干擾素分泌減少和白介素-17產生增加的免疫反應轉換，白介素-17的中和消除CD20抗體-介導的動脈粥樣硬化保護作用。這些結果挑戰了當前B細胞活化在動脈粥樣化形成中起總體保護作用的模式，確定了基于B細胞調節的新的抗致動脈粥樣策略，并提出目前用B細胞耗竭劑例如(CD20抗體)治療其他免疫介導疾病的患者也可能受益于通過限制動脈粥樣硬化損害的發生或炎癥而獲得的心血管風險降低。發明人還表明B細胞耗竭有益于心肌梗死。定義術語“B細胞”具有本領域的一般含義。B細胞是在體液免疫反應(與由T細胞支配的細胞介導的免疫反應相反)中起巨大作用的淋巴細胞。“B細胞耗竭劑”是耗竭或破壞患者體內的B細胞和/或干擾一種或多種B細胞功能的分子，例如通過降低或阻止由B細胞引起的體液反應。B細胞耗竭劑優選與B細胞表面標志物結合。B細胞耗竭劑優選能夠耗竭其所治療的患者體內的B細胞(即，減少循環的B細胞水平)。這種耗竭可以通過各種機制(例如抗體-依賴性的細胞介導的細胞毒性 (ADCC)和/或補體依賴性的細胞毒性(CDC)、B細胞增殖的抑制和/或B細胞死亡的誘導 (例如經由細胞凋亡))來完成。B細胞耗竭劑包括但不限于抗體、合成或天然序列的肽和小分子拮抗劑，其優選與B細胞表面標志物結合，任選地與細胞毒性劑偶聯或融合。優選的 B細胞耗竭劑包括抗體，更優選B細胞耗竭抗體。在優選的實施方式中，B細胞耗竭劑不能耗竭漿細胞。在另一個優選的實施方式中，B細胞耗竭劑不能耗竭BlO細胞(或Breg細胞)。在另一個優選的實施方式中，B細胞耗竭劑不能耗竭Bl細胞。因此，在特別優選的實施方式中，B細胞耗竭劑不能耗竭漿細胞和BlO細胞。因此，在特別優選的實施方式中，B細胞耗竭劑不能耗竭漿細胞、BlO細胞和 Bl細胞。“補體依賴性的細胞毒性”或“⑶C”意指在補體存在下靶細胞的溶解。經典補體通道的激活從補體系統的第一組分結合至與其同種異體抗原結合的抗體開始。為評估補體活化，可進行例如在feizzano-Santoro等人(1997)中記載的CDC試驗。“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”意指其中結合到存在于特定細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞)上的Fc受體 (FcR)上的分泌抗體使得這些細胞毒性效應細胞能夠與攜帶抗原的靶細胞特異性結合并隨后殺死該靶細胞的細胞毒性形式。為評估所關注分子的ADCC活性，可以進行例如美國專利第5，500，362或5，821，337號所描述的體外ADCC試驗。這里的“B細胞表面標志物”或“B細胞靶”或“B細胞抗原”是在B細胞表面表達的抗原，其可作為與其結合的B細胞耗竭劑的靶標。示例性的B細胞表面標志物包括但不限于 CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、 CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85 和 CD86 白細胞表面標志物。特別關注的B細胞表面標志物與哺乳動物的其他非B細胞組織相比優先在B細胞上表達，且可以在前體B細胞和成熟B細胞上表達。在一個實施方式中，該標志物是類似于⑶20 或CD19的一種標志物，其在從干細胞階段直到最終分化成漿細胞前的時間點的整個譜系分化過程的B細胞上發現。“⑶20”抗原是從外周血液或淋巴器官的大于90%的B細胞表面上發現的35kDa 非糖基化的磷蛋白。CD20在早期前-B細胞發育期間表達，并保留到漿細胞分化。CD20存在于正常B細胞上以及惡性B細胞上。文獻中⑶20的其他名稱包括“B-淋巴細胞限制抗原”和“Bp;35，，。CD20 抗原例如記載在 Clark 等人 PNAS(USA)82 :1766(1985)中。根據本發明，“抗體”或“免疫球蛋白”具有相同的含義，并在本發明中同等地使用。 本文使用的術語“抗體”意指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特異性地結合抗原的抗原結合位點的分子。如此，術語抗體不僅包括整個抗體分子，而且包括抗體片段以及抗體和抗體片段的變體(包括衍生物)。在天然抗體中，兩條重鏈通過二硫鍵彼此連接，且各重鏈通過二硫鍵與輕鏈連接。有兩種類型的輕鏈，λ (1)和K (k)。有五類主要的重鏈(或同種型)(其決定抗體分子的功能活性)IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。 各鏈包含明顯不同的序列域。輕鏈包含兩個域，可變域(VL)和恒定域(CL)。重鏈包含四個域，一個可變域(VH)和三個恒定域(CHI、CH2和CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)和重鏈(VH) 的可變區決定與抗原的結合識別和特異性。輕鏈和重鏈的恒定區(CL和CH)的域賦予重要的生物學性質，例如抗體鏈結合、分泌、經胎盤活動性(trans-placental mobility)、補體結合以及結合至Fc受體(FcR)。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分并由一條輕鏈和一條重鏈的可變部分組成。抗體的特異性在于抗體結合位點(antibody combining site)和抗原決定簇之間的結構互補性。抗體結合位點由主要來自超可變或互補性決定區 (CDR)的殘基構成。偶爾，來自非超可變或框架區(FR)的殘基影響整體域結構并因此影響結合位點。互補性決定區或CDR意指共同限定原始免疫球蛋白結合位點的天然Fv區的結合親合力和特異性的氨基酸序列。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有三個CDR，分別稱為 L-CDRl、L-CDR2、L-CDR3 和 H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原結合位點包含六個 CDR，包含來自各個重鏈和輕鏈V區的CDR組。框架區(FR)意指插置在CDR之間的氨基酸序列。術語“嵌合抗體”意指包含本發明抗體的VH域和VL域以及人抗體的CH域和CL域的抗體。根據本發明，術語“人源化抗體”意指具有來自人抗體的可變區框架和恒定區但是保留本發明抗體的CDR的抗體。術語“Fab”表示具有約50，000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其中通過在用蛋白酶(木瓜蛋白酶)處理IgG獲得的片段中H鏈N-末端側的大約一半和整個L鏈通
過二硫鍵結合在一起。術語“F(ab' )2”意指在用蛋白酶(胃蛋白酶)處理IgG獲得的片段中具有約 100, 000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其比經由鉸鏈區的二硫鍵結合的Fab略大。術語“Fab' ”意指具有約50，000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其通過切割F(ab' )2的鉸鏈區的二硫鍵獲得。單鏈Fv(“SCFv”)多肽是共價連接的VH: :VL雜二聚體，其通常由包括由通過編碼肽的接頭連接的VH和VL編碼基因的基因融合表達。“dsFv”是由二硫鍵穩定的VH: VL雜二聚體。二價和多價抗體片段可以通過單價scFv的結合而自發形成或可以通過由肽接頭偶聯單價scFv而產生(例如二價sc (Fv) 2)。術語“雙特異性抗體”意指帶有兩個抗原結合位點的小抗體片段，該片段包含與相同的多肽鏈(VH-VL)中的輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH)。通過使用太短以致不能在相同鏈的兩個域之間配對的接頭，所述域被迫與另一個鏈的互補域配對并產生兩個抗原結合位點。“B細胞耗竭抗體”定義為與B細胞表面上的B細胞表面標志物結合并且當其與所述細胞表面標志物結合時介導B細胞的破壞或耗竭的那些抗體。該術語包括抗體片段。這種抗體包括但不限于，抗-⑶20、抗-⑶19、抗-⑶22、抗-⑶21、抗-⑶23、抗-⑶觀、抗-⑶37、 抗-⑶40、抗-⑶52抗體。抗-⑶20抗體的例子是RITUXAN (利妥昔單抗)。B細胞耗竭抗體也包括經由其他機制破壞B細胞的抗體。例如，它們包括通過結合至B細胞表面并投送致死劑量的輻射而促進B細胞的破壞的放射標記的抗體。它們包括131 I-Lym-I (抗-HLA-D)、 131 I-托西莫單抗(BEXXAR )、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan) (Y-90, In-IllZEVALIN )和90Y-依帕珠單抗。在本發明的情況中，本文使用的術語“治療”或“療法”意指逆轉、減輕或抑制該術語所應用的病癥或狀態的進展或者這種疾病或病癥的一種或多種癥狀。“治療有效量”意指給予受試者治療益處所需的活性劑的最小量。例如，對于患者的“治療有效量”是誘導、改善或另外地引起病理癥狀、疾病發展或與病癥相關或抵抗疾病惡化的生理狀態的改善的量。以其廣義理解，術語“預防”或“防止”是指在還沒有被診斷為患有疾病或病癥的受試者中防止該疾病或病癥的發生。術語“患者”是指患有動脈粥樣硬化或易患動脈粥樣硬化的任何受試者(優選為人)。“藥用的”或“藥學上可接受的”意指當適當地施用于哺乳動物(特別是人)時不產生有害、過敏性或其他不良反應的分子實體和組合物。藥學可接受的載體或賦形劑意指任何類型的非毒性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或制劑輔料。治療方法本發明涉及用于在需要的患者中預防或治療動脈粥樣硬化的方法，包括耗竭所述患者的B細胞群的步驟。更具體地，本發明涉及用于在需要的患者中預防或治療動脈粥樣硬化的方法，包括向所述患者施用B細胞耗竭劑的步驟。根據本發明的方法可以提供給已經診斷為患有以下冠狀動脈病癥之一的患者-無癥狀冠狀動脈冠心病，伴有無癥狀心肌缺血或沒有缺血；-不伴有心肌壞死的慢性缺血性病癥，例如穩定型或勞力型心絞痛；-不伴有心肌壞死的急性缺血性病癥，例如不穩定型心絞痛；-伴有心肌壞死的缺血性疾病，例如ST段升高型心肌梗死或非ST段升高型心肌梗死。事實上，所述病狀是動脈粥樣硬化并發癥，并因此被認為是動脈粥樣硬化的指征。本發明的另一方面涉及用于在需要的患者中預防或治療血管或冠狀動脈病癥的方法，包括耗竭所述患者的B細胞群的步驟。更具體地，本發明涉及用于預防或治療血管或冠狀動脈病癥的方法，包括向需要的患者施用B細胞耗竭劑的步驟。在具體的實施方式中，所述冠狀動脈病癥或血管病癥選自動脈粥樣硬化性血管病癥，例如動脈瘤或中風、無癥狀冠狀動脈冠心病、不伴有心肌壞死的慢性缺血性病癥，例如穩定型或勞力型心絞痛；不伴有心肌壞死的急性缺血性病癥，例如不穩定型心絞痛；和缺血性病癥例如心肌梗死。在具體的實施方式中，本發明涉及用于在需要的患者中預防或治療心肌梗死的方法，包括耗竭所述患者的B細胞群的步驟。更具體地，本發明涉及用于預防或治療心肌梗死的方法，包括向需要的患者施用B 細胞耗竭劑的步驟。在另一個具體的實施方式中，本發明涉及用于在需要的患者中預防或治療動脈瘤的方法，包括耗竭所述患者的B細胞群的步驟。更具體地，本發明涉及用于預防或治療動脈瘤的方法，包括向需要的患者施用B細胞耗竭劑的步驟。在具體實施方式
中，B細胞耗竭劑可以是B細胞耗竭抗體。針對B細胞表面標志物的抗體可以根據已知方法通過將適當的抗原或抗原決定基施用于選自例如特別是豬、母牛、馬、兔子、山羊、綿羊和小鼠的宿主動物產生。可以使用本領域已知的各種助劑以加強抗體的產生。雖然用于實施本發明的抗體可以是多克隆的， 但優選是單克隆抗體。可使用用于通過培養中的連續細胞系產生抗體分子的任何技術制備并分離單克隆抗體。用于產生和分離的技術包括但不限于雜交瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術和EBV-雜交瘤技術。或者，描述用于產生單鏈抗體的技術(例如參見美國專利第4，946，778號)可適用于產生抗B細胞表面標志物的單鏈抗體。根據本發明的有用抗體也包括抗體片段，包括但不限于F(ab' )2片段，其可通過胃蛋白酶消化完整抗體分子而產生；和Fab片段，其可通過還原F(ab' )2片段的二硫鍵而產生。或者，可以構建Fab和/或scFv表達文庫以允許快速識別具有所需的對B細胞表面標志物的特異性的片段。也可以根據已知技術制備人源化抗體和由其得到的抗體片段。“人源化抗體”是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的非人(例如，嚙齒類動物)嵌合抗體的形式。對于其大部而言，人化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)(例如小鼠、大鼠、兔子或非人類靈長類動物)的具有所需的特異性、親合力和能力的高變區殘基所替代。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基被相應的非人殘基替代。而且，人源化抗體可包含受體抗體或供體抗體中不存在的殘基。 進行這些修飾以進一步改進抗體性能。通常，人源化抗體將包括至少一個和通常兩個可變域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變環(hypervariable loop)對應于非人免疫球蛋白的那些部分，且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些部分。人源化抗體任選地還包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(Fe)，通常是人免疫球蛋白恒定區。用于制備人源化抗體的方法例如由Winter (美國專利第5，225，539號)和Boss (Celltech，美國專利第4，816，397號)描述。然后在如上所述產生針對B細胞表面標志物的抗體后，本領域技術人員可以容易地選擇耗竭B細胞的那些抗體，例如通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、B細胞增殖的抑制或B細胞死亡的誘導(例如經由細胞凋亡)而耗竭 B細胞的那些抗體。在具體的實施方式中，B細胞耗竭抗體可以是與細胞毒性劑或生長抑制劑偶聯的針對B細胞表面標志物的抗體。因此本發明預期使用包含與細胞毒性劑或生長抑制劑偶聯的抗B細胞表面標志物抗體的免疫偶聯物。本文使用的“生長抑制劑”意指在體外或體內抑制細胞(特別是B細胞)生長的化合物或組合物。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期進程的試劑，例如誘導Gl停滯和M 期停滯的試劑。經典的M期阻斷劑包括長春花類(長春新堿和長春花堿)、紫杉烷類和拓撲異構酶II抑制劑如亞德利亞霉素、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博萊霉素。抑制Gl的那些試劑也擴展到S-期停滯，例如，DNA烷化劑如它莫西芬、強的松、達卡巴嗪、氮芥、順鉬、 氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶。
本文使用的術語“細胞毒性劑”意指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Rel86、Rel88、Sml53、 Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑，例如氨甲喋呤、阿霉素(adriamicin)、長春花生物堿(長春新堿、長春花堿、依托泊苷)、亞德利亞霉素、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、 柔紅霉素或其他嵌入劑、酶及其片段如核溶解酶(nucleolytic enzyme)、抗生素和毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體，例如白樹毒素、蓖麻毒素、皂草素和各種以下公開的抗腫瘤或抗癌劑。其他的細胞毒性劑描述如下。 殺腫瘤劑(tumoricidal agent)引起腫瘤細胞的破壞。可使用多種雙官能蛋白偶聯劑使本發明抗體與細胞毒性劑或生長抑制劑偶聯， 所述雙官能蛋白偶聯劑包括但不限于O-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、 (N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯、亞氨基硫烷(iminothiolane) (IT)、酰亞胺酯(imidoester)的雙官能衍生物(例如二甲基己二酰亞胺鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HC1))、活性酯類(例如雙琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對-疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(例如雙-(對-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸鹽(例如甲苯2，6- 二異氰酸酯(tolyene 2,6-diisocyanate))和雙-活性氟化合物(例如1，5_ 二氟_2，4_ 二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人(1987)所描述的制備。碳標記的1_異硫氰酸芐基甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸結合至抗體的典型螯合劑(W0 94/11026)。或者，含有抗體和細胞毒性劑或生長抑制劑的融合蛋白可通過重組技術或肽合成制備。DNA的長度可包含或者彼此相鄰或者由編碼連接肽的區域分開的編碼偶聯物的兩個部分的各自區域，所述連接肽不破壞偶聯物的所需性質。在一個具體實施方式
中，優選的B細胞表面標志物是⑶20。因此，在本發明的優選實施方式中，B細胞耗竭劑是抗-CD20抗體。本發明預期的耗竭抗體的例子包括結合⑶20抗原的抗體“C2B8”，其是“利妥昔單抗”(“RITUXAN ”)(美國專利第5，736，137號，以引用方式明確地結合于此)； 釔-[90]-標記的2138鼠抗體，命名為“Y2B8”(美國專利第5，736，137號，以引用方式明確地結合于此)；鼠IgG2a “131”，任選地以1311標記以產生“1311-B1”抗體(BEXXARTM ) (美國專利第5，595，721號，以引用方式明確地結合于此)；鼠單克隆抗體“1F5” (Press等 ABlood 69(2) :584-591(1987))；“嵌合 2H7”抗體(美國專利第 5，677，180 號，以引用方式明確地結合于此)；以及可從hternational Leukocyte Typing Workshop獲得的單克隆抗體 L27、G28-2、93-1133、B-Cl 或 NU-B2 (Valentine 等人，In =Leukocyte Typing III (Μ cMichael, Ed. ，p. 440, Oxford University Press(1987))。此處的術語“利妥昔單抗”或“RITUXAN ”意指針對⑶20抗原且在美國專利第 5，736，137號中稱為“C2B8”的遺傳工程化的嵌合鼠/人單克隆抗體，該專利以引用方式明確地結合于此。該抗體是含有鼠輕鏈和重鏈可變區序列和人恒定區序列的IgG，κ免疫球蛋白。利妥昔單抗對于CD20抗原具有大約8. OnM的結合親合力。它是商業可得的，例如可購自 Genentech (South San Francisco，CA)。本發明的B細胞耗竭劑可以以如下定義的藥物組合物的形式施用。
優選地，所述B細胞耗竭劑以治療有效量施用。“治療有效量”意指以適用于任何醫學治療的合理的利益/風險比治療或預防動脈粥樣硬化的B細胞耗竭劑的足夠量。可以理解，本發明的化合物和組合物的總的定期(perodically)使用將由主治醫師在合理的醫學判斷范圍內決定。對于任何特定患者的具體治療有效劑量水平將取決于多種因素，包括所治療的病癥和病癥的嚴重性、所使用的具體化合物的活性、所使用的具體組合物、患者的年齡、體重、總體健康、性別和飲食；給藥時間、給藥途徑、和所使用的具體化合物的排泄速度；治療持續時間；與使用的特定多肽聯合使用或同時使用的藥物；以及醫學領域中眾所周知的類似因素。例如，本領域技術人員公知，以低于達到預期治療效果所需要的劑量水平的化合物起始劑量水平開始，并逐漸增加劑量直至達到預期效果。然而，產物的每日劑量可以在每個成人每天0. 01到IOOOmg的寬范圍內變化。優選地，組合物包含0. 01、 0. 05,0. 1,0. 5,1. 0,2. 5,5. 0,10. 0,15. 0,25. 0,50. 0、100、250 和 500mg 的活性成分以用于對需要治療的患者進行劑量的癥狀調整。藥物通常含有約0. Olmg到約500mg的活性成分， 優選Img到約IOOmg的活性成分。藥物的有效量通常以每天0. 0002mg/kg體重到約20mg/ kg體重的劑量水平提供，特別是每天約0. OOlmg/kg體重到7mg/kg。藥物組合物本發明的B細胞耗竭劑可以與藥學可接受的賦形劑和任選的緩釋基質(例如生物可降解的聚合物)組合以形成治療組合物。在本發明的藥物組合物中，單獨的或與另一種活性成分組合的活性成分可以作為與常規藥物載體的混合物以單位給藥形式施用于動物和人類。適合的單位給藥形式包括口服途徑形式(例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒和口服懸浮液或溶液)、舌下和口腔施用形式、氣霧劑、植入物、皮下施用形式、透皮施用形式、局部施用形式、腹膜內施用形式、肌內施用形式、靜脈內施用形式、皮下施用形式、經皮施用形式、鞘內施用形式和鼻內施用形式及直腸施用形式。優選地，該藥物組合物含有用于能夠注射的制劑的藥學上可接受的載體。它們可以特別地是等滲的、無菌的鹽溶液(磷酸二氫鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或是干的(特別是凍干的)組合物，其在視情況添加無菌水或生理鹽水后使得構成可注射溶液。適于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液或分散液；含有芝麻油、花生油或水性丙二醇的制劑；和用于現場制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況下，該形式必須是無菌的和必須是達到易于注射(syringability)的程度的流體。它在制備和存儲條件下必須穩定，且必須保持對抗微生物(例如細菌和真菌)的污染活動。含有作為游離堿或藥學可接受鹽的本發明化合物的溶液可以在水中適當地與表面活性劑(例如羥丙基纖維素)混合而制備。分散液也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和在油中制備。在存儲和使用的通常條件下，這些制劑包含防腐劑以阻止微生物的生長。本發明的B細胞耗竭劑可以配制成中性或鹽形式的組合物。藥學可接受的鹽包括酸加成鹽(以蛋白質的游離氨基形成)，且其與無機酸(例如鹽酸或磷酸)或如醋酸、草酸、 酒石酸、扁桃酸等的有機酸形成。與游離羧基形成的鹽也可以源自于無機堿(例如鈉、鉀、 銨、鈣或鐵氫氧化物和如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等的有機堿。
載體也可以是溶劑或分散介質，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其適合的混合物和植物油。可以維持適當的流動性，例如通過利用涂層 (例如卵磷脂)，在分散體的情形通過保持所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑。預防微生物的活動可以通過各種抗菌和抗真菌劑(例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)來實現。在許多情況下，優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物的延遲吸收可通過在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現。無菌注射液通過將在適當溶劑中的所需量的活性多肽與如所需的上面列舉的多種其他組分混合，隨后過濾除菌來制備。通常，分散體通過將各種滅菌的活性成分加入包含基本分散介質和所需的上述其他組分的無菌載體中來制備。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況中，優選的制備方法是真空干燥和凍干技術，其由預先無菌-過濾的溶液產生活性成分加上任何附加的所需成分的粉末。在配制后，溶液將以與劑型相容的方式并以使得治療有效的量施用。該制劑方便地以多種劑型施用，例如上述的注射液類型，但也可以使用藥物釋放膠囊等。對于水性溶液的腸胃外給藥，例如，，溶液應該適宜地緩沖(如有必要)，且液體稀釋液首先用足夠的鹽水或葡萄糖賦予等滲性。這些特定的水性溶液特別適于靜脈內、肌內、 皮下和腹膜內施用。關于這一點，可以使用的無菌水性介質對于本領域技術人員來說在參照本發明公開的內容的情況下是已知的。例如，一個劑量可以溶解在Iml的等滲NaCl溶液中，并添加到IOOOml的皮下輸注流體中或在建議的輸注位點注射。根據待治療受試者的狀況，將有必要進行劑量的一些變化。無論如何，負責給藥的人將決定個體受試者的適合劑量。本發明的B細胞耗竭劑可配制在治療混合物中，從而每劑量大致含有約0. 0001到 1. 0毫克，或約0. 001到0. 1毫克，或約0. 1到1. 0或甚至約10毫克。也可施用多個劑量。除配制成腸胃外施用(例如靜脈內或肌內注射)的本發明化合物之外，其他藥學可接受的形式包括例如片劑或其他用于口服施用的固體、脂質體制劑、定時釋放膠囊和目前使用的任何其他形式。參照以下附圖和實施例進一步說明本發明。


圖1 抗-鼠⑶20處理3個月后血液中的B細胞耗竭，所述處理為每3周一次腹膜內QOOyg)注射。圖2 抗-⑶20處理3個月后脾中的B細胞耗竭，所述處理為每3周一次腹膜內 (200 μ g)注射。圖2A和2B表示在2個不同實驗中的B細胞耗竭。圖3 抗-⑶20處理3個月后骨髓中的B細胞耗竭(B220高)，所述處理為每3周一次腹膜內QOO μ g)注射。圖4 :B細胞耗竭誘導脾⑶4 T細胞的⑶69表達減少，表明⑶4 T細胞失活。圖5 =B細胞耗竭誘導脾⑶4 T細胞的⑶44高表達的減少，表明⑶4 T細胞失活。圖6 :B細胞耗竭誘導脾⑶4 T細胞的體內BrdU摻入減少，表明體內⑶4T細胞增殖的減少。圖7 在純化的CDllc+樹突細胞的存在下在體外用抗-CD3抗體刺激的純化脾⑶4+T細胞的細胞因子產生。圖8 使用流式細胞計評估嗜中性粒細胞計數(Ly6G+CDllb+)和單核細胞計數 (⑶llb+/Ly6G-/Ly6C高、低或neg)(第一組實驗)。發明人發現抗-⑶20處理3個月后嗜中性粒細胞和單核細胞計數增加。圖9 使用流式細胞計評估嗜中性粒細胞計數(Ly6G+CDllb+)和單核細胞計數 (⑶llb+/Ly6G-/Ly6C高、低或neg)(第二組實驗)。發明人發現抗-⑶20處理3個月后嗜中性粒細胞和單核細胞計數增加。圖10 處理3個月后組間的體重和血漿膽固醇水平相似。圖11 在6或12周的處理后用抗-⑶20抗體(MB20-11)處理的小鼠組中主動脈竇損傷大小明顯減小。圖12 ⑶20mAb ( α -⑶20)處理耗竭B細胞并減少動脈粥樣硬化的發生。圖A到 D顯示在使用正常飲料飲食(chow diet)(⑶)或西方飲食(western diet) (WD)飼養的 Apoe+或Ldlr+小鼠4個不同實驗中經過α-⑶20治療后動脈粥樣硬化發生的減少。顯示了對于各實驗設置，油紅0染色的主動脈竇的代表性顯微照片，以及內膜病灶大小的量化。 棒指示中值。圖13 ⑶20mAb ( α -⑶20)處理減少胸主動脈中動脈粥樣硬化的發生。用西方飲食 (WD)飼養12周并用α-⑶20或對照抗體處理的Apoe+小鼠的胸主動脈中油紅0染色程度的定量分析。數據(平均值士 s. e. m.)表示每組9只(對照)到10只小鼠(α -⑶20)。圖14 心肌梗死后的B細胞耗竭。顯示量化的心臟功能。
具體實施例方式實施例1 :Β細胞耗竭和動脈粥樣硬化結果和討論動脈粥樣硬化的發生與B細胞活化的跡象相關，尤其表現為天然IgM型和適應性 IgG型抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(自身)抗體的產生增加(Caligiuri等人，2002 ；Shaw 等人，2000)。然而，與其他免疫介導的疾病(即類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡)相反，B 細胞在動脈粥樣硬化中被賦予保護作用(Caligiuri等人，2002 ；Major等人，2002 ；Binder 等人，2004 ；Miller等人，2008)。雖然IgG型抗-οχ-LDL抗體顯示與血管風險的可變相關性，IgM型抗-ox-LDL抗體的循環水平更經常地與人血管風險降低關聯(Karvonen等人，
2003；Tsimikas等人，2007)。在小鼠中，IL-5-和IL-33-介導的動脈粥樣硬化保護效應間接地與特定的Bl細胞激活和天然IgM型抗-oxLDL抗體的產生增加相關(Binder CJ等人，
2004；Miller AM等人，2005)。另一方面，脾切除術或μ MT-缺陷(B細胞缺陷)骨髓轉移到致死輻射的動脈粥樣硬化易感小鼠中導致IgG或總抗-oxLDL抗體產生的極大減少，且與損害發展的加速有關。這些研究導致目前的認識模式總體B細胞活化是動脈粥樣硬化保護性的。然而，出乎意料的是，成熟B細胞耗竭是否如先前研究所預期的那樣加速免疫活性(immimo-competent)小鼠中的動脈粥樣硬化損害的發展仍然尚待考察。考慮到在患有嚴重的類風濕性關節炎或者系統性紅斑狼瘡的患者(其特別地處于心血管疾病的高風險中)中臨床使用B細胞耗竭的CD20-靶向的免疫療法可能產生的心血管并發癥的潛在重要風險，這是非常重要的問題。為了直接評估B細胞在動脈粥樣硬化中的作用，發明人檢查了在有或者沒有B細胞耗竭的情況的小鼠中的損害發展。他們首先使用高脂肪西方飲食飼養的Apoe+小鼠 (先前證明與明顯B細胞活化和抗-OX-LDL抗體的高產生相關，并且預先用于評估B細胞在動脈粥樣硬化中的保護作用的模型)。為耗竭B細胞，用預先驗證的小鼠單克隆CD20抗體(Uchida 等人，Int Immunol，2004 ;Uchida 等人，J Exp Med, 2004)每 3 周處理小鼠 6 或 12周的時間。對照小鼠接受對照單克隆抗體(mAb)。如所預期的，用CD20 mAb處理導致血液(圖1)、脾(圖2)、腹膜和骨髓中成熟B細胞數目的持續的和重度的減少。在所有研究位點的B220 sIgM+細胞嚴重耗竭(92%到100%)。脾B220 IgM+細胞也顯示明顯減少 ( 80%)，但是如先前所觀察到的，未成熟骨髓Β220 (IgM+)細胞(圖3)對⑶20mAb_介導的耗竭較不敏感。用⑶20mAb處理6周不影響血漿膽固醇水平(對照組和⑶20mAb-處理組中分別是6. 4士0. 9對6. 3士0. 8g/L，P = O. 88)。但是意外地導致動脈粥樣硬化損害發展的明顯減少而非加速(圖12A)。發明人隨后分析了在高脂飲食情況下處理12周的 Apoe+小鼠的實驗，且仍然發現在2個不同血管位點(圖12B和圖13)動脈粥樣硬化的明顯減少，盡管血漿膽固醇水平類似(對照IgG組和抗-⑶20-處理組中分別為18. 7+1. 1對 17. 9士 1. 0g/L，P = 0. 68)。為了排除⑶20mAb處理的動脈粥樣硬化保護作用是由于使用響應于非常高的脂質超負荷而產生過度炎癥的小鼠模型的可能性，考察了以正常飲料飲食飼養的Apoe+小鼠中B細胞耗竭的效應。用⑶20抗體處理這些小鼠12周也導致損害發展的明顯減少(圖12C)，盡管血漿膽固醇水平類似(對照IgG組和⑶20mAb-處理組分別是 5. 5士0. 6對5. 7士0. 8g/L，P = O. 96)。Apoe+小鼠中升高的血漿膽固醇水平大部分是極低密度脂蛋白(VLDL)亞型，而LDL升高是人中的主要動脈粥樣硬化風險因子。因此，發明人考察了 LDL受體缺陷(LDLr+)小鼠模型中B細胞耗竭的效應。再一次，用⑶20mAb處理 LDLrv-小鼠導致顯著的B細胞耗竭且導致動脈粥樣硬化的明顯減少(圖12D)。總的說來，這些研究在三種動脈粥樣硬化的小鼠模型中提供了 B細胞的意外的致動脈粥樣硬化作用的確實證據。接著發明人研究了引起B細胞耗竭后動脈粥樣硬化保護的潛在機制。他們發現用 ⑶20耗竭抗體處理導致在6周和12周治療中IgG型抗-oxLDL抗體的重度減少，這和血液、 脾和骨髓中的B220高細胞的大量耗竭一致。可以認為，抗-oxLDL IgG減少可能限制了免疫復合物形成對動脈粥樣硬化的潛在有害影響。然而，在其他的研究中且特別是在脾切除術后，觀察到與動脈粥樣硬化加速而非減少相關的抗-oxLDL IgG水平的大量減少。因此， 在沒有直接針對IgG型抗-oxLDL抗體對動脈粥樣硬化的作用的研究的情況下，CD20mAb處理后抗-oxLDL IgG水平的變化并不能認為引起損害減少。抗銅氧化的或丙二醛修飾的LDL 的IgM型抗體的水平也在CD20-靶向治療的6或12周后降低。IgM型抗體具有動脈粥樣硬化保護性能，且CD20mAb治療后IgM型抗體的減少不能說明動脈粥樣硬化保護的原因，而是相反，可能阻礙動脈粥樣硬化的減少。然而，有意思的是可注意到與IgG型抗體相比，IgM型抗-oxLDL和T15id+IgM抗體的減少要低得多，這可能保持了動脈粥樣硬化保護途徑。IgM 型抗體支配Apoe+小鼠中對oxLDL的體液響應，且甚至在幼小時(在該研究中CD20mAb處理開始之前)增加，這可以至少部分地解釋⑶20免疫治療(不急劇影響預存在抗體效價的治療)后顯著IgM水平的保持。IgM保持也可能與使用⑶20mAb顯著耗竭腹膜Bl細胞所需的延遲有關。接著發明人考察了動脈粥樣硬化損害組成以獲得對動脈粥樣硬化保護機制的更深入的了解。有趣的是，CD20mAb處理與病灶內T淋巴細胞積聚的顯著和特異性減少有關， 表明B細胞在驅動T細胞-依賴性病灶炎癥中的作用。如所預期的，在損害形成的這一階段，斑塊內或外膜層內幾乎沒有檢測到B細胞，不論是否是處理組，表明通過⑶20mAb療法調節病灶T細胞積聚很可能是由于全身B細胞耗竭后T細胞功能的系統性調節的結果而發生。為了證實這種假設，發明人考察了 T細胞活化和增殖。有趣的是，發明人果然發現，用高脂飲食飼養6周和12周用⑶20抗體處理的小鼠與對照組相比源自脾的⑶4+T細胞上⑶69 和⑶44s表達明顯減少，表明T細胞活化減少。B細胞耗竭也導致效應⑶4+⑶25-T細胞的體內BrdU染色的明顯減少，表明增殖減少。CD20mAb-處理小鼠中T細胞活化減少也與在 ⑶Ilc+樹突細胞上⑶40表達的明顯減少一致。因此，使用⑶20抗體的B細胞耗竭的主要后果是體內T細胞活化的明顯減少，這可能潛在地說明其動脈粥樣硬化保護效應的原因。T細胞來源的細胞因子明顯改變損害發展。因此，發明人考察了 B細胞耗竭對純化 T細胞的細胞因子產生的影響。發明人發現，與對照相比，從CD20mAb處理小鼠中回收的純化T細胞的致動脈粥樣化IFN-γ明顯減少。值得注意的是，這與⑶20mAb處理動物中針對 T細胞源的IL-17A產生明顯增加的免疫反應的偏離有關。發明人的實驗室中進行的最近研究確認了在動脈粥樣硬化中對IL-17A產生的意外的調節和保護作用。IL-17A也顯示調節 Thl極化。為了考察CD20mAb-誘導的T細胞細胞因子分布的變化(Thl減少和IL17增加) 是否可以引起CD20mAb-依賴性動脈粥樣硬化保護作用，在對照或者抗-IL17A中和抗體的存在下將CD20mAb施用于Apoe+小鼠(高脂飲食飼養6周)。IL17中和導致動脈粥樣硬化的主動脈中IFN-Y產生增加，且完全消除了 CD20mAb治療的動脈粥樣硬化保護效應，盡管循環膽固醇水平類似和抗-oxLDL抗體水平沒有明顯變化。總的看來，這些結果確認了迄今為止未意料到的B細胞通過調節T細胞活化和細胞因子產生驅動動脈粥樣硬化發生的作用。當前的結果看起來與先前顯示小鼠中μ MT缺陷和脾切除術加速動脈粥樣硬化的研究相反。然而，這些研究沒有直接說明成熟B細胞耗竭對免疫活性小鼠中的動脈粥樣硬化的作用。幾種其他的伴隨免疫細胞機能障礙可能造成 μ MT缺陷動物中的損害發展增強。而且，報道的脾切除小鼠用純化B細胞重建后動脈粥樣硬化加速的限制可能被B細胞重建小鼠中血漿膽固醇水平的明顯減少混淆，且不能選擇性歸因于B細胞，因為T細胞重建也導致動脈粥樣硬化保護作用。最后，應該注意到，雖然在目前研究中B細胞耗竭明顯限制損害發展，但B細胞的特異亞型在驅動或控制動脈粥樣硬化中的作用值得進一步調查。更具體地，重要的是說明調節性的與非調節性的B細胞在這些過程中的各自的作用。總之，發明人提供了成熟B細胞耗竭減少小鼠中動脈粥樣硬化發展的強有力證據。這些結果對B細胞總體功能是動脈粥樣硬化保護性的模式形成挑戰，并且顯示B細胞在動脈粥樣硬化中的主要作用是驅動朝向提高致動脈粥樣硬化性Thl免疫反應和限制動脈粥樣硬化保護性IL-17產生的T細胞活化。雖然受限的血管B細胞浸潤可以在動脈粥樣硬化早期檢測到，但B細胞積聚在小鼠和人中先進的動脈粥樣硬化冠狀動脈病灶和動脈粥樣硬化性腹主動脈瘤內及其周圍隨時間顯著增加，且甚至在與其他免疫介導的疾病有關的血管炎癥中更突出。通過耗竭或者免疫調節抑制過度B細胞活化可顯著地限制血管炎癥和動脈粥樣硬化損害發展。方法動物。所有小鼠為基于C57B1/6背景。Apoe+小鼠是10周大的雄性，以正常飲料飲食飼養12周或以西方飲食(20%脂肪、0. 15%膽固醇、0%膽酸鹽)飼養6或12周。 Ldlr-7-小鼠是10周大的雄性，以西方飲食飼養6周。在10周大時，用預先驗證的小鼠單克隆 CD20 抗體(Uchida 等人，Int Immunol，2004 ;Uchida 等人，J Exp Med, 2004)或對照 IgG 腹膜內(i. P.)處理小鼠6或12周(每三周200 μ g)。在一些實驗中，小鼠接受純化的中和抗-IL-17A特異性抗體QOO μ g/小鼠，每周兩次)(Uyttenhove等人，2006和2007 ；Wang等人，2009)或對照IgG的i. p.注射6周。根據法國獸醫指南和由歐洲共同體為實驗動物使用制定的規定(L358-86/609EEC)進行實驗，并經發明人的機構hserm(國家醫藥研究院) 批準。動脈粥樣硬化損害的程度和組成。如先前描述的進行損害大小和組成的量化 (Taleb 等人，2007)。細胞回收和純化、培養、增殖和細胞因子分析。如先前詳細描述的(Taleb等人， 2007)純化和處理⑶Ilc+和⑶4+細胞用于細胞增殖試驗和細胞因子產生。使用特異性 ELISA (BD Biosciences 和 R&D Systems)測量上清液中的 IL-17 和 IFN-γ 的產生。流式細胞法。APC-偶聯的抗-CD3 ε (145-2C11)、FITC-或PE_Cy7-偶聯的抗-CD4 (RM4-5)、APC-偶聯的抗-CD25 (PC61. 5)、PE-偶聯的抗-CD69 (HI. 2F3)、APC-偶聯的抗-IgM (11/41)、FITC-偶聯的抗-CD86 (GLl)、PE-偶聯的抗-CD80 (16-10A1)、 APC-偶聯的抗-CD40 (1C10)、PE-Cy7-偶聯的抗-CDllc (N418)、PE-Cy7-偶聯的抗-CDllb (M1/70)和 PE-偶聯的抗-CD45R(B220) (RA3-6B2)來自 eBioscience。FITC-偶聯的抗-⑶5 (53-7. 3)、生物素-偶聯的抗-⑶44繼之以APC-偶聯的抗生物素蛋白鏈菌素、 APC-Cy7-偶聯的抗-CD45R(B220) (RA3-6B2)、APC-偶聯的抗-IFN y (XMG1. 2)和 PE-偶聯的抗-IL17A(TC11-18H10)來自BD Biosciences。對于血液染色，使用BD FACS細胞溶解液(BD Biosciences)溶解紅細胞。對于胞內細胞因子染色，根據廠商的說明用白細胞活化混合物(BD Biosciences)體外刺激淋巴細胞4小時。在滲透之前用細胞內染色試劑盒 (eBioscience)進行表面染色。前向散射(FSC)和側向散射(SSC)用于選通(gate)活細胞，從而排除總脾細胞、淋巴結、骨髓和腹膜群中的紅血細胞、碎片和細胞集合體。使用BD CantoII 或 BD LSRII 流式細胞儀(Becton Dickinson)分析細胞。溴脫氧尿苷(BrdU)標記和細胞分析。如先前描述的(Fisson等人，2007)進行 BrdU標記。在處死前一周在異氟烷麻醉下將每天1. 2mg的BrdU(Sigma-Aldrich)遞送 7天的小型滲透泵(ALZET 1007D ；Charles River Laboratories)移植到小鼠皮下。用 PE-Cy7-偶聯的抗-CD4(RM4-5)和APC-偶聯的抗_CD25(PC61. 5)染色淋巴結細胞和脾細胞。按照廠商的說明用FITC BrdU Flow試劑盒(BD Pharmingen)進行BrdU檢測。使用BD CantoII 或 BD LSRII 流式細胞儀(Becton Dickinson)分析細胞。定量實時聚合酶鏈式反應。在ABI prizm 7700上進行定量實時PCR，一式三次。 GAPDH的CT用于歸一化基因表達。對于以下蛋白質進行定量實時PCR:IL10、TGF-β和 IFN- γ ο循環抗體的測定。對于血漿中給定抗原的特異性抗體效價如先前描述的(Friguet等人，1985 ；Binder等人，2003 ；Chou等人，2009)的通過化學發光ELISA測定。統計分析。數值用平均數生s. e.m來表示。使用非參數Marm-Whitney或 Kruskal-Wallis檢驗考查數值間差異，且P < 0. 05被認為是顯著的。實施例2 =B細胞耗竭與心肌梗死模型中的縮短分數增加有關。通過結扎冠狀動脈左前降支在8周大的雄性C57BL6J小鼠中引發心肌梗死。心肌缺血性損傷后一小時，通過給小鼠腹膜內注射小鼠單克隆CD20抗體(160yg)處理小鼠或者不處理。發明人證明，B細胞滲入梗死區域。在MI后的第1、3、7和14天通過流式細胞法分析血液B細胞水平。⑶20抗體處理后，IgM+B220+-B細胞的百分比明顯降低。在MI后第14天處死小鼠，并由超聲波心動描記術測量心臟功能(圖14)。這種處理與縮短分數的增加有關，表明所述處理可能對治療心肌梗死有益。實施例3 腹主動脈瘤中B細胞耗竭的影響。首先，發明人使用驗證的動脈動脈瘤形成小鼠模型。當用血管緊張素(Ang) II輸注觀天時，以正常飲料飲食或高脂飲食飼養的Apoe-/-小鼠形成腹主動脈動脈瘤 (Daugherty A等人，2000)。該模型在動脈瘤血管內或周圍再現了炎性細胞(包括B細胞) 的積聚。為了獲得更精確的結果，發明人也可以使用專利申請WO 2009056419中描述的新的具有高動脈瘤破裂發生率的主動脈動脈瘤模型。該模型使用Apoe+/+或Apoe-/-小鼠， 且結合AngII輸注和TGF-β活性的中和，與人類疾病高度相關的兩種因子。在該模型中， TGF-β活性的系統中和導致這些小鼠對AngII-誘導的主動脈動脈瘤易感性的意外的和明顯的增加(92. 5%)，并導致因主動脈夾層形成(aortic dissection)和破裂的高死亡率水平(65% )。使用抗-CD20mAb的B細胞耗竭在動脈瘤誘導時開始，以評估其對動脈瘤發生的影響。動脈瘤誘導后一小時進行第一次200 μ g i.p.的輸注，二周后進行第二次輸注。四周后處死小鼠。評估腹主動脈瘤和免疫反應，進行回波描記術分析。參考文獻本申請中，各種參考文獻描述了本發明所屬領域的現有技術狀況。因此這些參考文獻的公開以引用方式合并于本公開中。Binder, CJ.等人· Pneumococcal vaccination decreases atherosclerotic lesion formation :moIecuIar mimicry between Streptococcus pneumoniae and oxidized LDLNat Med 9,736-43 (2003).Binder, CJ.等人· links adaptive and natural immunity specific for epitopes of oxidized LDL and protects from atherosclerosis. J Clin Invest 114， 427-37(2004).Caligiuri，G.，Nicoletti，A.，Poirier, B. &Hansson，G. K. Protective immunity against atherosclerosis carried by B cells of hypercholesterolemic mice. J Clin Invest 109,745-53(2002).Chou, M. Y.等人.Oxidation-specific epitopes are dominant targets of innate natural antibodies in mice and humans. J Clin Invest 119，1335-49(2009) ·Daugherty A，Manning MW, Cassis LA. Angiotensin II promotesatherosclerotic lesions and aneurysms in apo lipoprotein E—deficient mice. J Clin Invest. 2000 ；105 :1605-1612. Fisson，S·等人.Continuous activation of autoreactive CD4+CD25+regulatory T cells in the steady state. J Exp Med 198, 737-46(2003).Friguet, B.，Chaffotte，A. F.，D javadi-Ohaniance，L. &Goldberg， Μ. E. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen—antibody complexes by enzyme — linked immunosorbent assay. J Immunol Methods 77， 305-19(1985).Karvonen，J.，Paivansalo，M.，Kesaniemi, Y. A. &Horkko, S. Immunoglobulin M type of autoantibodies to oxidized low-density lipoprotein has an inverse relation to carotid artery atherosclerosis. Circulation 108，2107-12(2003) ·Major，A. S.，Fazio, S. &Linton, M. F. B-Iymphocyte deficiency increases atherosclerosis in LDL receptor-null mice.Arterioscler Thromb Vase Biol 22， 1892-8 (2002). Miller, A. M. 入.IL—33 reduces the development of atherosclerosis. J Exp Med 205,339-46(2008).Roman，M. J.等人· Preval ence and relation to risk factors of carotid atherosclerosis and left ventricular hypertrophy in systemic lupus erythematosus and antiphospho lipid antibody syndrome. Am J Cardiol 87,663-6,Al 1 (2001).Shaw, P. X.等人.Natural antibodies with the T15 idiotype may act in atherosclerosis, apoptotic clearance，and protective immunity [see comments]. JClin Invest 105，1731-40 (2000).Taleb，S.等人.Defective Leptin/Leptin Receptor Signaling Improves Regulatory T Cell Immune Response and Protects Mice From Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol (2007). Tsimikas, S. et al. Relationship of IgG and IgM autoantibodies to oxidized low density lipoprotein with coronary artery disease and cardiovascular events. J Lipid Res 48，425-33 (2007) ·Uchida，J·等人.Mouse CD20 expression and function. Int Immunol 16， 119-29 (2004). Uchida, J.等人.The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti_CD20 antibody immunotherapy. J Exp Med 199，1659-69 (2004) ·Uyttenhove, C. &Van Snick, J. Development of an anti_IL_17A auto-vaccine that prevents experimental auto-immune encephalomyelitis.Eur J Immunol 36， 2868-74(2006). Uyttenhove, C，Sommereyns, C，Theate，L，Michiels，T. &Van Snick, J. Anti-IL-17A auto vaccination prevents clinical and histological manifestations of experimental autoimmune encephalomyelitis. Ann N Y Acad Sci 1110， 330-6(2007).Wang，Y.等人· A critical unsuspected role for TGF-beta activity in theprotection against aortic aneurysm formation and complications in adult mice. Under Revision(2009).
權利要求
1.B細胞耗竭劑，用于治療或預防動脈粥樣硬化。
2.根據權利要求1的B細胞耗竭劑，其中所述B細胞耗竭劑是B細胞耗竭抗體。
3.根據權利要求1的B細胞耗竭劑，其中所述B細胞耗竭抗體是抗-CD20抗體。
4.根據權利要求1-3任一項的B細胞耗竭劑，用于治療或預防血管或冠狀動脈病癥。
5.根據權利要求4所述的B細胞耗竭劑，其中所述冠狀動脈病癥或血管病癥選自下組 動脈粥樣硬化性血管病癥，例如動脈瘤或中風、無癥狀冠狀動脈冠心病、不伴有心肌壞死的慢性缺血性病癥，例如穩定型或勞力型心絞痛；不伴有心肌壞死的急性缺血性病癥，例如不穩定型心絞痛；和缺血性病癥例如心肌梗死。
6.根據權利要求5所述的B細胞耗竭劑，其中所述冠狀動脈病癥是動脈瘤。
7.根據權利要求5所述的B細胞耗竭劑，其中所述冠狀動脈病癥是心肌梗死。
全文摘要
本發明涉及動脈粥樣硬化的預防或治療，特別涉及用于預防或治療動脈粥樣硬化的B細胞耗竭劑。
文檔編號A61K39/395GK102271710SQ201080004239
公開日2011年12月7日 申請日期2010年1月5日 優先權日2009年1月6日
發明者托馬斯·泰德爾, 阿蘭·泰德吉, 阿菲德·艾特·烏爾費拉, 齊亞德·馬萊 申請人:國家健康與醫學研究院