包含益生菌的營養平衡的標準管飼制劑的制作方法

包含益生菌的營養平衡的標準管飼制劑的制作方法
【專利摘要】本發明涉及通過管飼施用的腸內營養領域。具體而言，本發明提供包含益生微生物的用于完全營養的管飼制劑。這類益生微生物可以是例如非復制型微生物，如生物活性的熱處理的益生微生物。
【專利說明】包含益生菌的營養平衡的標準管飼制劑
[0001 ] 本發明涉及通過管飼施用的腸內營養領域。具體而言，本發明提供包含益生微生物的用于完全營養的管飼制劑。這類益生微生物可以是例如非復制型微生物，如生物活性的熱處理的益生微生物。
[0002]人體主要從攝入的食物獲取其資源。但是，在某些條件下，患者可能不能在無幫助的情況下攝入足量食物。通常，這可以是手術后和/或重癥監護條件下的住院患者的情況。這類患者可以不能或不愿意足量接受口腔進食。
[0003]對于具有功能胃腸道但不能口服攝入足量營養物的患者，腸內管飼是確保正確營養，以允許快速恢復的有價值的選擇。
[0004]與腸胃外營養相比，通常優選腸內營養，因為降低了并發癥例如感染的風險、保持了胃腸道的結構和功能并降低了費用。
[0005]腸內營養的典型適應癥包含例如厭食癥、蛋白質營養不足、肝功能衰竭、手術的腸準備、腸外瘺閉合、大量腸切除后或可以引起吸收障礙的障礙中的小腸適應、無法口腔進食、創傷和/或引起代謝應激的危重癥。
[0006]為這類病癥開發了標準化管飼制劑，且已上市銷售。
[0007]管飼制劑旨在向否則將患有可延遲恢復的營養不良的患者提供完全營養。
[0008]尤其是在住院條件下，患者的腸道正常微生物區系可以由于例如抗生素制劑的消耗而顯著受損。但是，需要起作用的腸道正常微生物區系來確保來自所攝入的食物的營養物的正確吸收。
[0009]此外，住院患者的免疫系統常由于他們的一般健康條件和由于應激而受損，尤其是在手術之前或之后。
[0010]最后，如果管飼還提供抗炎化合物，則它將是優勢，該抗炎化合物是天然的，且可在無副作用風險的情況下安全施用。
[0011]因此，本領域中存在對管飼制劑的需要，該管飼制劑允許改善消化道的功能、強化免疫系統和/或提供抗炎作用，同時易于以工業規模產生，且理論上將不隨更長的保質期或提高的溫度喪失活性。
[0012]本發明人已滿足了此需要。
[0013]因此，本發明的目的是改進現有技術的狀態和滿足所述需要。
[0014]本發明人驚奇地看到，他們可以通過獨立權利要求的主題來達到此目的。從屬權利要求進一步發展了本發明的想法。
[0015]本發明人驚奇地看到，提供完全營養且包含益生微生物的通過管飼施用的組合物滿足了所述需要。
[0016]用于管飼的組合物通常具有超過包含益生菌的酸奶飲料的保質期的保質期，由于可以在延長的保質期內確保益生菌的存活力的不確定性，目前未在這類管飼組合物中加入益生菌。
[0017]本發明人現在能夠顯示，甚至非復制型益生菌也可以提供益生菌的健康益處，且甚至可以具有改善的益處。[0018]因此，本發明的一個實施方案是通過管飼施用的組合物，該組合物向患者提供完全營養，且包含益生微生物。
[0019]如果患者從此組合物獲得所有所需營養物而無需其他食物來源，則該組合物提供
完全營養。
[0020]優選地，組合物具有適合用于短期或長期管飼二者的平衡營養物譜。
[0021]組合物可以具有0.9-2.lkcal/ml的范圍內的熱量密度(caloric density)、360-750m0sm/kg水的范圍內的重量摩爾滲透壓濃度，且包含占組合物卡路里(calories)的約15-17%的蛋白質源、占組合物卡路里的約38-52%的糖類源和占組合物卡路里的約32-46%的脂質源。
[0022]對于正常患者，NPC: N比率可以在125: I至140: I的范圍內。
[0023]通過計算每天提供的氮的克數(lg N = 6.25g蛋白質)，并用總的非蛋白質千卡數(kcalories)除以氮的克數來計算非蛋白質千卡與氮之比率(NPC: N)。
[0024]通常，將NPC: N比率在80: I的范圍內的營養補充物用于最嚴重應激的患者，NPC: N比率在100: I的范圍內的營養補充物用于嚴重應激的患者，而NPC: N比率在150: I的范圍內的營養補充物用于未應激的患者。
[0025]因此，可以根據患者的狀態來調節NPC: N比率。
[0026]同樣，可以調節管飼制劑的能量密度。
[0027]對于谷蛋白不耐、營養不良、中風、腦血管意外、腫瘤患者、乳糖不耐和/或吞咽困難的營養管理，本發明的組合物可以具有0.9-1.lkcal/ml的范圍內的熱量密度、360-380m0sm/kg水的范圍內的重量摩爾滲透壓濃度，且包含占組合物卡路里的約15-17%的蛋白質源、占組合物卡路里的約50-52%的糖類源和占組合物卡路里的約32-34%的脂質源。
[0028]還可以制備營養平衡熱量富集(dense)的管飼組合物。由于提高的能量需要和/或嚴格受限的流體體積，這種組合物可以具有非常高的熱量密度。
[0029]這種組合物可以適合用于惡病質、充血性心力衰竭、無意體重減輕、腫瘤患者、中風、腦血管意外、谷蛋白不耐、囊性纖維化、營養不良、脂肪吸收障礙、乳糖不耐和/或腫瘤誘導的體重減輕的營養管理，且可以具有1.9-2.lkcal/ml的范圍內的熱量密度、735-755m0sm/kg水的范圍內的重量摩爾滲透壓濃度，并包含占組合物卡路里的約15-17%的蛋白質源、占組合物卡路里的約38-40%的糖類源和占組合物卡路里的約44-46%的脂質源。
[0030]可以用纖維內含物強化(enrich)本發明的組合物。纖維內含物可以在13_15g/L的范圍內，且可以包含豌豆纖維、寡聚果糖、菊粉和/或其組合。
[0031]纖維內含物將提供高級愈合支持，且將對患有腸功能不足的患者有幫助。
[0032]本發明的組合物可以包含n6: n3脂肪酸比率在4: I至5: I的范圍內的脂質源。
[0033]MCT: LCT比率可以在24: 76至76: 24的范圍內。對于正常患者，可以優選約25: 75 的 MCT: LCT 比率。[0034]對于患有脂肪吸收障礙的患者，可以優選利用約75: 25的MCT: LCT比率。
[0035]本發明的組合物可以包含約69-86%自由水。[0036]自由水是滿足最低流體需要必不可少的。對于正常患者，可以優選約83-86%的自
由水含量。
[0037]對于具有體積限制和/或具有高熱量密度需要的患者，可以優選約69-71%的自由水含量，其仍將提供充分的水合作用。
[0038]組合物可以包含部分或僅包含非復制型益生微生物。
[0039]發明人驚奇地看到，例如就免疫強化作用而言和/或就抗炎作用而言，非復制型益生微生物可以甚至比復制型益生微生物更有效。
[0040]這是令人驚奇的，因為通常將益生菌定義為“在以足夠的量施用時賦予宿主健康益處的活微生物”(FA0/WH0指南)。絕大多數公開的文獻涉及活益生菌。此外，幾項研究調查通過非復制型細菌傳遞的健康益處，它們中的大多數顯示，例如通過熱處理失活益生菌導致它們聲稱的健康益處的喪失(Rachmilewitz, D.等,2004, Gastroenterology 126:520-528 ；Castagliuolo 等，2005, FEMS Immunol.Med.Microbiol.43:197-204 ；Gill,
H.S.和 K.J.Rutherfurd,2001, Br.J.Nutr? 86:285-289 ；Kaila, M.等，1995，Arch.Dis.Child 72:51-53.)。一些研究顯示,滅活益生菌可以保留一些健康作用(Rachmilewitz,
D.等，2004，Gastroenterology 126:520-528 ；Gill, H.S.和 K.J.Rutherfurd，2001，Br.J.Nutr.86:285-289)，但顯然，到目前為止，本領域中認為活益生菌更有效。
[0041]本發明的組合物可以以任意有效量，例如以對應于約IO6至1012cfu/g干重的量包含益生微生物。
[0042]益生微生物可以是非復制型益生微生物。
[0043]“非復制型”益生微生物包含經熱處理的益生菌。這包含失活、死亡、不能生活和/或作為諸如DNA、代謝物、胞質化合物和/或細胞壁物質的片段存在的微生物。
[0044]“非復制型”意指通過經典平板接種法不能檢測到活細胞和/或菌落形成單位。這類經典平板接種法總結在微生物學書籍James Monroe Jay, Martin J.Loessner, DavidA.Golden.2005.Modern food microbiology.第 7 版，Springer Science, New York,N.Y.790p中。通常，活細胞的缺乏可以顯示如下:用不同濃度的細菌制劑(“非復制型”樣品)接種并在適當條件下孵育(有氧和/或缺氧環境下至少24小時)后瓊脂平板上無可見菌落或液體生長培養基中無增加的濁度。
[0045]為了本發明的目的，將益生菌定義為“對宿主的健康或康樂具有有益作用的微生物細胞制劑或微生物細胞的成分”。(Salminen S, Ouwehand A.Benno Y.等“Probiotics:how should they be defined” Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0046]使用非復制型益生微生物的可能性提供了幾個優勢。在嚴重無免疫應答的患者中，由于發生菌血癥的潛在風險，可以將活益生菌的使用限制在例外病例中。可以無任何問題地使用非復制型益生菌。
[0047]此外，非復制型益生微生物的提供允許熱重構，同時保持健康益處。
[0048]本發明的組合物以足以至少部分產生健康益處的量包含益生微生物和/或非復制型益生微生物。將足以達到此目的的量定義為“治療有效劑量”。對此目的有效的量將取決于本領域技術人員已知的許多因素，如患者的體重和一般健康狀態，且取決于食物基質的作用。
[0049]在預防性應用中，以足以至少部分降低發生障礙的風險的量對易感該障礙或處于該障礙的風險的消費者施用本發明的組合物。將這種量定義為“預防有效劑量”。同樣，精確的量取決于許多因素，如患者的健康狀態和體重，且取決于食物基質的作用。
[0050]本領域技術人員將能夠適當地調節治療有效劑量和/或預防有效劑量。
[0051]一般而言，本發明的組合物以治療有效劑量和/或以預防有效劑量包含益生微生物和/或非復制型益生微生物。
[0052]通常，治療有效劑量和/或預防有效劑量在每個日劑量約0，005mg-1000mg益生微生物和/或非復制型益生微生物的范圍內。
[0053]就數值量而言，“短時間高溫”處理的非復制型微生物可以以對應于IO4至IO12等同cfu/g干組合物的量存在于組合物中。顯然，非復制型微生物不形成菌落，因此，此術語應理解為從IO4至IO12CfVg復制型細菌獲得的非復制型微生物的量。這包含失活、不能存活或死亡或作為諸如DNA或細胞壁或胞質化合物的片段存在的微生物。換言之，按照該量的微生物的菌落形成能力(cfu)來表示組合物所包含的微生物的量，就如同所有微生物都是活的一樣，而不考慮它們實際上是否是非復制型，如失活或死亡、片段化或任意或所有這些狀態的混合。
[0054]優選地，非復制型微生物以等同于IO4至109cfu/g干組合物的量、甚至更優選以等同于105至IO9CfVg干組合物的量存在。
[0055]可以通過本領域已知的任意方法使益生菌成為非復制型。
[0056]使益生菌株成為非復制型的目前可獲得的技術通常是熱處理、Y -照射、紫外光或使用化學試劑(福爾馬林、多聚甲醛)。
[0057]可以優選使用在食品工業中的工業環境下相對易于應用的技術來使益生菌成為非復制型。
[0058]目前市場上的大多數包含益生菌的產品是在其產生過程中經熱處理的產品。因此便于能夠與所產生的產品一起或至少以相似的方式熱處理益生菌，同時益生菌保持或改善了它們的有益特性或甚至獲得新的對消費者有益的特性。
[0059]但是，通過熱處理失活益生微生物在文獻中一般與益生活性的至少部分喪失相關。
[0060]本發明人現已驚奇地發現，例如通過熱處理使益生微生物成為非復制型未導致益生健康益處的喪失，相反，可以增強現有健康益處和甚至產生新的健康益處。
[0061]因此，本發明的一個實施方案是組合物，其中通過熱處理使非復制型益生微生物成為非復制型。
[0062]這種熱處理可以在至少71.5°C下進行至少I秒。
[0063]可以使用長期熱處理或短期熱處理。
[0064]在目前的工業規模中，通常優選短期熱處理，如UHT樣熱處理。這類熱處理減少了細菌接種量，并減少了處理時間，從而減少了營養物的破壞。
[0065]發明人首次表明，無論它們的起始特性如何，在高溫下短時間熱處理的益生微生物都顯示抗炎免疫特性。具體而言，通過此熱處理，產生了新的抗炎特性，或增強了現有抗炎特性。
[0066]因此，即使活對應物不是抗炎菌株，現在也可能通過使用對應于典型的可在工業上應用的熱處理的具體熱處理參數來產生具有抗炎免疫特性的非復制型益生微生物。[0067]因此，例如，熱處理可以是在約71.5_150°C下高溫處理約1-120秒。高溫處理可以是高溫/短時間(HTST)處理或超高溫(UHT)處理。
[0068]可以在約71.5-150°C下對益生微生物進行約1-120秒的短期高溫處理。
[0069]更優選可以在約90-140°C，例如90_120°C下對微生物進行約1_30秒的短期高溫處理。
[0070]此高溫處理使微生物成為至少部分非復制型。
[0071]高溫處理可以在正常大氣壓下進行，但也可以在高壓下進行。典型的壓力范圍為I至50bar,優選I至IObar,甚至更優選2至5bar。顯然,應用熱時,優選在液體或固體的介質中熱處理益生菌。因此，所應用的理想壓力將取決于其中提供了微生物的組合物的性質，且取決于所用溫度。
[0072]高溫處理可以在約71.5_150°C、優選約90_120°C、甚至更優選約120_140°C的溫度范圍內進行。
[0073]高溫處理可以短期進行約1-120秒、優選約1-30秒、甚至更優選約5-15秒。
[0074]此給定的時間范圍指益生微生物經受給定的溫度的時間。注意，取決于其中提供了微生物的組合物的性質和量及取決于所使用的加熱器的結構，熱應用的時間可以不同。
[0075]通常，但是，通過高溫短時間(HTST)處理、巴氏瞬間滅菌法或超高溫(UHT)處理來處理本發明的組合物和/或微生物。
[0076]UHT處理是涉及通過在超過135°C (275 °F )(殺死牛奶中的細菌孢子所需的溫度)的溫度下短時間(約1-10秒)加熱組合物來對它進行至少部分滅菌的超高溫處理或超熱處理(都縮寫為UHT)。例如，用超過135°C的溫度以此方式處理牛奶允許細菌接種量在使得能夠進行連續流操作的必要保持時間(至2-5秒)內減少。
[0077]存在兩種主要的UHT系統類型:直接系統和間接系統。在直接系統中，通過蒸汽注射或蒸汽注入來處理產品，而在間接系統中，用板式換熱器、管式換熱器或刮面式換熱器熱處理產品。可以在產物制備方法的任意一個或多個步驟應用UHT系統的組合。
[0078]HTST處理定義如下(高溫/短時間):設計來達到牛奶中存活微生物數目的5個對數降低，殺死99，9999%的巴斯德消毒法。認為這足以破壞幾乎所有酵母、霉菌和常見的腐敗細菌，以及確保充分破壞常見的致病耐熱生物。在HTST法中，將牛奶加熱至71.70C (161 0F ) 15-20 秒。
[0079]巴氏瞬間滅菌法是易腐飲料，如果汁和蔬菜汁、啤酒及乳制品的熱巴斯德消毒法。它在灌裝入容器中之前進行，以殺死腐敗微生物、使產品更安全和延長它們的保質期。液體在受控連續流中移動，同時經受71.50C (160 0F )至74°C (165 0F )的溫度約15至30秒。
[0080]為了本發明的目的，術語“短時間高溫處理”將包括例如高溫短時間(HTST)處理、UHT處理和巴氏瞬間滅菌法。
[0081]由于這種熱處理提供具有改善的抗炎特性的非復制型益生菌，本發明的組合物可以用于預防或治療炎性障礙。
[0082]不具體限制可以通過本發明的組合物治療或預防的炎性障礙。例如，它們可以選自急性炎癥，如敗血癥；燒傷；和慢性炎癥，如炎性腸病，例如局限性腸炎、潰瘍性結腸炎、隱窩炎；壞死性小腸結腸炎；皮膚炎癥，如UV或化學藥品誘導的皮膚炎癥、濕疹、反應性皮膚；腸易激綜合癥；眼睛炎癥；變態反應、哮喘；及其組合。[0083]如果用長期熱處理來使益生微生物成為非復制型，則這種熱處理可以在約70-150°C的溫度范圍內進行約3分鐘至2小時，優選在80-140°C的范圍內進行5分鐘至40分鐘。
[0084]雖然現有技術一般教導，就發揮它們的益生特性而言，通過長期熱處理使之成為非復制型的細菌通常不如活細胞有效，但本發明人能夠表明，與它們的活對應物相比，熱處理的益生菌在刺激免疫系統中更優。
[0085]本發明還涉及包含益生微生物的組合物，通過在至少約70°C下熱處理至少約3分鐘來使該益生微生物成為非復制型。
[0086]通過體外免疫特性分析(immunoprof i I ing)確認了非復制型益生菌的免疫強化作用。所使用的體外模型使用來自人外周血單核細胞(PBMC)的細胞因子譜分析(profiling)，且作為用于測試免疫調節化合物的標準模型在本領域被廣為接受(Schultz 等，2003， Journal of Dairy Research 70，165-173;Taylor 等，2006， Clinicaland Experimental Allergy, 36,1227-1235 ；Kekkonen 等，2008, World Journal ofGastroenterology,14,1192-1203)) 。
[0087]幾個作者/研究小組已用體外PBMC測定來例如根據益生菌的免疫特性，即它們的抗炎或促炎特征來分類它們(Kekkonen 等，2008, World Journal of Gastroenterology,14,1192-1203)。例如，已顯示此測定允許預測益生候選者在腸結腸炎的小鼠模型中的抗炎作用(Foligne, B.等，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。此外，此測定常用作臨床試驗中的讀出，并顯示導致與臨床結果相關的結果(Schultz等,2003, Journal ofDairy Research 70,165-173 ;Taylor等，2006,Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。
[0088]變應性疾病在過去幾十年中已穩步增加，且目前WHO將它們視為流行病。一般而言，認為變態反應由免疫系統的Thl和Th2應答之間的不平衡引起，該不平衡導致趨向于產生Th2介質(mdiator)的強趨勢。因此，可以通過恢復免疫系統的Thl和Th2雙臂間的恰當平衡來緩解、下調或預防變態反應。這意味著必需降低Th2應答，或至少瞬時增強Thl應答。后者可以是通常伴隨例如更高水平的IFNy、TNF-a和IL-12的免疫強化應答的特征。(Kekkonen 等，2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203 ；ViljanenM.等，2005，Allergy，60，494-500)。
[0089]因此，本發明的組合物允許治療或預防與免疫防御損傷相關的障礙。
[0090]因此，不具體限制可以通過本發明的組合物治療或預防的與免疫防御損傷相關的障礙。
[0091]例如，它們可以選自感染，尤其是細菌、病毒、真菌和/或寄生蟲感染；吞噬細胞缺乏；低至嚴重的免疫抑制水平，如由應激或免疫抑制藥物、化學療法或放射治療誘導的那些；較低免疫活性的免疫系統的天然狀態，如新生兒的那些；變態反應；及其組合。
[0092]本發明中所述的組合物還允許增強患者對疫苗，尤其是對口服疫苗的應答。
[0093]任意量的非復制型微生物都將是有效的。但是，一般優選至少90%、優選至少95%、更優選至少98%、最優選至少99%、理想地至少99.9%、最理想地所有的益生菌是非復制型。
[0094]在本發明的一個實施方案中，所有微生物都是非復制型。[0095]因此，在本發明的組合物中，至少90 %、優選至少95 %、更優選至少98 %、最優選至少99%、理想地至少99.9%、最理想地所有的益生菌可以是非復制型。
[0096] 為了本發明的目的，可以使用所有益生微生物。
[0097]例如,益生微生物可以選自雙歧桿菌(bifidobacteria)、乳桿菌(Iactobacilli)、丙酸桿菌(propionibacteria)或其組合，例如長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)、類干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌、二乙酸乳乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、大腸桿菌(Escherichia coli)和 / 或其混合物。
[0098]本發明的組合物可以例如包含選自長雙歧桿菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、約氏乳桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、路氏乳桿菌DSM17983、路氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、尼氏大腸桿菌(Escherichia coli Nissle)、保加利亞乳桿菌NCC
15、乳乳球菌NCC 2287或其組合的益生微生物。
[0099]所有這些菌株或是在布達佩斯條約(Budapest treaty)下保藏和/或是可商購獲得的。
[0100]已在布達佩斯條約下保藏的菌株如下:
[0101]長雙歧桿菌NCC 3001:ATCC BAA-999
[0102]長雙歧桿菌NCC 2705:CNCM 1-2618
[0103]短雙歧桿菌NCC 2950:CNCM 1-3865
[0104]乳雙歧桿菌NCC 2818:CNCM 1-3446
[0105]類干酪乳桿菌NCC 2461:CNCM 1-2116
[0106]鼠李糖乳桿菌NCC 4007:CGMCC 1.3724
[0107]嗜熱鏈球菌NCC 2019:CNCM 1-1422
[0108]嗜熱鏈球菌NCC 2059:CNCM 1-4153
[0109]乳乳球菌NCC 2287:CNCM 1-4154
[0110]干酪乳桿菌NCC 4006:CNCM 1-1518
[0111]干酪乳桿菌NCC 1825 =ACA-DC 6002
[0112]嗜酸乳桿菌NCC 3009 =ATCC 700396
[0113]保加利亞乳桿菌NCC15 =CNCM 1-1198 (于1992年4月2日保藏于國立微生物保藏中心(CNCM))[0114]約氏乳桿菌Lal:CNCM I-1225
[0115]路氏乳桿菌DSM17983:DSM17983
[0116]路氏乳桿菌ATCC55730:ATCC55730
[0117]尼氏大腸桿菌1917 =DSM 6601
[0118]本領域技術人員將理解，它們可以自由地組合本文中所述的本發明的所有特征，而不偏離所公開的發明的范圍。
[0119]本發明的其他優勢和特征從以下實施例和附圖顯而易見。
[0120]圖1A和B顯示用“短時間高溫”處理的益生菌的抗炎免疫特性的增強。
[0121]圖2顯示變為抗炎型的非抗炎益生菌株，即用“短時間高溫”處理后顯示顯著的體外抗炎免疫特性的非抗炎益生菌株。
[0122]圖3A和B顯示用于市售產品中的益生菌株，其在用“短時間高溫”處理后顯示增強的或新的體外抗炎免疫特性。
[0123]圖4A和B顯示乳制品起子菌株(即Lcl起子菌株)，其在高溫下熱處理時顯示增強的或新的體外抗炎免疫特性。
[0124]圖5顯示非抗炎益生菌株，其在用HTST處理處理后顯示體外抗炎免疫特性。
[0125]圖6:以它們的活體形式和熱處理(140°C，15秒)形式用益生菌株和乳制品起子菌株產生的PBMC數據(IL-12p40、IFN-Y、TNF-a、IL-10)上的主成分分析。每個點代表通過其NCC編號或名稱來辨別的一個活的或熱處理的菌株。
[0126]圖1顯示活的和熱處理(85°C、20分鐘)的菌株的IL-12p40/IL-10比率。總體上，與本發明的“短時間高溫”處理相反，在85°C下熱處理20分鐘導致IL-12p40/IL-10比率的增加(圖1、2、3、4和5)。
[0127]圖8顯示來自用熱處理的細菌刺激的人PBMC的體外細胞因子分泌的增強。
[0128]圖9顯示在用鹽水攻擊的OVA致敏小鼠(陰性對照)、用OVA攻擊的OVA致敏小鼠(陽性對照)及用OVA攻擊并用熱處理的或活的短雙歧桿菌NCC2950處理的OVA致敏小鼠中觀察到的腹瀉強度的百分比。結果顯示為腹瀉強度的百分比(從4個獨立實驗計算的平均值土SEM)，100%的腹瀉強度對應于陽性對照(用變應原致敏和攻擊)組中發生的癥狀。
[0129]實施例1:
[0130]方法學
[0131]細菌制劑
[0132]一般認為通過活益生菌對宿主免疫系統傳遞的健康益處是菌株特異性的。已顯示在體外誘導高水平IL-10和/或誘導低水平促炎細胞因子(PBMC測定)的益生菌是有效的體內抗炎菌株(Foligne, B.等，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0133]用幾種益生菌株來研究熱處理的益生菌的抗炎特性。這些菌株是長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、類干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)和尼氏大腸桿菌。還測試了包括商業上用來產生Nestl6Lcl發酵產物的一些菌株的幾個起子培養物菌株:嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、保加利亞乳桿菌NCC 15和乳乳球菌NCC 2287。[0134]在針對各菌株優化的條件下在5-15L生物反應器中培養細菌細胞。可以使用所有典型的細菌生長培養基。這類培養基為本領域技術人員已知。調節PH至5.5時，連續加入30%堿溶液(NaOH或Ca(OH)2)。適當時，通過用CO2處理頂空來維持無氧條件。在標準有氧條件下培養大腸桿菌。
[0135]通過離心(5，000Xg、4°C )收集細菌細胞，并以適當的體積重懸在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，以達到約109-101(lCfu/ml的終濃度。用15%的甘油將部分制劑冷凍在-80°C。通過以下來熱處理另一部分細胞:[0136]-超高溫:140°C，15秒；通過直接的蒸汽注射；
[0137]-高溫短時間(HTST):74°C、90°C和120°C，15秒，通過直接的蒸汽注射；
[0138]-水浴中長時間低溫(85°C，20分鐘)。
[0139]熱處理后，使樣品在_80°C下保持冷凍直至使用。
[0140]細菌制劑的體外免疫特性分析
[0141]評估了活的和熱處理的細菌制劑的免疫特性(即從體外人血細胞誘導特異性細胞因子分泌的能力)。從血液濾器分離了人外周血單核細胞(PBMC)。通過細胞密度梯度分開后，收集單核細胞，并用Hank’s平衡鹽溶液洗滌兩次。然后將細胞重懸在補充了 10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎,法國)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/鏈霉素(Sigma)和 0.1%慶大霉素(Sigma)的 IscoveJ s Modified Dulbecco，s Medium(IMDM, Sigma)中。用活細菌和熱處理細菌(等于7 X IO6Cfu/孔)在48孔板中孵育PBMC (7 X IO6細胞/孔)36小時。在來自劃分為兩個分開的實驗的8個個體供體的PBMC上測試了活的和熱處理的細菌的作用。孵育36小時后，將培養板凍存在-20°C，直至細胞因子測量。平行(即在同一實驗中在同一批次的PBMC上)進行活細菌和它們的熱處理對應物的細胞因子譜分析。
[0142]按照廠家的說明，通過ELISA (R&D DuoSet Human IL-10、BD OptEIA HumanIL12p40、BD OptEIA Human TNFa、BD OptEIA HumanIFN- y )測定孵育 36 小時后的細胞培養物上清中的細胞因子(IFN-y、IL-12p40、TNF-a和IL-10)水平。IFN-Y、11-12?40和1即-[1是促炎細胞因子，而IL-1O是有效的抗炎介質。結果表示為4個個體供體的平均值(pg/ml) 土SEM，且代表各用4個供體進行的兩個單獨的實驗。針對各菌株計算了 IL-12p40/IL-10比率作為體內抗炎作用的預測值(Foligne, B.等，2007，WorldJ.Gastroenterol.13:236-243)。
[0143]將通過ELISA(見上文)測定的各菌株的數值型細胞因子值(pg/ml)轉入BioNumerics v5.10 軟件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利時)。對此數據集進行了主成分分析(PCA,定尺度技術(dimensioning technique))。此分析中包括減去性狀的平均值和除以性狀的方差。
[0144]結果
[0145]通過超高溫(UHT)/高溫短時間(HTST)樣處理產生的抗炎特性
[0146]對所研究的益生菌株進行了一系列熱處理(超高溫(UHT)、高溫短時間(HTST)和850C 20分鐘)，并在體外將它們的免疫特性與活細胞的免疫特性相比較。在用人PBMC孵育時，活微生物(益生菌和/或乳制品起子培養物)誘導了不同水平的細胞因子產生(圖
1、2、3、4和5)。這些微生物的熱處理以溫度依賴方式改變了由PBMC產生的細胞因子的水平。“短時間高溫”處理(120°C或140°C，15秒)產生了具有抗炎免疫特性的非復制型細菌(圖1、2、3和4)。事實上，UHT樣處理的菌株(140°C，15秒)誘導較少的促炎細胞因子(TNF- a、IFN- y、IL_12p40)，同時保持或誘導其他IL-1O產生(與活對應物相比)。與活細胞相比，對于任意UHT樣處理的菌株，產生的IL-12p40/IL-10比率更低(圖1、2、3和4)。此觀測結果對通過HTST樣處理的處理細菌，即經受120°C 15秒(圖1、2、3和4)或74°C和90°C 15秒(圖5)的細菌也正確。熱處理(UHT樣或HTST樣處理)對益生菌株(圖1、
2、3和5)和乳制品起子培養物(圖4)的體外免疫特性具有相似的作用。用活的和熱處理(140°C，15秒)的益生菌株和乳制品起子菌株產生的PBMC數據上的主成分分析揭示，活菌株全沿X軸散布，說明菌株顯示非常不同的體外免疫特性，從促炎細胞因子的低誘導者(左偵D至高誘導者(右側)。熱處理的菌株聚集在圖的左側，顯示熱處理的菌株較少地誘導促炎細胞因子(圖6)。相反，在85°C下熱處理20分鐘的細菌比活細胞誘導更多的促炎細胞因子和更少的IL-10，導致更高的IL-12p40/IL-10比率(圖7)。
[0147]通過UHT樣和HTST樣處理增強或產生了抗炎特性
[0148]無論它們各自的起始免疫特性(活細胞)如何，UHT和HTST處理的菌株都顯示抗炎特性。顯示了已知在體內為抗炎型且顯示體外抗炎特性的益生菌株(長雙歧桿菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818)在“短時間高溫”處理后顯示增強的體外抗炎特性。如圖1中所示，UHT樣處理的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)菌株的IL-12p40/IL_10比率低于來自活對應物的那些，從而顯示UHT樣處理的樣品的改善的抗炎特性。更令人驚奇地，還針對非抗炎型活菌株確認了通過UHT樣和HTST樣處理產生抗炎特性。活的鼠李糖乳桿菌NCC4007和類干酪乳桿菌NCC 2461都在體外顯示高的IL-12p40/IL-10比率(圖2和5)。顯示了這兩種活菌株對小鼠中TNBS誘導的結腸炎無保護作用。鼠李糖乳桿菌NCC 4007和類干酪乳桿菌NCC 2461誘導的IL-12p40/IL-10比率在“短時間高溫”處理(UHT或HTST)后顯著降低，達到與用雙歧桿菌屬菌株獲得的那些一樣低的水平。這些低IL-12p40/IL-10比率由低水平的IL-12p40產生與無變化(鼠李糖乳桿菌NCC 4007)或顯著誘導(類干酪乳桿菌NCC 2461)的IL-10分泌的組合引起(圖2)。
[0149]因此:
[0150]-可以通過UHT樣和HTST樣熱處理來增強活微生物的抗炎特性(例如長雙歧桿菌NCC 2705、長雙歧桿菌NCC 3001、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818)；
[0151]-可以通過UHT樣和HTST樣熱處理來從非抗炎型活微生物(例如鼠李糖乳桿菌NCC 4007、類干酪乳桿菌NCC 2461、乳制品起子嗜熱鏈球菌NCC 2019)產生抗炎特性；
[0152]-還針對包括益生大腸桿菌菌株的分離自市售產品的菌株(圖3A和B)顯示了抗炎特性。
[0153]對于所有測試的益生菌和乳制品起子，例如乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌，UHT/HTST樣處理的影響相似。
[0154]將UHT/HTST樣處理應用于顯示不同的體外免疫特性的幾種乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌。所有菌株在UHT/HTST樣處理后都比它們的活對應物誘導更少的促炎細胞因子(圖1、2、3、4、5和6)，表明UHT/HTST樣處理對產生的非復制型細菌的免疫特性的作用可以泛化至所有益生菌，尤其是乳桿菌、雙歧桿菌和特定大腸桿菌菌株，及所有乳制品起子培養物，尤其是鏈球菌、乳球菌和乳桿菌。[0155]實施例2:
[0156]方法學
[0157]細菌制劑
[0158]用5個益生菌株來研究非復制型益生菌的免疫強化特性:3種雙歧桿菌(長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950)和2種乳桿菌(類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007)。
[0159]在37°C的分批發酵中在MRS上培養細菌細胞16-18小時，無pH控制。離心(5，000Xg，4°C )沉淀細菌細胞，并重懸在磷酸緩沖鹽溶液中，然后稀釋在鹽水中，以達到約10E10cfu/ml的終濃度。在水浴中85°C熱處理長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007 20分鐘。在水浴中90°C熱處理短雙歧桿菌NCC295030分鐘。分裝熱處理的細菌懸液，并凍存在_80°C，直至使用。將活細菌在PBS-15%甘油中保存在_80°C，直至使用。
[0160]細菌制劑的體外免疫特性分析
[0161]評估了活的和熱處理的細菌制劑的免疫特性(即從體外人血細胞誘導特異性細胞因子的分泌的能力)。從血液濾器分離了人外周血單核細胞(PBMC)。通過細胞密度梯度分開后，收 集單核細胞，并用Hank’s平衡鹽溶液洗滌兩次。然后將細胞重懸在補充了 10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎,法國)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/鏈霉素(Sigma)和 0.1 %慶大霉素(Sigma)的 Iscove，s Modified Dulbecco，s Medium (IMDM, Sigma)中。然后用活的和熱處理的細菌(等于7X IO6Cfu/孔)在48孔板中孵育PBMC (7 X IO6細胞/孔)36小時。在來自劃分為兩個分開的實驗的8個個體供體的PBMC上測試了活的和熱處理的細菌的作用。孵育36小時后，將培養板凍存在-20°C，直至細胞因子測量。平行(即在同一實驗中在同一批次的PBMC上)進行活細菌和它們的熱處理對應物的細胞因子譜分析。
[0162]按照廠家的說明，通過ELISA (R&D DuoSet Human IL-10、BD OptEIA HumanIL12p40、BD OptEIA Human TNF、BD OptEIA HumanIFN-Y )測定孵育 36 小時后的細胞培養物上清中的細胞因子(IFN- y , IL-12p40、TNF-a和IL-10)水平。IFN1、IL_12p40和TNF-a是促炎細胞因子，而IL-1O是有效的抗炎介質。結果表示為4個個體供體的平均值(pg/ml) 土SEM，且代表各用4個供體進行的兩個單獨的實驗。
[0163]活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950在預防變應性腹瀉中的體內作用
[0164]用變應性腹瀉的小鼠模型來測試短雙歧桿菌NCC2950的Thl促進作用(Brandt
E.B等JCI 2003 ；112(11) =1666-1667) ?致敏(按14天的間隔2次腹膜內注射卵清蛋白(OVA)和硫酸鋁鉀；第0天和第14天)后，用OVA經口攻擊雄性Balb/c小鼠6次(第27、29、32、34、36、39天)，導致短暫的臨床癥狀(腹瀉)和免疫參數(總IgE,OVA特異性IgE,小鼠肥大細胞蛋白酶1(即MMCP-1)的血漿濃度)的變化。OVA致敏前4天(第-3、-2、-1、0天及第11、12、13和14天)和攻擊期期間(第23至39天)，通過管飼法施用活的或90°C下熱處理30分鐘的短雙歧桿菌NCC2950。使用了約109菌落形成單位(cfu)或等同cfu/小鼠的日細菌劑量。
[0165]結果
[0166]熱處理后“促炎”細胞因子的分泌的誘導[0167]在體外評估了熱處理的細菌菌株刺激人外周血單核細胞(PBMC)分泌細胞因子的能力。將通過熱處理的細菌刺激PBMC后基于四種細胞因子的免疫特性與在同一體外測定中通過活細菌細胞誘導的免疫特性相比較。
[0168]平板接種熱處理的制劑，并針對任意活菌計數的缺乏評估。熱處理的細菌制劑未在平板接種后產生菌落。
[0169]在用人PBMC孵育時，活益生菌誘導了不同且依賴于菌株的細胞因子產生水平(圖8)。與它們的活對應物相比，熱處理益生菌改變了由PBMC產生的細胞因子的水平。熱處理的細菌比它們的活對應物誘導更多的促炎細胞因子(TNF-a、IFN1、IL-12p40)。相反，與活細胞相比，熱處理的細菌誘導相似量或更低量的IL-10(圖8)。這些數據顯示，熱處理的細菌比它們的活對應物更能夠刺激免疫系統，因此更能夠強化變弱的免疫防御。換言之，體外數據表明熱處理后的細菌菌株的增強的免疫強化作用。
[0170]為了說明熱處理的短雙歧桿菌NCC2950(與活細胞相比)對免疫系統的增強的作用，在變應性腹瀉的動物模型中測試了活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950 (菌株A) 二者。
[0171]與陽性對照組相比，用熱處理的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉強度顯著且一致地減少(41.1% ±4.8)，而用活的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉強度僅降低20±28.3%。這些結果表明，與它的活對應物相比，熱處理的短雙歧桿菌NCC2950顯示增強的對變應性腹瀉的保護作用(圖9)。
[0172]因此，顯示了益生菌增強免疫防御的能力在熱處理后得到改善。
[0173]實施例3-5:
[0174]可以制備以下制劑:
[0175]
【權利要求】
1.通過管飼施用的組合物，其向患者提供完全營養，且包含益生微生物。
2.權利要求1的組合物，其具有0.9-2.lkcal/ml的范圍內的熱量密度、360-750m0sm/kg水的范圍內的重量摩爾滲透壓濃度，且包含占組合物卡路里的約15-17%的蛋白質源、占組合物卡路里的約38-52%的糖類源和占組合物卡路里的約32-46%的脂質源，且具有125: I至140: I的范圍內的NPC: N比率。
3.前述權利要求中任一項的組合物，其包含n6: n3脂肪酸比率在4:1至5:1的范圍內和/或MCT: LCT比率在24: 76至76: 24的范圍內的脂質源。
4.前述權利要求中任一項的組合物，其包含約69-86%自由水。
5.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述益生微生物包含非復制型益生微生物。
6.前述權利要求中任一項的組合物，其以對應于約IO6至IO12Cfu的量包含益生微生物。
7.前述權利要求中任一項的組合物，其中通過熱處理，優選通過在至少71.5°C下高溫處理至少1秒來使所述非復制型益生微生物成為非復制型。
8.權利要求7的組合物，其中所述熱處理是在約71.5-150°C下高溫處理約1-120秒，且優選是高溫/短時間(HTST)處理或超高溫(UHT)處理。
9.權利要求8的組合物，其用于預防或治療炎性障礙。
10.權利要求7的組合物，其中所述熱處理在約70-150°C的溫度范圍內進行約3分鐘至2小時，優選在80-140°C的范圍內進行5分鐘至40分鐘。
11.權利要求10的組合物，其用于預防或治療與免疫防御損傷相關的障礙。
12.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述益生菌的至少90%、優選至少95%、更優選至少98%、最優選至少99%、理想地至少99.9%、最理想地全部是非復制型。
13.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述益生微生物選自雙歧桿菌、乳桿菌、丙酸桿菌或其組合，例如長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌、唾液乳桿菌、路氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、約氏乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌、乳乳球菌、嗜熱鏈球菌、乳乳球菌、二乙酰乳乳球菌、乳脂乳球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌、大腸桿菌和/或其組口 o
14.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述益生微生物選自長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、約氏乳桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、路氏乳桿菌DSM17983、路氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、尼氏大腸桿菌、保加利亞乳桿菌NCC15、乳乳球菌NCC 2287或其組合。
15.前述權利要求中任一項的組合物，其每個日劑量包含約0，005mg-1000mg非復制型微生物。
【文檔編號】A61K35/74GK103596578SQ201080031172
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2010年5月11日 優先權日:2009年5月11日
【發明者】A·梅賽尼爾, S·努特恩, G·普里烏特 申請人:雀巢產品技術援助有限公司