專利名稱：冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法及由其制備的冷凍保存無細胞真皮基質的制作方法
技術領域：
本發明涉及冷凍保存無細胞真皮基質(acellualr dermal matrix, ADM)的制備方法及由其制備的冷凍保存無細胞真皮基質。更詳細地，涉及以甘油及基本溶液為基本成分，在其中添加蔗糖，從而制得冷凍保護劑，然后利用該溶液對去除了表皮及真皮內細胞的皮膚組織進行冷凍保存處理的方法以及由其制備的冷凍保存無細胞真皮基質。
背景技術：
皮膚是覆蓋整個人體表面的最大器官，其防止體液的流失，以及防止有害物質和微生物侵入，抵御來自物理、化學方面的刺激等，執行保護我們身體的功能。對于因嚴重的燒傷、外傷、上皮癌切除及皮膚疾病等而使皮膚嚴重受損的患者，應起到阻止受損部位感染及體液損失的保護膜的作用，同時應使患者的傷口部位不留下疤痕，防止在自然愈合過程中可能發生的嚴重收縮。用于使受損的皮膚組織再生的方法有以下三種移植患者自身皮膚的自體移植(autograft)、移植他人皮膚的同種異體移植(allograft)及移植動物皮膚的異種移植(xen ograft)。這些方法中自體移植最為理想，但燒傷部位范圍大的情況下，能夠確保組織的部位有限，在取皮部位還會留下新的傷口，因此存在困難。同種異體移植與其說起到永久移植的作用，不如說起到有助于傷口周圍區域的細胞移動和愈合的作用。特別是在表皮層、真皮層直至皮下層受損的3度燒傷的情況下，必須要進行皮膚移植治療。現在主要采用的皮膚移植治療方法為自體移植方法，由于在摘除了皮膚的健康部位產生新的外傷，因此增加了患者的痛苦，需要很長時間痊愈，并且經濟負擔也大。此外， 如嚴重的燒傷患者沒有足夠的身體健康部位的情況下，存在無法采用自體移植方法或需要進行多次移植手術的問題。人們試圖采用他人皮膚的同種異體移植或采用豬等其它動物皮膚的異種移植等來解決上述問題，但這樣不僅會發生免疫排斥反應，有時還會帶來其它副作用。因此，國內外醫院實施的燒傷手術最普遍的情況為先將壞死的表皮層和真皮層去除，然后利用捐贈者尸體的皮膚，去除表皮后，利用去除了真皮內細胞的無細胞真皮進行皮膚移植，以消除免疫排斥反應。之后培養的角質細胞在其上完成完整的皮膚。這樣完成的皮膚含有基膜層，因此能夠像實際皮膚一樣起到保護我們身體的作用，防止外界有害物質的進入。但是這種用于移植的皮膚價格非常昂貴，并且大部分為進口產品，存在供需不暢的問題。利用捐贈者尸體的皮膚，去除表皮后，為了便于保存，對去除了真皮內細胞的無細胞真皮基質進行冷凍后再使用的情況較多，以消除免疫排斥反應，但在冷凍過程中無細胞真皮內的膠原蛋白組織被破壞，存在移植后分解速度快的問題。
發明內容
本發明要解決的技術問題因此，本發明的目的在于，提供一種新的冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，并以此作為技術課題，該方法在對用于移植的皮膚進行加工時，與現有的方法相比，能夠更加有效地提高組織的穩定性，維持細胞外基質(extracellular matrix)的結構不受到損傷。解決技術問題的技術手段為了實現上述目的，本發明提供冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，其包括下列步驟i)去除同種異體皮膚的表皮；ii)去除真皮內細胞；iii)將甘油與選自緩沖溶液及動物細胞培養基的基本溶液進行混合；iv)在上述溶液中溶解蔗糖，使蔗糖最終濃度達到20 40重量％，從而制得冷凍保護劑；ν)將上述去除了表皮及真皮內細胞的皮膚用上述冷凍保護劑浸透；vi)將浸透了冷凍保護劑的皮膚在程序冷凍儀中冷凍。本發明還提供自體移植替代物，其含有由上述方法制備的冷凍保存無細胞真皮基質。下面，詳細說明本發明。在本發明中，對同種異體皮膚去除表皮后再去除真皮內細胞，以消除免疫排斥反應。去除表皮及真皮內細胞可采用本領域公知的多種方法實施，沒有特別的限制。去除表皮時，可使用例如胰蛋白酶(tr ypsin)、膠原酶(collagenase)或分散酶(dispase)等酶或 NaCl溶液進行處理。去除真皮內細胞時，可使用例如曲拉通XlOO (Triton X100)、吐溫20、 吐溫40、吐溫60、吐溫80或十二烷基硫酸鈉(sodi um dodecylsulfate, SDS)等進行處理。本發明的冷凍保護劑使用甘油及基本溶液作為基本成分。本發明的基本溶液指的是制備冷凍保護劑時作為基礎(base)的溶液，可以使用處理動物細胞時使用的緩沖溶液或動物細胞培養基。本發明的緩沖溶液只要是本領域對動物細胞處理時所使用的緩沖溶液即可，沒有特別的限制。本發明可使用的緩沖溶液例如有磷酸緩沖溶液(phosphate buffered saline, PB S)、Tris 緩沖鹽溶液(Tr is-buffered saline, TBS)、檸檬酸緩沖溶液(citric acid buffer)等，但不限于此。本發明的動物細胞培養基可使用本領域公知的任意的培養基。本發明可使用的動物細胞培養基例如有MEM(最小必需培養基(Minimum Essential Media))、DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco，s Modified Eagle Media))、RPMI1640、IMDM(伊思考夫改良杜爾貝可培養基(Iscove' s Modified Dulbecco，s Media))、特定角化細胞無血清培養基(Defined Keratinocyte-SFM(不含 BPE))、角化細胞培養基(Keratinocyte-SFN(含 BPE))、敲除 D-MEM(Knock-Out D-MEM)、 AmnioMAX-II 完全培養基(AmnioMAX-II Complete Medium)及 AmnioMAX-ClOO 完全培養基 (AmnioMAX-ClOOComplete Medium)等，但不限于此。本發明的甘油及基本溶液以重量計，優選以0.5 3. 5 9的混合比來使用，更優選為0.8 2 9，最優選為1 9。如果本發明的甘油混合比小于0. 5的情況下，會有冷凍時因凍傷引起的問題，大于3. 5的情況下，會在冷凍后誘發組織的變性。本發明的冷凍保護劑是在上述甘油及基本溶液進行混合的溶液中，溶解蔗糖 (sucrose)，使其最終濃度達到20 40重量％，從而制得。在本發明的冷凍保護劑中添加蔗糖，起到了保護其免受冷凍細胞膜和細胞膜蛋白質時出現的冰晶的影響并使其穩定的作用。因此，根據本發明的方法制得的冷凍保存無細胞真皮基質能夠提高其組織穩定性，采用甘油、基本溶液及蔗糖的理想混合比，能夠使真皮組織的穩定性得到更大的提高，能夠維持細胞外基質的結構不受到損傷。本發明的冷凍保護劑中的蔗糖濃度小于20重量％的話，冷凍時會因冰晶的影響降低組織的穩定性等，如果大于40重量％，會因高濃度的糖成分使冷凍干燥后組織中生成糖結晶，這會給組織的安全性帶來影響。本發明的冷凍保護劑在混合有上述基本溶液的溶液中優選以最終濃度為25至35重量％來溶解蔗糖，最優選以30重量％進行溶解，從而制得。本發明中，在皮膚組織中浸透冷凍保護劑可以使用本領域公知的多種方法，優選在低溫反應器中，使冷凍保護劑浸透皮膚。浸透所需的時間根據皮膚組織的大小等而有所不同，例如在4°C的低溫反應器中，可以浸透約6 M小時。本發明中浸透了冷凍保護劑的皮膚可以使用溫度可控的程序冷凍儀(controlled rate freezer)進行冷凍。冷凍時使用溫度可調節的程序冷凍儀能夠以期望的速度冷凍皮膚。本發明中使用溫度可調節的程序冷凍儀來冷凍皮膚的速度優選為-0. rC/min至-7°C/ min，更優選為-0. 5 0C /min至-5°C /min，進一步優選為-0. 8 V /min至-3°C /min，最優選為-1°C /min。本發明進行冷凍時，冷凍速度低于-0. I0C /min，冷凍過慢的情況下，由于組織內的溶質多于組織外的溶質，因此冷凍速度降低會使冷凍溫度慢慢降低，組織外先形成大塊的冰晶，從而會破壞組織。并且，由于浸透了冷凍保護劑的皮膚的溫度和程序冷凍儀腔室的溫度不能夠相同，由于從發生潛在熔化熱的溫度區域急速冷凍至沒有水分子運動的-80°C溫度，使速度大于每分鐘_7°C因此若不能夠調節潛在熔化熱，則會發生冰晶現象， 使組織破壞。發明的效果根據本發明的方法制備的冷凍保存無細胞真皮基質的組織穩定性高，能夠維持細胞外基質(extracellular matrix)結構及基底膜(b asement membrane)不會受到損傷， 因此能夠有效用作自體移植的替代物。
圖1為示出用掃描電子顯微鏡對實施例及比較例的無細胞真皮基質分別放大60 倍及150倍拍攝的照片。(A 比較例，60X ；B 比較例，150X ；C 3實施例，60X ；D 實施例， 150X)圖2為示出將實施例及比較例的無細胞真皮基質進行H&E染色后，用光學顯微鏡分別放大100倍及200倍后拍攝的照片。(A 比較例，100X ；B 比較例，200X ；C 實施例， 100X ；D 實施例，200X)圖3為對使用蔗糖最終濃度分別為10、15、20、25、30、35及40重量％的冷凍保護劑處理后的冷凍保存無細胞真皮基質，進行膠原蛋白水解酶的分解性測定的結果圖。 (P. C.(陽性對照，positive cont rol)對膠原蛋白粉末用膠原蛋白水解酶進行處理； N. C.(陰性對照，negative control)；不進行膠原蛋白水解酶處理；D. W.蒸餾水)
具體實施例方式下面通過實施例進一步詳細說明本發明。但這些實施例僅是為了例示本發明，并不能限制本發明的范圍。由于捐贈者(尸體)的人體皮膚組織的應用受到限制，因此使用了接近人體皮膚的豬皮，根據下述實施例及比較例的方法分別制備了 10份。實施例使用豬皮按照下述步驟準備冷凍保存皮膚。(1)用生理鹽水洗凈豬皮。(2)將豬皮分別切成5 X IOcm2的大小。(3)在IM的NaCl (Sigma，美國)溶液中分別加入豬皮。(4)準備 38 °C 的反應器(P-039，KoaTech)。(5)將置于IM的NaCl (Sigma，美國)溶液中的豬皮在38°C的反應器中進行約6至 M小時的攪拌反應。(6)利用醫用鑷子去除表皮。(7)用磷酸緩沖溶液(pH7. 2，GIBC0，美國)清洗去除了表皮的真皮。(8)將清洗后的真皮放入0. 的SDS中，在常溫下攪拌反應1小時，從而去除真皮內細胞。(9)用磷酸緩沖溶液清洗去除了細胞的真皮。(10)將甘油(Sigma，美國)及磷酸緩沖液以1 9的重量比進行混合。(11)在(10)的混合溶液中溶解蔗糖(Sigma，美國)，使最終濃度達到30%，從而制得冷凍保護劑。(12)準備 4°C 的低溫反應器(P-039，KoaTech)。(13)在4°C的低溫反應器中放入(9)的豬皮，然后在冷凍保護劑中浸透12小時。(14)將浸透好的豬皮放入聚酰胺袋(低溫包裝袋(CryoBag)，奧利金(Origen)，美國)中。(15)準備程序冷凍儀(14S-A，SY實驗室，美國)。(16)將(14)的聚酰胺袋放入程序冷凍儀中，以-1°C /min的速度冷凍至_150°C。(17)冷凍結束后，直至分析實驗前，將聚酰胺袋冷凍保存于絕熱包裝(Dry shipper)中。比較例使用豬皮按照下述步驟準備冷凍干燥皮膚。(1)用生理鹽水洗凈豬皮。(2)將豬皮分別切成5 X IOcm2的大小。(3)在IM的NaCl (Sigma，美國)溶液中分別加入豬皮。(4)準備 38 °C 的反應器(P-039，KoaTech)。(5)將置于IM的NaCl (Sigma，美國)溶液中的豬皮在38°C的反應器中進行攪拌反應約6至M小時。(6)利用醫用鑷子去除表皮。(7)用磷酸緩沖溶液清洗去除了表皮的真皮。(8)將清洗后的真皮放入0. 的SDS中，在常溫下攪拌反應1小時，從而去除真皮內細胞。
(9)用磷酸緩沖溶液(pH7. 2，GIBC0，美國)清洗去除了細胞的真皮。(10)將甘油(Sigma，美國)及磷酸緩沖液以1 9的重量比進行混合，從而制得冷凍保護溶液。(11)準備 4°C 的低溫反應器(P-039，KoaTech)。(12)在4°C的低溫反應器中放入(9)的豬皮，然后浸透冷凍保護劑12小時。(13)將浸透好的豬皮放入高密度聚乙烯合成紙袋(Tyvek bag，高麗新材料，韓國)中。(14)準備冷凍干燥器(Genesis 25XL，VirTis，美國)。(15)將(13)的高密度聚乙烯合成紙袋放入冷凍干燥器中，以_1°C /min的速度冷凍至_70°C，在真空5torr的冷凍干燥器中干燥M小時，從而制得冷凍干燥的無細胞真皮基質。(16)冷凍干燥結束后，放入E. 0.氣體滅菌器(HS-4313E0，Hanshin Medical，韓國)中進行滅菌。(17)將滅菌的冷凍干燥無細胞真皮基質放入鋁袋中進行密封，在常溫下保存直至實驗前。實驗例1組織學鑒定按照下述方法，對上述實施例及比較例準備的豬皮進行H&E染色。(1)將石蠟塊切成4μπι厚，然后對其進行干燥，制成石蠟切片。(2)實施脫蠟過程，在二甲苯中反應3次，每次5分鐘；在100%乙醇中反應3次， 每次2分鐘；在90%的乙醇中反應1次，1分鐘；在80%乙醇中反應1次，1分鐘；在70%乙醇中反應1次，1分鐘；之后用流動的水清洗10分鐘。在蘇木精(Hematoxylin)染色液中反應10分鐘，然后用流動的水清洗3分鐘，在伊紅(Eosin)染色液中反應10分鐘，然后用流動的水清洗，直至沒有伊紅染色液流出。在 70%乙醇中反應10次，每次1秒；在80%乙醇中反應10次，每次1秒；在90%乙醇中反應 10次，每次1秒；在100%乙醇中反應2次，每次1分鐘；在二甲苯中反應3次，每次3分鐘； 然后用封固(mounting)溶液進行封固。為了使用掃描電子顯微鏡對上述實施例及比較例準備的豬皮進行觀察，實施如下。(1)將試樣在 2. 5 % 的戊二醛(glutaraldehyde)溶液(固定液，Fixative solution)中進行2小時預固定，然后使用0. IM的磷酸緩沖溶液清洗后，用1 %的OsO4溶液進行后固定。(2)按照乙醇濃度增加的順序進行脫水/取代，在-190°C的液氮內進行冷凍切斷， 使試樣的截面露出，然后利用臨界點干燥機(HCP-幻使試樣完全干燥。(3)使露出的試樣的截面朝上并附著在鋁支架(Stub)(試樣固定臺)上，在金屬離子涂布裝置(E-1030離子濺射(Ion sputter))中用Pt-Pd實施約IOnm厚的金屬涂布。(4)用掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4700，日本)進行觀察及攝影。用光學顯微鏡(Olympus BX51，H&E染色(staining))及掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4700,日本)對實施例及比較例的皮膚進行攝影，如圖1和2所示。由圖1和圖2的結果可知，實施例中構成組織內真皮的膠原蛋白的結構穩定性大大優于比較例。并且，由圖1和圖2的顯微鏡照片中可以看出，實施例在冷凍過程中引起的組織破壞顯然要少于比較例。即本發明的處理方法與現有的冷凍干燥處理方法相比，顯示出了高度的組織穩定性，能夠提高由本發明的處理方法制備的無細胞真皮的移植率，并且能夠縮短治療時間。實驗例2測定根據膠原蛋白水解酶的分解性為了觀察無細胞真皮基質的穩定性隨蔗糖濃度差異的變化，按照下述步驟測定了膠原蛋白分解酶的分解性。(1)將25mg的試樣添加到5mM的TES緩沖液中，并混勻，所述5mM的TES緩沖液中混合有 5ml 的 0. 36mM 的氯化鈣(calciu m chloride)。(2)將0. Iml的0. lmg/ml的膠原蛋白酶(collagenase)添加到(1)的試樣中混勻，在37°C下反應1天。(3)用 4. OmM 的 L-亮氨酸標準溶液(L-leucine standard soluti on)連續稀釋 (serial dilution)后，用弗三酮顯色劑(ninhydrin col or reagent)進行處理,在 570nm 下測定了吸光度(VERSA max, M olecular Device，美國)并繪制了標準曲線。(4)將O)的試樣用茚三酮顯色劑處理，在570nm下測定了吸光度。(5)利用(3)的標準曲線計算出了各個試樣所釋放的L-亮氨酸(L-leucine)的量。上面計算得到的L-亮氨酸的釋放量如圖3所示。由圖3可以看出，使用蔗糖最終濃度為20至40重量％的冷凍保護劑進行處理的冷凍保存無細胞真皮基質的組織穩定性高，并且通過膠原蛋白酶的水解速度顯著降低。
權利要求
1.冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，其包括下列步驟i)去除同種異體皮膚的表皮； )去除真皮內細胞；iii)將甘油與選自緩沖溶液及動物細胞培養基的基本溶液進行混合；iv)在上述溶液中溶解蔗糖，使蔗糖終濃度達到20 40重量％，從而制得冷凍保護劑；ν)將上述去除了表皮及真皮內細胞的皮膚用上述冷凍保護劑浸透；vi)將浸透了冷凍保護劑的皮膚在程序冷凍儀中冷凍。
2.根據權利要求1所述的冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，其特征在于，以重量計，甘油及基本溶液的混合比為0.5 3 9。
3.根據權利要求1所述的冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，其特征在于，緩沖溶液選自磷酸緩沖溶液(PBS)、Tris緩沖鹽溶液(Tris-buffered saline,TBS)及檸檬酸緩沖液(citric acid buffer)。
4.根據權利要求1所述的冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，其特征在于，動物細胞培養基選自MEM(最小必需培養基(Minimum Essential Media))、DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco' s Modified Eagle Media)) ,RPMI 1640、IMDM(伊思考夫改良杜爾貝可培養基(Iscove，s Modified Dulbecco' s Media))、特定角化細胞無血清培養基 (Defined Keratinocyte-SFM (不含 BPE))、角化細胞培養基(Keratinocyte-SFN (含 BPE))、 敲除D-MEM(Knock-Out D-MEM)、AmnioMAX_II 完全培養基(AmnioMAX-II Complete Medium) 及 AmnioMAX-ClOO 完全培養基(AmnioMAX-ClOOComplete Medium)。
5.根據權利要求1所述的冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，其特征在于，蔗糖的最終濃度為30重量％。
6.根據權利要求1所述的冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，其特征在于，將分離的皮膚用冷凍保護劑浸透的過程，是在4°C的低溫反應器中，浸透6 M小時。
7.根據權利要求1所述的冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法，其特征在于，浸透了冷凍保護劑的皮膚在程序冷凍儀中，以-1°C /min的速度進行冷凍。
8.自體移植替代物，其含有由權利要求1至7中任一項所述的方法制備的冷凍保存無細胞真皮基質。
全文摘要
本發明涉及冷凍保存無細胞真皮基質的制備方法及由其制備的冷凍保存無細胞真皮基質。更詳細地，涉及以甘油及基本溶液為基本成分，在其中添加蔗糖，從而制得冷凍保護劑，然后利用該溶液對去除了表皮及真皮內細胞的皮膚組織進行冷凍保存處理的方法以及由其制備的冷凍保存無細胞真皮基質。
文檔編號A61L27/36GK102573945SQ201080040509
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月9日 優先權日2009年9月11日
發明者全旭, 崔源益, 樸晚成, 鄭載得, 金根亨 申請人:翰林大學校產學協力團