一種生物工程脫細胞真皮基質的制備及用圖
【專利摘要】本發明公開了一種新型的生物工程脫細胞真皮基質及其制備方法。對豬的皮膚進行預處理后得到真皮層皮片，真皮基質脫細胞過程中全程使用混合保護液；采用高靜壓技術預分離真皮組織內的細胞；采用復合核酸酶方法消化殘余細胞核；利用去垢劑脫除松散破碎細胞片；使用混合保護液進行漂洗。本發明運用適宜高效的物理手段，輔助少量的酶和去垢劑的方法充分脫去真皮中的細胞成分，在保護液的全程保護下，可以保證在細胞核脫凈的基礎上，最大限度地降低真皮基質的免疫原性，且同時保留真皮基質的正常三維膠原纖維結構及排列極性，使制得的脫細胞真皮基質具有良好的穩定性與生物相容性。
【專利說明】
一種生物工程脫細胞真皮基質的制備及用途
技術領域
[0001]本發明涉及生物工程醫用材料的制備領域，具體為真皮基質脫細胞的制備方法
【背景技術】
[0002]嚴重創傷、大面積燒傷和皮膚潰瘍等患者存在皮膚缺失的巨大創面或難愈合，而治療缺損的創面，基本上是以自體皮移植為主，但往往自體皮源緊張，尤其當大面積皮膚缺損時獲取自體皮就更為困難。另一方面，取自體皮膚是對患者新的創傷;所以在這些病的治療過程中，采用皮膚替代物暫時或長期覆蓋創面，成為臨床的需要。
[0003]天然真皮材料由于與人類皮膚相似，故成為皮膚移植的首選。其中異種皮價格低廉，來源廣泛，但存在著異體細胞抗原性，很容易發生強烈的免疫排斥，消除其抗原性才能成為理想的皮膚替代物。因此如何對異種皮膚脫細胞，去除異種皮膚抗原性，同時保其完整的真皮膠原纖維的三維結構，成為目前組織工程真皮研制的熱點。
[0004]現有脫細胞真皮制造技術均為化學試劑處理的方法破壞其細胞，并結合戊二醛等交聯劑交聯降低免疫原性，存在著破壞膠原結構、遺留生物毒性等缺點。近年來也提出了采用物理手段脫除異種皮細胞的方法，期望解決化學試劑處理方法制備真皮材料存在的缺點，然而這些脫細胞方法往往會導致組織內在結構遭到破壞，失去脫細胞組織原有的基本生物功能。
[0005]因此針對現有技術的不足，提供一種既能夠降低真皮基質的免疫原性，又保留真皮基質的正常膠原結構的脫細胞真皮基質及其制備方法是當務之急。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種全程使用特殊保護液以及適宜高效的物理復合生物酶獲取脫細胞真皮基質的方法。
[0007]本發明的創新處在于:1、對豬的皮膚進行預處理后得到真皮層皮片；2、真皮基質脫細胞過程中全程使用包含一種或多種真皮結構保護成分的混合保護液;3、采用高靜壓技術預分離皮膚組織內的細胞;4、采用復合核酸酶方法消化殘余細胞核;5、利用去垢劑脫除松散破碎細胞片;6、使用混合保護液進行漂洗。脫細胞步驟設定合適的溫度、時間以及去垢劑、消化酶濃度對結膜組織進行處理。
[0008]各種保護性成分的用量為硫酸軟骨素的濃度為30_80g/L;透明質酸的濃度為20-50g/L;甘油的濃度為100-500g/L;新霉素5-10mg/L。
[0009]高靜壓壓力條件為400_600MPa，高靜壓頻率為5?10次，每次為2?5分鐘。
[0010]DNA酶的濃度為2000-4000U/ml，核酸酶的濃度為2000-4000U/ml ANA酶或核酸酶的脫細胞核時間為3-6小時，處理溫度為15-30度。
[0011]去垢劑條件為Pluronic F68的濃度0.1_5%，十二烷基肌氨酸鈉的濃度0.1_5%，PEG 400的濃度5-10%。去垢劑處理時間為3-6小時。
[0012]可選擇性的同時或分開進行酶和去垢劑的處理。
【附圖說明】
[0013]圖1為正常豬皮膚切片的HE染色圖
[0014]圖2為脫細胞豬皮膚切片的DAPI染色圖
[0015]圖3為皮膚組織脫細胞全程使用保護液的結果
[0016]圖4為皮膚組織脫細胞全程未使用保護液的結果
[0017]圖5為皮膚組織脫細胞過程中使用去垢劑的結果
[0018]圖6為皮膚組織脫細胞過程中未使用去垢劑的結果
[0019]圖7為皮膚組織脫細胞過程中使用消化酶的結果
[0020]圖8為皮膚組織脫細胞過程中未使用消化酶的結果
【具體實施方式】
[0021]下面通過實施例對本發明進行具體的描述，這些實施例只用于進一步詳述說明本發明，不能理解為對本發明保護范圍的限定，在本發明保護范圍之內做出非本質的調整需本發明方授權。
[0022]本發明的實施例1
[0023]取豬背部皮，經清洗、去毛后，留取厚度為0.3-0.5mm，寬度為l-5cm的中厚真皮皮片備用。
[0024]1、全程使用保護液對真皮組織進行保護，保護液配方為:RPM1-1640培養基，添加硫酸軟骨素40g/L，透明質酸20g/L，新霉素5mg/L，調pH值至7.2，滲透壓為380m0sm ；
[0025]2、將真皮皮片密封在盛有保護液的塑料袋中；
[0026]3、于400MPa高靜壓條件下，處理8次，每次時間為5分鐘；
[0027]4、將真皮取出后，置于含2%Pluronic F68+2000U/ml DNA酶的保護液中，溫度為30 0C，設定搖床速度為100轉/分鐘，處理4小時；
[0028]5、去垢劑與酶處理完畢后，取出結膜置于保護液中漂洗3小時。
[0029]本發明的實施例2
[0030]取豬背部皮，經清洗、去毛后，留取厚度為0.3-0.5mm，寬度為l-5cm的中厚真皮皮片備用。
[0031]1、全程使用保護液對眼結膜組織進行保護，保護液配方為:RPM1-1640培養基，添加硫酸軟骨素50g/L，甘油200g/L，新霉素5mg/L，調pH值至7.2，滲透壓為400m0sm ；
[0032]2、將真皮皮片密封在盛有保護液的塑料袋中；
[0033]3、于600MPa高靜壓條件下，處理5次，每次時間為3分鐘；
[0034]4、將真皮取出后，置于含5%十二烷基肌氨酸鈉+4000U/ml DNA酶的保護液中，溫度為25°C，設定搖床速度為100轉/分鐘，處理3小時；
[0035]5、去垢劑與酶處理完畢后，取出結膜置于保護液中漂洗6小時。
[0036]本發明的實施例3
[0037]取豬背部皮，經清洗、去毛后，留取厚度為0.3-0.5mm，寬度為l-5cm的中厚真皮皮片備用。
[0038]1、全程使用保護液對眼結膜組織進行保護，保護液配方為:RPM1-1640培養基，添加硫酸軟骨素30g/L，透明質酸50g/L，新霉素5mg/L，調pH值至7.2，滲透壓為450m0sm ；
[0039]2、將真皮皮片密封在盛有保護液的塑料袋中；
[0040]3、于800MPa高靜壓條件下，處理5次，每次時間為2分鐘；
[0041 ] 4、將真皮取出后，置于含2%十二烷基磺酸鈉+2000U/ml DNA酶的保護液中，溫度為30°C，設定搖床速度為100轉/分鐘，處理5小時；
[0042]5、去垢劑與酶處理完畢后，取出結膜置于保護液中漂洗8小時。
[0043]以下對比結果均是按照實施例1的脫細胞步驟進行設置。
[0044]圖3和圖4分別是真皮組織脫細胞全程使用保護液和全程未使用保護液的結果比較。未使用保護液組全程使用滅菌注射用水代替保護液。通過圖3和圖4，可見使用保護液組脫細胞完全，未使用保護液(滅菌注射用水)組有明顯細胞核殘余。
[0045]圖5和圖6分別是使用去垢劑及未使用去垢劑的結果比較。如圖5和圖6所示，使用去垢劑組脫細胞完全，而未使用去垢劑組有明顯的細胞核殘余。
[0046]圖7和圖8分別是使用消化酶及未使用消化酶的結果比較。可見使用消化酶組細胞脫干凈，未使用消化酶組有大量細胞核著色。
[0047]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種新型的生物工程脫細胞真皮基質及其制備方法，具體步驟如下: (1)對豬的皮膚進行預處理后得到真皮層皮片； (2)使用包含一種或多種真皮結構保護劑的混合保護液； (3)采用高靜壓技術預分離真皮組織內的細胞； (4)采用復合核酸酶方法消化殘余細胞核； (5)利用去垢劑脫除松散破碎細胞片； (6)在真皮基質混合保護液進行漂洗去除多余的生物酶和細胞殘留； (7)獲得具有正常膠原纖維的三維結構及排列極性的帶有生物特性的脫細胞真皮層皮片。2.如權利要求1所述的制備方法，取豬背部皮，經清洗去毛后，留取厚度為0.3-0.5mm，寬度為l_5cm的中厚真皮皮片備用。3.如權利要求1所述的制備方法，混合保護液如包括RPM1-1640培養基、硫酸軟骨素、透明質酸、甘油、新霉素等及其組合，并需調節Ph值與滲透壓到適宜值。4.如權利要求1所述的制備方法，高靜壓技術包括不同的壓力、時間和頻率參數。5.如權利要求1所述的制備方法，復合核酸酶包括DNA酶、RNA酶、其他核酸酶及其組合。6.如權利要求1所述的制備方法，去垢劑包括聚乙二醇(PEG)、Plur0nic、十二烷基硫酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、樹膠、海藻酸鈉、環糊精、CHAPS中的一種或多種作為組合。7.如權利要求1所述的制備方法，與真皮基質混合保護液中漂洗的時間為3?8小時。8.如權利要求3所述的制備方法，其各成分組成:RPM1-1640培養基含，但不完全包括硫酸軟骨素的濃度為30-80g/L;透明質酸的濃度為10-50g/L;甘油100-500g/L;新霉素5-10mg/L，調節ph值為6.8-7.2之間，滲透壓為350-450m0sm。9.如權利要求4所述的制備方法，所述的高靜壓壓力條件為400-600MPa，高靜壓頻率為5?10次，每次為2?5分鐘；10.如權利要求5所述的制備方法，所述的復合核酸酶使用DN A酶時的濃度為2 O O O -4000U/ml，使用核酸酶時的濃度為2000-4000U/ml，DNA酶或核酸酶的脫細胞核時間為3-6小時，處理溫度為15-30 °C。11.如權利要求6所述的制備方法，其中所述去垢劑PluronicF68濃度為0.1_5%，十二烷基肌氨酸鈉的濃度為0.1-5% ,PEG 400的濃度為5-10%。去垢劑使用時間為1-8小時。
【文檔編號】A61L27/60GK105833353SQ201610297083
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月9日
【發明人】史真, 史偉云
【申請人】拜歐迪賽爾（北京）生物科技有限公司