多黏菌素E₁組合物及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：多黏菌素E₁組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，具體地涉及多黏菌素EJi合物，還涉及他們的制備方法和用途。
背景技術：
多黏菌素E(Colistin)是一個由多種組份組成的多肽類抗生素，主要由E1和E2組成(或稱為A或B)。在20世紀50年代，多黏菌素E就應用于臨床，主要用于革蘭氏陰性菌引起的感染，特別是由多重耐藥綠膿桿菌(P. aeruginosa)、鮑氏不動桿菌(AcinetcAacter baumannii)等引起感染的治療。臨床使用的多黏菌素E有兩種，一種是口服或局部使用的硫酸多黏菌素E(也稱硫酸黏菌素)，另一種是供注射用的多黏菌素E甲磺酸鈉 (ColistimethateSodium)。這兩種藥物都是多組份藥物，在硫酸多黏菌素E中，含有包括 E1, E2, E3等至少5種組份(參見歐洲藥典5. 0)，同樣在多黏菌素E甲磺酸鈉也至少含有多黏菌素E1甲磺酸鈉和多黏菌素氏甲磺酸鈉等5種組份。自上世紀80年代開始因高發的腎臟毒性和神經毒性，多黏菌素E(Colistin)的應用受到限制，并幾乎被臨床棄用。但是近年來，由于革蘭氏陰性菌耐藥株尤其是多耐藥菌株感染病例的出現以及新藥開發有限的情況下多黏菌素E(Colistin)再次引起了全球醫療界的重視。同樣如何提高多黏菌素E(Colistin)的抗菌活性、降低其毒性從而擴大臨床適用人群也成為了藥學研究者所面臨的技術難點。多黏菌素E的結構通式見式I
O
V- L-DAB L-Thr L-DAB L-DAB 一 L-DAB 今 X L-Leu 〈R3L-Thr - L-DAB - L-DAB ^
SVr2I R1DAB=2，4-二氨基丁酸式I
多粘菌素EX■ RlR2R3分子式分子量E1D-LeuCH3CH3Hc53t ΟθΝι Ο 31170E2D-LeuCH3HHC52I1155E3D-LeuHCH3HC52I^98Νι60 31155Ei-ID-IleCH3CH3Hc53tΙ ΟθΝ Ο 31170El-7M0AD-LeuHCH3CH3C53^IiooNuOn1170 眾所周知多組份藥物制劑的穩定性較難控制，特別是對于注射劑而言多組分藥物的理化穩定性、滲透壓、澄明度、酸堿度等方面因易受組分間相互作用，不容易形成穩定的藥物制劑，并且由于儲存、溫度、光照等因素多組份藥物制劑更容易出現變色、沉淀、分解等變化。此外，多組分藥物的有效性和潛在的安全性也存在一定的缺陷。另外，多組份藥物由于組份間的化學結構差異會導致它們在體內的藥代動力學行為的差異，增加了藥代動力學研究的難度，從而對設計安全的藥物劑量以及合理的給藥方式帶來技術障礙。因此，發明一種含有單一組份的多黏菌素E或者其衍生物的藥物組合物是非常必要的。當前，對多黏菌素E的組份分析已有成熟的、法定的分析方法，如美國藥典和歐洲藥典都收錄有HPLC法測定多黏菌素E。不過遺憾的是，盡管多黏菌素E甲磺酸鈉也被這些藥典所收錄，但是卻沒有相應HPLC法來分析該產品中各組份的組成，僅僅是用硅鎢酸顯色法來控制多黏菌素E甲磺酸鈉中不含有多黏菌素E。Li Jian等報道了使用強堿陰離子交換HPLC分析多黏菌素E甲磺酸鈉(參見Li J, Milne Rff, Nation RL,et al.Stability of Colistin and ColistinMethanesulfonate in Aqueous Media and Plasma as Determined byHigh-Performance Liquid Chromatography. ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTHERAPY ；2003,47 (4) : 1364-1370.)。雖然使用這種方法也分出7個色譜峰，但是并不能表征出這7個色譜峰分別是何種組份。同時，他們也報道了在水、磷酸鹽溶液或者血漿中多黏菌素E甲磺酸鈉能轉化為多黏菌素E， 但是并不能完全轉化，用了 72小時最高也只轉化了 79.6%。Li Jian等也報道使用硫酸酸水解的方法把大鼠血漿中的多黏菌素E甲磺酸鈉轉化為多黏菌素E，再反相HPLC法測定多黏菌素E的組成。(參見Li J，MilneRff, Nation RL, et al. Simple Method for Assaying Colistin Methanesulfonatein Plasma and Urine Using High-Performance Liquid Chromatography. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY ；2002, 46 (10) :3304-3307.)這種方法僅局限在較低濃度的多黏菌素E甲磺酸鈉(0.025mg/ml)并需要有血漿的存在才能轉化，而且也沒有證明能完全轉化為多黏菌
E ο

發明內容
本發明的目的在于提供一種多黏菌素E1組合物，該組合物中多黏菌素E1的含量大于等于80 %，優選大于等于90 %，更優選大于等于95 %。該組合物中除了多黏菌素E1之外，還含有少量的其它多粘菌素E，例如多黏菌素E2、多黏菌素&等。其中多黏菌素E1優選為硫酸多粘菌素E1或多粘菌素E1甲磺酸鈉。如無特別說明，本發明中所述多黏菌素E1是指多粘菌素E1或其衍生物，例如硫酸多粘菌素E1或多粘菌素E1甲磺酸鈉。本發明中所述多黏菌素E1組合物主要含有多粘菌素 E1,也包括E2, E3、Eh和Ewmoa等其它成分。本發明的另一個目的在于提供了多黏菌素E1組合物在制備治療革蘭氏陰性菌感染藥物中的用途。所述的革蘭氏陰性菌優選綠膿桿菌(P. aeruginosa)和鮑氏不動桿菌 (Acinetobacter baumannii)。本發明的再一個目的在于提供多黏菌素仏組合物的制備方法，該方法低污染、低能耗，工藝相對簡單、重現性好、生產水平高。本發明提供的制備方法包括如下步驟(a)將硫酸多粘菌素E溶解，上樣于反相層析介質；(b)用含有機溶劑的硫酸溶液洗脫，使用色譜分析，收集并合并含硫酸多粘菌素E1 的洗脫液；(C)取上步驟中合并的洗脫液，去除硫酸和/或有機溶劑；⑷干燥，即得硫酸多黏菌素EJi合物；(e)如需要，采用現有技術制備成多黏菌素E1甲磺酸鈉或其它衍生物。一種優選的制備方法包括如下步驟(a)將原料硫酸多粘菌素E加水溶解，上樣于已處理好的反相層析介質上；(b)用含有機溶劑的硫酸溶液，把不同成分的硫酸多黏菌素E 依次洗脫，使用色譜分析，收集并合并含硫酸多粘菌素E1的洗脫液；(c)取上步驟中合并的洗脫液，為去除硫酸和有機溶劑可以是先使用減壓蒸餾去除有機溶劑后，再使用膜分離技術去除硫酸，也可以僅使用膜分離去除有機溶劑和硫酸，若僅為去除有機溶劑可以單獨使用減壓蒸餾；(d)使用常規干燥技術，如噴霧干燥和真空干燥等，把上步得到的硫酸多黏菌素&溶液干燥，即得到硫酸多黏菌素EJi合物；(e)如需要，采用現有技術制備成多黏菌素 E1甲磺酸鈉或其它衍生物。本發明所提供的制備方法，其中步驟(a)中所說的“原料硫酸多粘菌素E”，是指工業級的硫酸多粘菌素E，也可以是質量符合歐洲藥典(5.0)或美國藥典09)所規定的硫酸多黏菌素E。硫酸多粘菌素E溶解后濃度可以為1-20%，優選為10-15%;步驟(a)中選用的反相層析介質可以為以二氧化硅(硅膠)或聚合物為骨架的反相層析介質，反相硅膠可由鏈長在C1-C3tl ((；丄8和C18最為常見)的直鏈烷烴基或其它疏水配基(如苯基或氰基)衍生而來，以聚合物為骨架的反相層析介質，通常指以聚苯乙烯/ 二乙烯苯或聚丙烯酸酯為骨架并鍵合苯基的反相層析介質；其中步驟(b)中使用的含有機溶劑的硫酸溶液是指以乙醇、甲醇或乙腈配制的硫酸溶液，優選用乙醇配制的硫酸溶液，有機溶劑的濃度一般在5-50%，優選15-30%。硫酸的濃度一般在0. 1-5 %，優選為0. 3-1 %，溶液的pH值控制在1. 0-5. 0，優選pH值控制在 2.0-3.0。洗脫方式可以是等度分段洗脫，也可以是梯度洗脫。該步驟中所述的色譜分析方法為歐洲藥典(5.0)頒布的硫酸多黏菌素E分析方法。步驟(c)中膜分離技術使用的膜指納濾膜，其截流分子量在200-1000，優選截流分子量在400-800的納濾膜。本發明所使用的納濾膜可以是有機材料膜，如有機纖維素膜、 聚砜膜和聚乙烯醇膜等，也可以是各種無機材料膜，如陶瓷膜、黏土膜和金屬膜等，優選使用纖維素膜和聚砜膜。步驟(d)中所說的常規干燥技術為生化產品常用的干燥技術如噴霧干燥、真空干燥及低溫冷凍干燥等。步驟(e)中所述的“現有技術”是指已經公開的由起始原料多黏菌素E硫酸鹽制備多黏菌素E甲磺酸鈉的所有公知技術。例如申請號為200810020478. 5的中國發明專利所公開的技術內容。通過生物效價測定發現本發明提供的多黏菌素E1組合物的生物活性均比其相對應的多組份生物活性高。由此本領域技術人員可以推斷出當在臨床上使用相同生物活性單位時，本發明提供的藥物組合物其用量(用質量表示)必然減少，因此其毒性也將明顯降低。本發明人通過實驗也證實了這一推斷。多黏菌素E1組合物在藥代動力學的研究方面也具有突出的優勢，為設計安全的藥物劑量以及合理給藥方式提供了有利條件。本發明所采用的生物效價測定方法為精密稱取已在60°C減壓干燥3小時的樣品和標準品適量，標準品購置于美國藥典委員會，批號H1D234，加滅菌水溶解并定量制成濃度約10mg/ml的溶液，然后用滅菌緩沖液[pH6. O的磷酸緩沖液(取磷酸氫二鉀2. Og與磷酸二氫鉀8. Og，加水溶解并定容至IOOOml)]混勻，用18mol/L的磷酸或者lOmol/L的氫氧化鉀調節pH為6. 0士0. 05，濾過，115°C滅菌30分鐘。稀釋至lmg/ml，按照抗生素微生物檢定法(中國藥典2005年版二部附錄XI A第一法)測定。試驗菌為支氣管炎博德特菌 (Bordetellabronchis印tica，ATCC4617)。生物效價單位以每毫克樣品含有多少微克的多黏菌素E計算，表示為μ g/mg。


圖1 硫酸多黏菌素E1HPLC分析結果；
具體實施例方式下面用具體實施例來進一步說明本發明的內容，但并不以任何方式意味著對本發明進行限制。實施例1 硫酸多黏菌素E1組合物的制備稱取工業級硫酸多黏菌素E適量，加水溶解，制成每Iml含IOOmg的溶液，上色譜柱分離，色譜條件如下色譜柱CWSunFire Prep OBD(IOym) ； 19X 150mm，購自美國 WATERS 公司柱體積 (CV) 42. 5ml流速10. Oml/min洗脫條件用含30%乙醇的硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸調溶液的pH值為 2.3。)等度洗脫30CV。上樣量50ml收集10ml/管收集樣品的分析及處理用分析型HPLC分析(色譜條件參見歐洲藥典5. 0中關于多黏菌素E的純度測定)，合并純度在95 %以上的硫酸多黏菌素E1洗脫液，然后進行減壓蒸餾除去乙醇后，低溫冷凍干燥即得。結果得到1.5克硫酸多黏菌素EJi合物，它們的HPLC分析圖見圖1，其中硫酸多黏菌素E1的含量在95%以上。實施例2 硫酸多黏菌素E1組合物的制備稱取工業級硫酸多黏菌素E適量，加水溶解，制成每Iml含120mg的溶液，上色譜柱分離，色譜條件如下層析填料聚苯乙烯/ 二乙烯苯為骨架并鍵合苯基，型號為NM-100，產自蘇州納微生物科技有限公司柱規格45 X 400mm，柱體積(CV):635.9ml流速30. Oml/min洗脫條件先用含25%的乙醇硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸調溶液的pH值為 2. 3。)洗脫20CV，再用30%的乙醇硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸調溶液的pH值為2. 5。) 洗脫20CV。
上樣量500ml收集100ml/管收集樣品的分析及處理用分析型HPLC分析，合并純度在90%以上的硫酸多黏菌素E1洗脫液，然后進行減壓蒸餾除去乙醇后，真空干燥即得。結果得到M克硫酸多黏菌素E1組合物，其中硫酸多黏菌素E1的含量在90%以上。實施例3 硫酸多黏菌素E1組合物的制備稱取工業級硫酸多黏菌素E適量，加水溶解，制成每Iml含120mg的溶液，上色譜柱分離，色譜條件如下層析填料聚苯乙烯/ 二乙烯苯為骨架并鍵合苯基，型號為NM-100，產自蘇州納微生物科技有限公司柱規格25X 2OOcm,柱體積(CV)98. 13L流速200. Oml/min洗脫條件先用含23%的乙醇硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸調溶液的pH值為 2. 3。)洗脫^CV,再用30%的乙醇硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸調溶液的pH值為2. 5。) 洗脫25CV。上樣量IOOL檢測波長215nm收集10L/管收集樣品的分析及處理用分析型HPLC分析，合并純度在80%以上的硫酸多黏菌素E1洗脫液，然后進行減壓蒸餾除去乙醇后，納濾膜過濾，去除部分硫酸，調整硫酸的含量占16-18%，即得。結果得到5. 8公斤硫酸多黏菌素E1組合物，其中硫酸多黏菌素E1的含量在80% 以上。實施例4 多黏菌素E1甲磺酸鈉組合物的制備稱取IOOg實施例3方法制備的硫酸多黏菌素E1，加水溶解并定容至500ml，然后加甲醛溶液50ml，攪拌并用lOmol/L NaOH溶液調節pH至7. 0，維持反應30min后，向其中加入40%的亞硫酸氫鈉溶液200ml，然后再用NaOH溶液調節pH至7，并在攪拌下反應IOh后停止反應。取此反應液，用截流分子量為3000的超濾膜(為美國MILLIP0RE公司的產品，為醋酸纖維素膜)超濾至約50ml，然后加水至約500ml，再超濾濃縮至50ml，如此反復5次，得超濾截留液約50ml。在整個反應和超濾期間控制溫度在20 25°C。取超濾截留液，用低溫冷凍干燥法，進行樣品的干燥，得到多黏菌素E1甲磺酸鈉組合物63g，生物效價為590yg/ mg0稱取多黏菌素E2甲磺酸鈉適量，加水溶解，制成每Iml含5mg的溶液。取此溶液 5ml，用0. 5mol/L的硫酸溶液調節pH值為1. 5，然后加水稀釋，并定容至10ml，制成2. 5mg/ ml的溶液。取此溶液于玻璃安瓿中，熔封后置于115°C烤箱中，放置30min，然后取出、放涼， 用HPLC法測定硫酸多黏菌素氏的含量，進而換算得到多黏菌素氏甲磺酸鈉的含量為83%。實施例5 硫酸多黏菌素E1組合物的制備稱取硫酸多黏菌素E適量，加水溶解，制成每Iml含IOOmg的溶液，上色譜柱分離，色譜條件如下色譜柱CWSunFire Prep OBD(IOym) ； 19X 150mm，購自美國 WATERS 公司柱體積(CV)42. 5ml流速10. Oml/min流動相含30%的乙醇硫酸稀溶液(用0. 05mol/L硫酸調溶液的pH值為2. 3。)上樣量10ml檢測波長215nm收集10ml/管收集樣品的分析及處理用分析型HPLC分析，合并純度在95%的以上多黏菌素E1 洗脫液，然后進行減壓蒸餾除去乙醇后，低溫冷凍干燥，即得。實施例6 多黏菌素E1甲磺酸鈉制備稱取1. Og硫酸多黏菌素E1 (多黏菌素E1的含量為83% )，加水溶解并定容至5ml， 然后加甲醛溶液0. 5ml，攪拌并用lmol/L NaOH溶液調節pH至7. 0，維持反應30min后，向其中加入40%的亞硫酸氫鈉溶液anl，然后再用NaOH溶液調節pH至7，并在攪拌下反應IOh 后停止反應。取此反應液，用截流分子量為3000的超濾膜(為美國MILLIP0RE公司的產品， 為醋酸纖維素膜)超濾至約:3ml，然后加水至約20ml，再超濾濃縮至:3ml，如此反復5次，得超濾截留液約5ml。在整個反應和超濾期間控制溫度在20 25°C。取超濾截留液，用低溫冷凍干燥法，進行樣品的干燥，得到多黏菌素E1甲磺酸鈉樣品0. Sg。實施例7 硫酸多粘菌素E1組合物與硫酸多粘菌素E對大鼠毒性的比較1.實驗材料1. 1藥品與試劑氯化鈉注射液500ml :4. 5g，南京正大天晴制藥有限公司，1003022 ；硫酸多粘菌素E1組合物采用實施例3方法制備。硫酸多粘菌素E (質量符合歐洲藥典(5. 0))硫酸多粘菌素E1組合物、硫酸多粘菌素E 用生理鹽水溶解和稀釋，調節PH中性， 在制備后的30min內使用完。1. 2實驗動物SD大鼠雄性，180-200g,上海必凱西普爾實驗動物有限公司， SCXK (滬)2008-0016 ；1. 3實驗儀器全自動生化分析儀歐霸XL-300 ；天平QE-400 ；2.實驗方法選用180_220g雄性大鼠隨機分成3組，每組6只對照組、硫酸多粘菌素仏組(SC 20mg/kgX2/d)、硫酸多粘菌素E組(SC 20mg/kgX2/d)。按10mg/ml皮下給藥，一日兩次， 連續2天，對照組給予生理鹽水。取血，收集尿液，測定生化及尿蛋白含量。麻醉處死后取腎，常規固定后作病理檢查，組織學形態按照下列方案進行評分O分無可見異常。1分近端曲小管囊下近端部分的刷狀緣有最低程度的損害。2分近端曲小管近端部分的刷狀緣和細胞有明顯的損害。一些遠端曲小管有早期的退化。3分近端曲小管的近端部分管型。在近端曲小管的兩端部分有一些細胞呈碘酸西佛氏染色陽性的顆粒。在一些遠端曲小管有明顯的細胞退化。4分如同3，但是變化部分也涉及到近端曲小管的兩端。5分近端曲小管近端部分和遠端曲小管幾乎完全或者完全退化。近端曲小管的遠端部分有相當大的損害。6分皮質完全退化。3.實驗結果綜合死亡率、腎臟病理檢查及生化指標結果提示硫酸多粘菌素仏毒性明顯低于硫酸多粘菌素E (多組分的組合物)。表一、對血液生化的影響
權利要求
1.一種多黏菌素E1組合物，該組合物中多黏菌素E1的含量大于等于80%，優選大于等于90 %，更優選大于等于95 %。
2.權利要求1所述的組合物，其特征在于其中多黏菌素E1優選為硫酸多粘菌素E1或多粘菌素E1甲磺酸鈉。
3.一種制備權利要求1、2所述的組合物的方法，特征在于包括如下步驟(a)將硫酸多粘菌素E溶解，上樣于反相層析介質；(b)用含有機溶劑的硫酸溶液洗脫，使用色譜分析，收集并合并含硫酸多粘菌素E1的洗脫液；(c)取上步驟中合并的洗脫液，去除硫酸和/或有機溶劑；(d)干燥，即得硫酸多黏菌素E1組合物；(e)如需要，采用現有技術制備成多黏菌素E1 甲磺酸鈉或其它衍生物。
4.權利要求3所述的制備方法，特征在于包括如下步驟(a)將原料硫酸多粘菌素E加水溶解，上樣于已處理好的反相層析介質上；(b)用含有機溶劑的硫酸溶液，把不同成分的硫酸多黏菌素E依次洗脫，使用色譜分析，收集并合并含硫酸多粘菌素E1的洗脫液；(c)取上步驟中合并的洗脫液，為去除硫酸和有機溶劑可以是先使用減壓蒸餾去除有機溶劑后， 再使用膜分離技術去除硫酸，也可以僅使用膜分離去除有機溶劑和硫酸，若僅為去除有機溶劑可以單獨使用減壓蒸餾；(d)使用常規干燥技術，如噴霧干燥和真空干燥等，把上步得到的硫酸多黏菌素&溶液干燥，即得到硫酸多黏菌素EJi合物；(e)如需要，采用現有技術制備成多黏菌素E1甲磺酸鈉或其它衍生物。
5.權利要求3、4所述的制備方法，特征在于步驟(a)中硫酸多粘菌素E溶解后濃度可以為1-20%，優選為10-15%。
6.權利要求3、4所述的制備方法，特征在于步驟(b)中使用的含有機溶劑的硫酸溶液是指以乙醇、甲醇或乙腈配制的硫酸溶液，優選用乙醇配制的硫酸溶液，有機溶劑的濃度一般在5-50 %，優選15-30 %。硫酸的濃度一般在0. 1-5 %，優選為0. 3-1 %，溶液的pH值控制在1. 0-5. 0，優選pH值控制在2. 0-3. 0。
7.權利要求3、4所述的制備方法，特征在于步驟(c)中膜分離技術使用的膜指納濾膜， 其截流分子量在200-1000，優選截流分子量在400-800的納濾膜。
8.權利要求1、2所述的組合物在制備治療革蘭氏陰性菌感染藥物中的用途。
9.權利要求8所述的用途，其中革蘭氏陰性菌優選綠膿桿菌和鮑氏不動桿菌。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及多黏菌素E1組合物及其制備方法和用途。所述組合物主要含有多粘菌素E1，也包括E2、E3、E1-1和E1-7MOA等其它成分。本發明提供的用途是指該組合物在制備治療革蘭氏陰性菌感染藥物中的用途。
文檔編號A61P31/04GK102190712SQ20111003291
公開日2011年9月21日 申請日期2011年1月24日 優先權日2010年1月22日
發明者馮軍, 吳勇, 張喜全, 徐宏江, 薛春佳, 趙偉, 路建光, 馬宇旋 申請人:上海醫藥工業研究院, 江蘇正大天晴藥業股份有限公司