淫羊藿苷抗缺氧新用途的制作方法

專利名稱：淫羊藿苷抗缺氧新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及淫羊藿苷抗缺氧作用的應用，具體涉及淫羊藿苷在抗缺氧誘導的血管內皮細胞損傷的保護作用。
背景技術：
缺氧是特殊環境生理、臨床等領域經常涉及的病理生理現象。作為ー種應激因素，缺氧可份致呼吸系統、心血管系統、神經系統及內分泌系統的功能損傷。其中，神經系統對缺氧尤為敏感，其損傷機制比較復雜。臨床上常用的抗缺血缺氧的西藥主要有鈣通道阻滯劑、自由基清除劑和ー些中樞抑制藥，這此藥物雖然具有較明顯的作用，但是這此藥物毒副作用較大。近年來，中藥在抗缺氧損傷方而的作用逐漸被人們所關注，具有良好的應用和開發前景。
淫羊藿是ー種傳統的補益中藥，為小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim.)、箭葉淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimediumpubescens Maxim.)、或朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanumNakai)的干燥葉。性辛、甘，溫。歸肝、腎經。具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等多種功效。初步確定淫羊藿總黃酮在給藥劑量900mg/ (kg · d)時,對常壓密閉缺氧條件下小鼠，可延長存活時間，減輕腦水腫及肺水腫的程度。(張汝學，淫羊藿總黃酮對缺氧模型小鼠的抗缺氧作用，中藥材，2009，32 (11)，1737)淫羊藿總黃酮給藥劑量大，而且組成成分復雜，作用機理不明確，不適合患者長期服用。

發明內容
本發明要解決的技術問題是淫羊藿苷對血管缺氧損傷的保護，主要是對淫羊藿苷在缺氧誘導的血管內皮細胞損傷的保護作用。所述藥物可通過ロ服、經皮或靜脈途徑給藥；所述藥物以ロ服劑、注射劑及局部給藥制劑形式存在；所述ロ服劑包括膠囊劑、ロ服液、片劑、顆粒劑；所述注射劑包括注射液、注射用凍干粉針劑型；局部給藥制劑包括貼劑。本發明人通過系列實驗證實了淫羊藿苷具有顯著的抗缺氧作用，尤其抑制缺氧引起的血管內皮細胞減少；尤其是抑制缺氧引起的血管內皮細胞凋亡；尤其是抑制缺氧引起的LDH活力降低；尤其是抑制缺氧條件下MDA產生；尤其是提高缺氧條件下SOD活力。本發明人采用實驗證實淫羊藿苷能抑制缺氧引起的血管內皮細胞減少，降低LDH活力，并抑制缺氧條件下MDA生成，提高SOD活力；缺氧能誘導血管內皮細胞凋亡，表現為細胞核濃縮，沿核膜排列成塊狀，DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示典型“梯形條帯”，流式細胞儀分析呈現典型凋亡亞二倍體峰。淫羊藿苷能顯著抑制缺氧誘導的內皮細胞凋亡。結果證實，本發明的淫羊藿苷具有顯著的保護缺氧誘導的血管內皮細胞損傷的作用，其作用機制與抗脂質過氧物產生、提高SOD活力以及抗細胞凋亡有夫。


圖I是熒光顯微鏡下血管內皮細胞的細胞核變化圖(Nucleus changes of VECsunder fluorescent microscopy)圖2是衰老血管內皮細胞的超微結構圖(Ultrastructure of senescent VECs)圖3 是流式細胞儀檢測亞 Gl 峰圖(Sub-Gl peak was detected by flowcytometry)a)對照組(a) control)b)缺氧的細胞顯不典型的亞 Gl 峰(b)hypoxia cells displayed a typicalsub-Gl peak)c) 35mol/L淫羊藿苷處理的血管內皮細胞組(c) VECs treated with ICA 35mol/L)d) 70mol/L淫羊藿苷處理的血管內皮細胞組(d) VECs treated with ICA 70mol/L)e) 150mol/L淫羊藿苷處理的血管內皮細胞組(e) VECs treated with ICA150mol/L)圖4 是 DNA 片段的瓊脂糖凝膠電泳圖(Agarose gel electrophoresis of DNAfragmentation)I.對照組(I. control)2.缺氧模型組(2. hypoxia)3. 35mol/L淫羊藿苷處理的血管內皮細胞組(3. VECs treated with ICA 35mol/L)4. 70mol/L淫羊藿苷處理的血管內皮細胞組(4. VECs treated with ICA 70mol/L)5. 150mol/L淫羊藿苷處理的血管內皮細胞組(5. VECs treated with ICA150mol/L)
具體實施例方式為了便于理解淫羊藿苷的抗炎效果，本發明進行了如下藥效學實驗實施例I :淫羊藿苷對缺氧誘導血管內皮細胞損傷的保護作用一、實驗材料與方法I、材料人臍靜內皮細胞株ECV-304引自美國組織培養庫(ATCC CRI-1998)。淫羊藿苷由北大世佳研究中心提供。DMEM培養基，胰蛋白酶，四甲基偶氮唑藍(MTT)購于美國GIBCO公司。胎牛血清為天津正江高科技有限公司產品。ニ甲基亞砜(DMSO)購于Amresco公司。RNA酶，PI為Sigma公司產品。培養胞熒光染色凋亡顯示試劑盒為北京威格拉斯有 限公司產品。缺氧裝置系統為法國BioM e rieux sa公司產品。酶標儀(Multiskan MK3)購于上海雷勃分析儀器有限公司。紫外可見分光光度計(UV-2501PC)為日本島津公司產品。流式細胞儀為Becton-Dickinson公司產品。焚光顯微鏡為Olympus公司產品。2實驗方法2. I內皮細胞培養ECV-304細胞培養于DMEM培養液中，其中胎牛血清10%，青霉素100U/ml鏈霉素100g/ml 37°C,5% CO2培養箱中培養。2. 2MTT法檢測ICA對血管內皮細胞毒性試驗參照文獻[6]，(Kitazono M，iakebayasm Y, Ishitsuka K, et al. Prevention of hypoxia—inducedapoptos is bythe angiogenic thymidine phosphorylase. Biochem Biophys ResCommun. 1998 ；253(3)797-803)取ECV-304細胞5X 103，接種于96孔細胞培養板內，用DMEM培養液配制成不同濃度的ICA藥液，實驗時棄去細胞培養液，分別向孔中加入不同濃度的ICA藥液200L，每個濃度組設重復孔6個，空白對照組每孔加入200L不含ICA的DMEM培養液。37°C CO2培養箱培養72h。終止培養前每孔加入MTT(最終濃度O. 5mg/ml) ,37°C,5% CO2孵育4h。棄去上清液，每孔內加入DMSO 2001，靜置lOmin。在酶標儀570nm下測定各孔吸光度。2. 3建立體外培養的內皮細胞缺氧模型采用法國BioM e r ieux sa公司缺氧置系統。細胞在缺氧條件下培養48小吋。血氣分析表明常氧和缺氧細胞培養液中氧分壓分別為206mmHg和18. 3mmHg,達到所需要的缺氧條件。 2. 4實驗分組正常細胞培養組，缺氧模型組，ICA 35，70，140mol/L組.2. 5MTT法檢測ICA對缺氧損傷的內皮細胞活性的影響取6X IO3細胞，培養24小時后，將缺氧模型組細胞及ICA各濃度組細胞置于缺氧罐中培養48小吋。每組設8個重復孔。缺氧結束后，MTT法檢測各組細胞吸光度值。2. 6MDA含量、SOD活力測定參照試劑盒說明書并略作改動，O. 25%消化6X IO5細胞，用PBS洗滌2次。將細胞充分裂解后離心，取IOOL細胞上清按試劑盒操作。2. 7LDH活力的測定將細胞接種于24孔培養板，取細胞培養上清，按試劑盒操作。2. 8細胞凋亡的熒光Hoechst33342染色(I)用無血清DMEM洗滌2次。(2)加入 Hoechst33342 染液，37。C孵育 lOmin。(3)紫外光激發，熒光顯微鏡觀察凋亡細胞并拍片。2. 9透射電鏡觀察(I)將約I X IO7細胞輕輕刮下，1000 Xg離心IOmin棄上清；(2)PBS洗細胞2次，小心棄去上清，輕輕加入0.25%戊ニ醛固定細胞團。可放置
4°C保存。(3)經脫水、包埋、超薄切片后透射電鏡下觀察。2. 10流式細胞儀分析(I)制備細胞樣品，約收集I X IO6個細胞，用0.25%胰酶/0.04% EDTA消化細胞，細胞懸液洗滌2次，充分吹散混勻。(2)用 500L PBS 充分混懸。(3)在15ml離心管中加入5ml 70%冷こ醇，_20°C預冷。(4)將細胞懸液逐滴滴入70%冷こ醇中，4°C固定過夜。(5)離心棄去こ醇后，留400L加入RNase A(終濃度50g/ml)，37°C溫育30min，碘化丙唳(propidium iodide, PI,終濃度為 50g/ml), 4°C避光反應 30min。(6)300目尼龍網膜過濾后的細胞即可用于流式細胞測試用。2. IIDNA瓊脂糖凝膠電泳(I)收集IO7細胞，PBS洗滌兩次。
(2)加入細胞裂解液(IOmM Tris-HCl pH 8. O, IOOmM NaCl,O. 5% SDS,25mM EDTApH 8. 0,0. 5mg/ml 蛋白酶 Κ)0· 5mL，37°C作用 12h。(3) RNA 酶儲存液(10mg/mL) 20L, 50°C作用 lh。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 I)，充分顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，12，OOOr. HiirT1離心10分鐘，吸取上清液，轉移入另ー EP管中。2倍體積的無水こ醇，-20°C放置4h。12，OOOr. mirT1離心10分鐘，棄上清，取沉淀。用75%的こ醇洗滌沉淀一次，12，OOOr. mirT1離心10分鐘，棄上清。將沉淀在空氣中風干，溶于20LTE緩沖液中，再加入RNA酶儲液5L，37°C水浴作用 Ih.電泳。電泳條件1. 5%瓊脂糖凝膠，50V電壓電泳3h。2. 12統計學分析所有數據以;±ぶ表示，以t檢驗進行顯著性分析ニ、實驗結果I、ICA對內皮細胞的體外毒性實驗研究經MTT法檢測，當ICA最高濃度為140mol/l時，與空白對照組相比，細胞抑制率為
I.2%，表明對細胞無毒性作用，可用于后續試驗。2、ICA對缺氧損傷的內皮細胞活性、MDA含量、SOD活性、釋放LDH的影響結果見表1，MTT法可反映細胞存活的數目。缺氧可引起內皮細胞減少，與正常對照組比較差異具有顯著性(P < O. 01)，ICA能抑制缺氧引起的細胞減少，當濃度為35mol/L時即發揮作用(P < O. 05)，且隨ICA濃度增加，細胞抑制率逐漸下降，并呈現一定的濃度依賴關系；缺氧能顯著加劇細胞膜的脂質過氧化反應，與正常對照組比較，缺氧損傷的內皮細胞中MDA含量明顯升高(P < O. 01)。當ICA的濃度為140mol/L吋，能顯著抑制缺氧引起的MDA升高(P<0.01)。35mol/L、70mol/L ICA與缺氧模型組比較，有下降趨勢，但經統計學分析，差異不具有顯著性；缺氧模型組細胞SOD活性明顯下降，與正常對照組比較，差異具有顯著性(P
<O. 01)。加入不同濃度的ICA可劑量依賴地抑制SOD活性降低，當ICA濃度為70mol/L時與缺氧模型組比較差異具有顯著性(P < O. 05)。表明ICA能通過提高內在的抗氧化酶活性，保護細胞膜免受自由基的攻擊；與正常對照組比較，缺氧模型組細胞上清中LDH活力明顯升高，差異具有顯著性(P < O. 01)。ICA各劑量組均能顯著減少缺氧引起的LDH釋放(P
<O. 01)，且表現出明顯的劑量依賴效應。表IICA對缺氧損傷的內皮細胞活性、MDA含量、SOD活力及釋放LDH的影響
注與正常對照組比較，*Ρ < O. 05，林P < O. 01 ;與缺氧模型組比較，ΛΡ < O. 05，ΔΔΡ < O. 01，3、ICA對缺氧誘導血管內皮細胞凋亡的影響3. lHochest33342熒光染色觀察細胞核變化Hoechest33342是ー種DNA親和染料，能特異地與DNA螺旋小溝富含AT重復序列結合。經熒光顯微鏡觀察，缺氧模型組細胞核發生染色質凝聚，核邊緣化，呈現明亮的熒光，偶見有核碎裂現象，有游離的凋亡小體出現(見圖Ib)，正常細胞核呈現彌散均勻的藍色熒光(見圖Ia)。與模型組相比較，隨藥物濃度的升高，高熒光強度的細胞逐漸減少，當ICA濃度為140mol/L時，部分細胞呈均勻彌散的熒光，或僅表現為核玻珠化或波紋狀等早期凋亡的變化(見圖lc-e)。3. 2細胞核超微結構變化細胞核超微結構變化是凋亡細胞最富特征性的改變。與正常細胞對照組相比，缺氧模型組細胞出現典型的凋亡形態學變化，包括染色質高度濃縮，沿核膜排列形成大小不同的塊狀(見圖2b)。而正常組細胞核膜光滑平整，染色質分布均勻(見圖2a)。與缺氧模型組比較，ICA各劑量組組細胞超微結構逐漸改善，以140mol/L ICA組細胞最為明顯(見圖 2c_e)。3. 3流式細胞儀分析凋亡的標準特征之ー是基因組DNA以核小體為單位的斷裂，除用常規的瓊脂糖凝膠電泳檢測外，可用凋亡細胞核PI標記后的流式細胞計量術來定量分析。流式細胞計量術結果可顯示凋亡細胞在細胞循環圖直方圖的亞二倍體區出現。分析亞二倍體峰的比例能夠表達細胞死亡的程度，但不能區分死亡的類型(凋亡與非凋亡)。PI是ー種陽離子染料，胞膜完整的細胞可對其拒染，只對晚期凋亡及壞死的細胞著色，細胞核呈現紅色熒光。ICA對缺氧誘導內皮細胞凋亡的影響正常對照組細胞DNA大多處于G0/G1期(見圖3a)，缺氧模型組細胞DNA在G0/G1前出現明顯的凋亡亞二倍體峰(見圖3b)，給予ICA作用的細胞凋亡峰明顯減小，說明DNA斷裂減輕。正常細胞平均凋亡率為1.41% ;缺氧組細胞平均凋亡率為38. 22%，與正常對照組比較有顯著性差異。ICA 35，70，140mol/L組細胞凋亡率分別為13. 60%，9. 66%和4. 55%，與缺氧模型組比較，均有顯著性差異(P < O. 01)。可見ICA能顯著抑制由缺氧誘導的血管內皮細胞凋亡。(見圖3c，3d，3e)4DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測
細胞發生凋亡吋，由于內源性核酸內切酶被激活，可選擇性降解核小體間DNA，形成大小不一的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現規則的、間隔180-200bp的DNA梯帶，SP“DNA ladder”。結果可見，缺氧模型組細胞在瓊脂糖凝膠電泳上可見明顯的DNA梯形條帶，35,70mol/L組細胞有不規律的DNA斷裂，140mol/L未見明顯DNA的斷裂。進ー步表明，缺氧可誘導細胞出現凋亡，而ICA能顯著抑制缺氧引起的細胞凋亡，并呈現劑量依賴性。本實驗發現，缺氧使內皮細胞的甲肷形成量減少，而缺氧的同時加入ICA可促進甲肷的形成，說明淫羊藿苷具有抗缺氧誘導的內皮細胞損傷的作用，可能與保護線粒體的功能有關。實驗證實淫羊藿苷能抑制缺氧引起的血管內皮細胞減少，降低LDH活力，并抑制缺氧條件下MDA生成，提高SOD活力；缺氧能誘導血管內皮細胞凋亡，表現為細胞核濃縮，沿核膜排列成塊狀，DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示典型“梯形條帶”，流式細胞儀分析呈現典型凋亡亞二倍體峰。淫羊藿苷能顯著抑制缺氧誘導的內皮細胞凋亡。可見，淫羊藿苷具有顯著的抗缺氧作用，尤其抑制缺氧引起的血管內皮細胞減少； 尤其是抑制缺氧引起的血管內皮細胞凋亡；尤其是抑制缺氧引起的LDH活力降低；尤其是抑制缺氧條件下MDA產生；尤其是提高缺氧條件下SOD活力。
權利要求
1.淫羊藿苷抗缺氧作用的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于抑制缺氧引起的血管內皮細胞減少。
3.根據權利要求I所述的應用，其特征在于抑制缺氧引起的血管內皮細胞凋亡。
4.根據權利要求I所述的應用，其特征在于抑制缺氧引起的LDH活力降低。
5.根據權利要求I所述的應用，其特征在于抑制缺氧條件下MDA產生。
6.根據權利要求I所述的應用，其特征在于提高缺氧條件下SOD活力。
7.根據權利要求1-6任一所述應用，其特征在于所述藥物是由有效量的淫羊藿苷和藥學上可接受的載體組成，載體包括ロ服制劑載體、注射制劑載體、局部給藥制劑載體。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述藥物以ロ服劑、注射劑及局部給藥制劑形式存在，ロ服劑包括膠囊劑、ロ服液、丸剤、片劑、顆粒劑；所述注射劑包括注射液、注射用凍干粉針劑；局部給藥制劑包括霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑。
全文摘要
本發明涉及一種淫羊藿苷抗缺氧的新應用。本發明的試驗證明，該化合物具有顯著的抗缺氧誘導的抗缺氧損傷的保護作用。本發明同時還提供了淫羊藿苷用于制備抗缺氧作用的藥物制劑。
文檔編號A61P39/00GK102670635SQ201110056638
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月10日 優先權日2011年3月10日
發明者周亞偉 申請人:周亞偉