冷藏溫度穩定的流感疫苗組合物的制作方法

專利名稱：冷藏溫度穩定的流感疫苗組合物的制作方法
冷藏溫度穩定的流感疫苗組合物本發明專利申請是國際申請日為2005年10月4日、國際申請號為PCT/ US2005/035614、進入中國國家階段的申請號為200580039793. 7、發明名稱為“冷藏溫度穩定的流感疫苗組合物”的發明專利申請的分案申請。
背景技術：
抗流感的各種毒株和演變毒株的疫苗對于社區健康和經濟上都至關重要，因為每年有許多個體感染不同毒株和不同類型的流感病毒。特別是嬰兒、老年人、那些衛生保健不足和免疫受損的人處于因這種感染而死亡的風險中。流感感染問題因新型流感毒株易于演變而愈加復雜，因此需要不斷制造新型疫苗。過去50年間生產了許多對不同流感病毒能產生特異性免疫保護應答的疫苗，包括，例如全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒活病毒疫苗。然而，盡管這些疫苗類型的合適制劑能產生全身性免疫應答，但減毒活病毒疫苗具有能刺激呼吸道局部粘膜免疫力的優點。因此，若能快速且經濟地生產易于儲存/運輸的含減毒活病毒的疫苗非常理想。疫苗若能在冷藏溫度(例如，2-8°C )儲存/運輸則更加理想。迄今為止，在美國可商業購得的所有流感疫苗是在雞胚蛋中增殖。雖然流感病毒在雞蛋中生長良好，但疫苗的產量取決于這種雞蛋的可利用量。因為必須組織(這種)雞蛋的供應，和在下一流感爆發季前數月選擇可用于疫苗生產的毒株，所以此方法的靈活性有限，常導致生產和銷售滯后和短缺。因此，非常需要能提高所生產疫苗穩定性(例如，在冷藏溫度)的方法，例如這種方法能防止疫苗儲存時變質，否則可能需要重新生產等。近年來也開發了通過細胞培養制備流感疫苗的系統(參見，例如Furminger.， “疫苗生產”(Vaccine Production)，刊于 Nicholson 等編，《流感教材》(Textbook of hfluenza)，第324-332頁；Merten等，(1996)，“在用于疫苗制備的細胞培養物中生產流感疫苗，，(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation), 刊于Cohen和Shafferman編，《疫苗設計和生產的新方案》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines), H 141-151頁)，因此，也非常需要能在這些系統中提高疫苗組合物穩定性(例如，在冷藏溫度儲存/運輸)的任何方法。本發明人與同事在制備流感病毒疫苗生產中做了大量工作；參見，例如2002年4 月26日提交的美國專利申請號60/375，675 ；2003年4月25日提交的PCT/US03/127^ ； 2003 年 4 月 25 日提交的 10/423，828 和 2005 年 5 月 20 日提交的 PCT/US05/017734。本發明提供，例如在冷藏溫度(例如4°C )穩定的疫苗組合物和生產該疫苗組合物的方法。本發明的各方面內容適用于常規的雞蛋和新型細胞培養物的疫苗生產方法(也適用于組合系統)，包括可從下文明白的許多其它優點。發明概述本發明提供在4°C到8°C溫度范圍基本穩定的液體疫苗制劑。這些和其它液體制劑是本發明的具體實施方案，在本文中稱為，例如“本發明疫苗制劑”、“冷藏穩定的疫苗制劑”、“本發明液體制劑”、“本發明制劑”、“冷藏溫度穩定(RTQ的本發明制劑，，或簡單稱為 “本發明組合物”或“本發明病毒組合物”。
本發明提供在4°C到8°C溫度范圍基本穩定的液體疫苗制劑。在本發明的一個具體實施方案中，本發明液體疫苗制劑在2°C到8°C溫度范圍內或在4°C，在3個月，或4個月， 或5個月，或6個月，或9個月，或12個月，或18個月，或M個月，或36個月或48個月期間基本穩定，即在所述時間段終點的效力喪失(例如，流感病毒效力喪失)可以接受，例如效力喪失介于0. 5-1. Olog,或效力(喪失)低于0. 51og,或低于1. Olog0一個實施方案提供含有流感活病毒的本發明冷藏穩定的疫苗制劑。例如，本發明制劑包括以下一種或多種減毒流感病毒，冷適應(cold-adapted)流感病毒、溫度敏感型流感病毒、減毒的冷適應溫度敏感型流感病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。在一個實施方案中，本發明液體疫苗制劑包含兩種甲型流感病毒毒株和一種乙型流感病毒毒株。或者，本發明制劑可包含其它活病毒，例如副黏病毒(例如，RSV、麻疹病毒、腮腺炎病毒、仙臺病毒、新城疫病毒)和副流感病毒。本發明還提供含有本發明制劑的免疫原性組合物。本發明還提供含有本發明制劑和免疫原性組合物的疫苗(例如，流感疫苗)。本發明還提供制備這種液體疫苗制劑的方法。例如，在一些實施方案中，本文提供了含有一種或多種流感病毒的液體制劑的制備方法。在一個具體的實施方案中，制備本發明液體制劑的方法包括以下一個或多個步驟1)將多種載體[一種或多種載體摻入了(或編碼)流感病毒基因組的一部分]引入一群宿主蛋或一群宿主細胞中，所述宿主蛋或宿主細胞群能支持流感病毒復制；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；；3)在病毒收獲物中回收流感病毒；4)加入穩定劑(例如，上述含蔗糖和谷氨酸的溶液)力)澄清該病毒收獲物(例如，通過深過濾或膜過濾)，從而得到澄清的病毒收獲物；6)離心該病毒收獲物(例如，連續區帶離心(continuous zonal centrifugation)、連續流式離心(continuous flow centrifugation)) ；7)除菌過濾步驟(例如，利用0. 2或0. 2-0. 5微米濾膜(在過濾期間加熱或不加熱))；和8)在_60°C儲存。在另一具體實施方案中，制備本發明液體制劑的方法包括以下一個或多個步驟 1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；；3)從病毒收獲物中回收流感病毒；4)加入穩定劑力)澄清該病毒收獲物(例如， 通過深部過濾或使之通過0. 2-0. 8微米的一個或多個濾器，或先通過0. 5或1. 5微米的再通過0. 2微米的濾器)，得到澄清的病毒收獲物；6)離心該病毒收獲物(例如，連續區帶離心、連續流式離心)；7)除菌過濾步驟(例如，利用0. 2或0. 2-0. 5微米濾膜(在過濾期間加熱或不加熱))；和8)在_60°C儲存。在另一具體實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下一個或多個步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；；3)從病毒收獲物中回收流感病毒；4)采用過濾澄清該病毒收獲物，得到澄清的病毒收獲物力)離心該澄清的病毒收獲物(例如，連續流式離心)，得到進一步澄清的病毒收獲物；；6)加入穩定劑(例如，以下一種或多種6-8%蔗糖；1-2%單鹽酸精氨酸； 0.05-0. 谷氨酸單鈉一水合物和0.5-2%明膠水解物)；6)采用過濾使所述進一步澄清的病毒收獲物除菌。在其它具體的實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下所有步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；T)在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；幻從病毒收獲物中回收流感病毒；4)采用過濾澄清該病毒收獲物，得到澄清的病毒收獲物力)離心該澄清的病毒收獲物(例如，連續流式離心)，得到進一步澄清的病毒收獲物；和6)采用過濾使所述進一步澄清的病毒收獲物除菌。在其它具體的實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下一個或多個步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；T)在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；；3)從病毒收獲物中回收流感病毒；4)澄清該病毒收獲物力)離心該澄清的病毒收獲物(例如，連續流式離心)，得到進一步澄清的病毒收獲物；和6)采用過濾使所述進一步澄清的病毒收獲物除菌。在其它具體的實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下一個或多個步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；T)在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；；3)從病毒收獲物中回收流感病毒；4)澄清該病毒收獲物；和幻滲濾該澄清的病毒收獲物。在另一實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下一個或多個步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；；3)從病毒收獲物中回收流感病毒；4)澄清該病毒收獲物力)滲濾該澄清的病毒收獲物；和6)加入穩定劑(例如，以下一種或多種6-8%蔗糖；1-2%單鹽酸精氨酸； 0. 05-0. 谷氨酸單鈉一水合物和0. 5-2%明膠水解物)。閱讀以下詳述并結合附圖可更全面理解本發明的這些和其它目的及特征。附圖簡述

圖1 顯示了說明CTM工藝流程的流程圖。圖2 顯示了說明CTM工藝流程的流程圖。圖3 顯示了說明離心時加載和溫度研究的表格。圖4 顯示了總結QC檢驗數據的表格。圖5 顯示了說明許多流感毒株平均產率的表格。圖6 顯示了總結單價散裝液放行試驗(release assay)結果的QC檢驗數據的表格。發明詳述本發明提供在4°C _8°C溫度范圍基本穩定的液體疫苗制劑。在本發明的一個具體實施方案中，本發明液體疫苗制劑在2-8°C溫度范圍內或在4°C，在至少1個月、或至少 2個月、或至少3個月、或至少4個月，或至少5個月，或至少6個月，或至少9個月，或至少12個月，或至少18個月，或至少M個月，或至少36個月或至少48個月期間基本穩定， 即在所述時間段終點的效力喪失(例如，流感病毒效力喪失)可接受，例如效力喪失介于 0. 5-1. Olog (通過，例如TCID50或熒光聚焦試驗(FFA)測定)。本發明提供在4°C _8°C溫度范圍基本穩定的液體疫苗制劑。在本發明的一個具體實施方案中，本發明液體疫苗制劑在2-8°C溫度范圍內或在4°C，在至少1個月、或至少2個月、或至少3個月、或至少4個月，或至少5個月，或至少6個月，或至少9個月，或至少12 個月，或至少18個月，或至少M個月，或至少36個月或至少48個月期間基本穩定，即在所述時間段終點的效力喪失(例如，流感病毒效力喪失)可接受，例如效力喪失小于10%、或小于20%、或小于30%、或小于40%、或小于50%、或小于60%、或小于70%、或小于80%、
6或小于90%。本發明還提供含有本發明制劑的免疫原性組合物。本發明還提供含有本發明制劑和/或免疫原性組合物的疫苗(例如，流感疫苗)。一個實施方案提供的本發明液體疫苗制劑含有流感活病毒。例如，本發明制劑可含有以下一種或多種減毒流感病毒、冷適應流感病毒、溫度敏感型流感病毒、減毒的冷適應溫度敏感型流感病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。在一個實施方案中，本發明液體疫苗制劑含有兩種甲型流感病毒毒株和一種乙型流感病毒毒株。或者，本發明制劑可包含其它活病毒，例如副黏病毒(例如，RSV、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、仙臺病毒、新城疫病毒)。本發明還包括制備這種液體疫苗制劑的方法。例如，在一具體實施方案中，本文提供了制備包含一種或多種流感病毒的液體制劑的方法。在一具體實施方案中，制備本發明液體制劑的方法包括以下一個或多個步驟1)將多種載體[一種或多種所述載體摻入了 (或編碼)流感病毒基因組的一部分]引入一群宿主蛋或一群宿主細胞中，所述宿主蛋或宿主細胞群能支持流感病毒復制；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；3)從病毒收獲物中回收流感病毒；4)加入穩定劑(例如，本文所述含蔗糖和谷氨酸的溶液)；5) 澄清病毒收獲物(例如，通過深過濾或膜過濾)，得到澄清的病毒收獲物；6)離心該病毒收獲物(例如，連續區帶離心、連續流式離心)；7)除菌過濾步驟(例如，利用0.2或0.2-0. 5 微米濾膜(在過濾期間加熱或不加熱))；和8)在-60°C儲存。在另一具體實施方案中，制備本發明液體制劑的方法包括以下一個或多個步驟 1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；幻從病毒收獲物中回收流感病毒；4)加入穩定劑力)澄清病毒收獲物(例如，通過深過濾和/或使之通過0. 2-0. 8微米的一個或多個濾膜，或先通過0. 5或1. 5微米的再通過0. 2微米的)，得到澄清的病毒收獲物；6)離心該病毒收獲物(例如，連續區帶離心、連續流式離心)；7)除菌過濾步驟(例如，利用0. 2或0. 2-0. 5微米濾膜(在過濾期間加熱或不加熱))；和8)在_60°C儲存。在其它具體實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下一個或多個步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；幻從病毒收獲物中回收流感病毒；4)過濾澄清該病毒收獲物，得到澄清的病毒收獲物力)離心該澄清的病毒收獲物(例如，連續流式離心)，得到進一步澄清的病毒收獲物；6)加入穩定劑(例如，以下一種或多種6-8%蔗糖；1-2%單鹽酸精氨酸； 0. 05-0. 谷氨酸單鈉一水合物和0. 5-2%明膠水解物)；和6)采用過濾使所述進一步澄清的病毒收獲物除菌。在其它具體實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下所有步驟 1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；幻從病毒收獲物中回收流感病毒；4)過濾澄清該病毒收獲物，得到澄清的病毒收獲物力)離心該澄清的病毒收獲物(例如，連續流式離心)，得到進一步澄清的病毒收獲物；和6)采用過濾使所述進一步澄清的病毒收獲物除菌。在其它具體實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下一個或多個步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；幻從病毒收獲物中回收流感病毒；4)澄清該病毒收獲物力)離心該澄清的病毒收獲物(例如，連續流式離心)，得到進一步澄清的病毒收獲物；和6)采用過濾使所述進一步澄清的病毒收獲物除菌。在其它具體實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下一個或多個步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；；3)從病毒收獲物中回收流感病毒；4)澄清該病毒收獲物；和幻滲濾澄清的病毒收獲物。在其它具體實施方案中，制備本發明流感病毒組合物的方法包括以下一個或多個步驟1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主細胞；幻在合適的溫度孵育該群宿主蛋或該群宿主細胞；幻從病毒收獲物中回收流感病毒；4)澄清該病毒收獲物力)滲濾該澄清的病毒收獲物；和6)加入穩定劑(例如，以下一種或多種6-8%蔗糖；1-2%單鹽酸精氨酸； 0. 05-0. 谷氨酸單鈉一水合物和0. 5-2%明膠水解物)。在一個實施方案中，制備液體制劑的方法包括冷凍這種制劑的步驟。冷凍步驟可在，例如最終的穩定性檢驗和銷售之前和/或在冷藏溫度(例如，4-8°C)儲存前進行。冷凍疫苗制劑，然后在冷藏溫度儲存可增加本發明疫苗制劑的穩定性至少10%、或20%、或 30%、或 40%、或 50%、或 80%。本發明還提供通過過濾流感病毒收獲物并在過濾期間加熱該病毒收獲物來制備一種或多種流感病毒組合物的方法。在這些具體實施方案中，過濾包括使該組合物流過孔徑0. 2微米-約0. 45微米的微濾膜。此外，在各種實施方案中，這種實施方案的加熱溫度任選包括約-約40°C或更高，而在一些實施方案中，該溫度包括31°C或約30°C -約 32°C。在這種實施方案中，加熱任選在過濾之前或期間進行，任選進行約50分鐘-約100 分鐘，約60-約90分鐘或約60分鐘。本發明也提供采用這種方法制備的流感病毒組合物 (包括該組合物是疫苗組合物)。穩定劑和緩沖劑本發明的穩定劑包含，例如一種或多種以下成分精氨酸{如，0.5-1%、1-2%、 1%U.2%U.5%,0.75-2% }；泊洛沙姆；蔗糖{如，2-8 %、2 %、6_8 %、3 %、4 %、5 %、 6%、7%或 8% }；水解的明膠{如，1%、0. 5-2%U. 5%,0. 5%,0. 75% }；和谷氨酸{如， 0. 05-0. 1%,0. 02-0. 15%,0. 03%,0. 04%,0. 06%,0. 02-0. 3%或 0. 094% }。本發明的緩沖劑包含，例如一種或多種以下成分磷酸緩沖劑(一元或二元或二者){如，10-200mM, pH 7-7. 5 ；IOOmM, pH 7. 2 ；IOOmM, pH 7-7. 3}；和組氨酸緩沖劑{如， 25-50mM 組氨酸，pH 7-7. 5 ；50-100mM 組氨酸，pH7_7. 5}。工藝的產率在一個實施方案中，制備本發明液體制劑的方法得到工藝的實際或平均產率(病毒收獲物(VH)與最終制劑)低于10%、低于16%、低于20%、低于30%、低于40%、低于 50%、低于60%、低于70%、低于80%、低于90%、或低于93%、或低于95%。本領域技術人員應該知道在同一生產流程(series)中無需進行本文所述方法 (所有)各步驟或各步驟無需存在于同一生產流程中。因此，盡管一些實施方案進行了本文所述所有步驟和/或存在本文所述所有組合物，但在其它實施方案中，可任選，例如省略、 改變(改變范圍、次序、位置等)一個或多個步驟，等等。
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本領域技術人員也應知道典型的實施方案包括本領域已知的步驟/方法/組合物，例如含病毒雞蛋的透光檢驗，用病毒接種雞蛋等。因此，本領域技術人員不難確定已知步驟的合適條件、子步驟、步驟細節等來制備在2-8°C基本穩定的合適病毒、病毒溶液、組合物等。下文詳細描述了各步驟。此外，本發明提供了這種液體疫苗制劑的用法。例如，可將疫苗制劑給予人來預防或減輕病毒感染，例如流感病毒感染的影響。在一個實施方案中，可將本發明制劑作為免疫原性組合物給予來預防或減輕流感病毒感染的影響。冷藏穩定的CAIV制劑本發明人和同事以前的工作開發了通過鼻部噴劑給藥的三價冷適應流感活疫苗 (CAIV-T，FluMist ，該疫苗在本文稱為FluMist，但應假定是FluMist )。本發明涉及開發在冷藏溫度的穩定性狀況改良的CAIV-T制劑。本文提供了制備這種改良制劑的方法， 其包括以下一個或多個步驟除菌過濾步驟以降低污染風險、超離心(例如，差速區帶離心 (rate zonal centrifugation))和滲濾。此外，本文包括液體FluMist和其它本發明冷藏穩定(RTQ制劑的一些制備方法。在20世紀60年代，CAIV毒株的開發受到密歇根大學John Maassab博士的幫助， 他將甲型和乙型流感病毒在遞減溫度下在PCK細胞中連續傳代直至獲得可重復地顯示冷適應(與野生型病毒相比，該病毒在低溫下生長良好)、溫度敏感(病毒在體外提高溫下生長不良)和減毒(在雪貂中病毒復制受限制)特性的毒株。通過，例如本發明人和同事的開發，可利用這些特性作為每年三價疫苗開發的基礎，所述三價疫苗反映了采用6 2遺傳重配方法的某年特定的CDC-指定疫苗毒株。例如，可通過有關的甲型或乙型毒株主供體病毒(Master Donor Virus) (MDV)和正流行的感興趣流感毒株的體外共同感染，及抗體介導的合適重配體的選擇來制備6 2CAIV毒株。目標6 2重配體含有流行毒株的HA和NA 基因，其余基因來自冷適應的主供體病毒(MDV)。該重配體保留了上述冷適應的表型特性。 本發明人和同事對CAIV作了進一步開發。FluMist已證明有安全的分布狀況，顯示對抗病毒攻擊有效，經批準可在許多情況中作為商品化藥物應用。FluMist的原始制劑含有用所選毒株的生產商工作病毒種子病毒(MWVS)感染無特定病原體的雞蛋，然后孵育2-3天，收集感染的尿囊液而制備的病毒收獲物(VH)。加入 1/10體積的10X蔗糖磷酸谷氨酸(SPG)溶液來穩定VH。通過將給定的某年疫苗中三種毒株各自的VH和穩定的正常尿囊液(NAF)混合達到各毒株7. 31oglOTCIDso/mL的目標濃度來制備三價FluMist。然后將得到的混合物注入裝有噴嘴的噴霧器以鼻內遞送FluMist疫苗。此產品形式以“冷凍的FluMist”使用，以冷凍形式儲存。應該知道此MWVS也能任選通過，例如質粒重配制備。參見，例如2002年4月沈日提交的美國專利申請60/375，675 ； 2003 年 4 月 25 日提交的 PCT/US03/12728 ；2003 年 4 月 25 日提交的 10/423，828 ；2005 年 5 月 20 日提交的 PCT/US05/017734 和 US20050186563。雖然冷凍的FluMist是可以在制備后冷凍并保持冷凍直至使用的知名疫苗，但仍非常需要在運輸/儲存時冷藏溫度下穩定的FluMist劑型。這種“冷藏溫度穩定”(或RTS) 劑型具有以下一種或多種特征(但不一定在各種實施方案中都具有)當作為冷藏液體分發時維持穩定；經過除菌過濾(例如，0. 2微米)以確保是無菌產品；雞蛋蛋白質含量低(例如，基本上不含NAF)；無需制備NAF稀釋液；單劑量體積小；和含有精氨酸和明膠作為賦形劑(例如，作為穩定劑)。在本文的某些方面，具有一個或多個這種特征的制劑稱為“液體 FluMist”或RTS或各種類似術語以區別于其它形式的CAIV-T疫苗，例如冷凍(疫苗)。本發明提供了這些和其它方面的內容。在本發明液體RTS病毒組合物的生產/檢驗中，進行了多批生產。生產批次是每批 2000-20, 000枚蛋，而GMP批次是每批約10，000枚蛋。應該知道雖然本文給出了生產MWVS 病毒(例如，重配體)的各種實例和方案，但在不同實施方案中此病毒可任選通過不同方法生產。例如，在某些實施方案中，任選用本文所述方案制備本文病毒，而在其它實施方案中， 任選用例如質粒重配或“質粒拯救”技術制備MWVS病毒。參見，例如2002年4月沈日提交的美國專利申請號60/375，675 ；2003年4月25日提交的PCT/US03/12728 ；2003年4月 25日提交的USSmO/423, 828 ；2004年2月25日提交的10/788，236 ；2005年5月20日提交的PCT/US05/017734和US20050186563，各份文獻納入本文作為參考。因此，本文所用的 “感染一群宿主細胞”包括用質粒重配法產生的或在質粒重配期間產生的病毒感染宿主細胞。在各種實施方案中，本發明包括基本穩定的病毒和疫苗組合物，例如在所選時期內在所需溫度下不會顯示不可接受的效力喪失，如效力喪失介于0. 5-1. Olog之間，或低于 0. 51og，或低于1. Olog，所選擇的時期通常是至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4 個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11 個月、至少12個月、至少13個月、至少14個月、至少15個月、至少16個月、至少17個月、 至少18個月、至少19個月、至少20個月、至少21個月、至少22個月、至少23個月、或至少 M個月、或M個月以上等；所需溫度一般是4°C、5°C、8°C、約2°C -約8°C或2°C以上、或介于2V _4°C之間、或介于2V -8°C之間。盡管利用FluMist示范或說明了本發明的許多方面，但本發明所體現的原理也適用于其它病毒/疫苗組合物，而無需局限于本文的具體毒株/病毒。因此，其它減毒活流感病毒和疫苗及組合物也屬于本發明的范圍，例如通過人為干預的合理方式產生的病毒和疫苗及組合物等。所有任選的其它流感毒株的其它病毒等也都屬于本發明的實施方案，例如甲型流感毒株、乙型流感毒株、減毒的和非減毒的流感毒株、冷適應的和冷不適應的流感毒株、溫度敏感型和溫度不敏感型流感毒株等。所述其它病毒和疫苗可用作，例如新型疫苗和 /或對照在人或動物中檢驗其它疫苗，等等。此外，其它病毒活疫苗組合物，特別是含有能在雞細胞或蛋中生長的活病毒(例如，麻疹病毒)的那些組合物是本發明的具體實施方案。 另外，本發明體現的原理在很大程度上也適用于含有能在哺乳動物細胞中生長的活病毒的病毒和疫苗組合物。參見，例如美國專利號6，244，354 ；6, 146，873和6，656，720。制備散裝病毒收獲物冷適應的流感病毒(或其它類似病毒)的純化和這些組合物的實際制劑是RTS或液體病毒組合物的特征。作為生產滅活疫苗的工業化生產方法的一部分是實施從尿囊液中分離流感病毒。選擇這種滅活疫苗的方法是超離心。工業化規模的連續流式超離心在1969 年開始應用，并迅速應用于制備滅活流感疫苗。盡管層析純化流感活病毒是有吸引力的備選方案，但還不是能保留病毒活性的可靠大規模方法。這認為是因流感病毒顆粒的包膜和多形性本質造成。本發明人和同事回收了通過超離心純化的活病毒(與滅活病毒相反)，這是本發明實施方案之一。其它工作證明深過濾能作為翻斗離心(swinging-bucket centrifugation)商業可行備選方案，然后超離心，經0. 2微米濾膜過濾后活病毒的回收率可接受，這也是本發明的實施方案之一。在一具體實施方案中，本發明方法VH澄清步驟的產率中值是至少30%、或至少 40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%。在另一具體實施方案中，本發明方法的超離心(例如，區帶離心)步驟的產率中值是至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少 90%。在另一具體實施方案中，本發明方法的峰稀釋(peak dilution)和除菌過濾步驟的產率中值是至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少 80%、或至少90%。超離心步驟能提供濃縮CAIV的優點。這支持應用較小的遞送體積(每鼻孔0. ImL 而不是每鼻孔0. 25mL,例如冷凍FluMist所用的體積)。這種體積減少對于鼻部給藥產品更為典型，它能提高使用者接受程度以及降低因吞咽或疫苗流出鼻孔而造成的產品損失。 對于CAIV，受感染的尿囊液收獲物滴度通常介于8. 3-9. 51oglJCID5cZmL之間，這比冷凍 FluMist的目標產物濃度(7. 31og10TCID50/mL,或Iog10TCID50/劑量)高一個數量級。如果每年的疫苗推薦中包括極低滴度的毒株，液體或RTS FluMist能提高制備全面強化三價疫苗的可能性，雖然與冷凍FluMist相比，該終產物中病毒濃度增加。液體或RTS FluMist任選配制為7. 71og10TCID50/mL的終濃度，其每劑量遞送的活病毒量與冷凍FluMist相同。一具體實施方案提供了低滴度流感疫苗組合物，其中病毒滴度低于 7. 31og1(1TCID50/mL、或低于 7. 01og10TCID50/mL,或低于 6. Olog1 QTCID5(1/mL、或低于 5. 01og10TCID50/mL,或低于 4. 01og10TCID50/mL,或低于 3. 01og10TCID50/mL,或低于 2. 01og1(lTCID5(l/mL。這種低滴度流感疫苗組合物還可包含藥學上可接受的佐劑，例如大腸桿菌熱不穩定毒素(或其片段)、百日咳毒素、鋁。其它佐劑包括但不限于磷酸鋁，氫氧化鋁，MPL. TM. (3-0-脫酰基單磷酰脂質 A ；RIBI ImmunoChem Research, Inc.，Hamilton, Mont.，現為 Corixa)，合成的脂質 A 類似物，例如 5 (Corixa)，Stimulon. TM. QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, Mass.), IL-12(Genetics Institute, Cambridge, Mass.)，合成的多核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(美國專利號6，207,646(28))和霍亂毒素(野生型或突變體形式，例如根據公布的國際專利申請號WO 00/18434，氨基酸四位的谷氨酸被另一氨基酸，最好是組氨酸取代)。一具體實施方案可采用滲濾制備本發明病毒組合物。例如，可利用滲濾濃縮病毒， 再配制。除超離心外還可采用滲濾，或者可用滲濾替代超離心。在本文稍后所述的初始階段后，以每批10，000個蛋的規模開始cGMP生產。生產了 A/ 北京 /262/95 (HlNl)、A/ 悉尼 /05/97 (H3N2)和 B/Ann Arbor/1/94 (B/ 哈爾濱 /7/94-樣) 純化的單價CAIV散裝液以支持隨后的臨床試驗。下文將B/ArmArbor毒株稱為B/哈爾濱 /7/94-樣毒株。為方便起見，毒株名稱往往是縮寫(例如A/北京)。本申請最著重描述了液體FluMist獨特的加工步驟，然而，本文也描述了涉及液體和冷凍FluMist或二者共有的步驟。在本發明的各種實施方案中，冷凍FluMist的處理蛋和制備新鮮病毒收獲物的方
11法與液體FluMi st的基本一樣(除了自動接種和收集外)，本領域技術人員知道本發明能利用的類似或等價步驟。本發明利用Hitachi CP40Y區帶離心機和RP40CT D型連續流式轉頭(轉頭體積=3.2L)進行超離心。首先合并病毒收獲物，用蔗糖磷酸谷氨酸(SPG)穩定以促進過濾，然后使之通過5微米的聚丙烯濾膜。再將濾液加載于10% -60%蔗糖梯度液上，以40，OOOrpm離心1小時形成條帶，流出液分為100-mL的組分。合并含有高水平血凝素(HA)的組分，稀釋至0. 2M蔗糖濃度，然后利用0. 2微米的聚偏二氟乙烯(PVDF)濾膜進行除菌過濾。將得到的純化單價CAIV液在-60°C以下冷凍于 IL瓶中，儲存待進一步加工。制劑和灌注初始制劑的篩選確定了冷藏溫度的純化CAIV的液相穩定性(是否)適用于年度疫苗。向冷凍FluMist的穩定劑SPG中加入水解的動物明膠能得到最佳穩定性結果，其中最不穩定的毒株和得自CTM-I階段(campaign)的各批顯示在6. 9個月期間(效力)喪失 1個對數。其它制劑的開發研究顯示生產后立即冷凍儲存和在最終分發前融化能進一步提高液體FluMist的穩定性。加入精氨酸也提高了最差毒株的穩定性。雖然動物明膠可引起對傳播性海綿狀腦病(TSE)的關注，但缺乏明膠的可用制劑在所有實施方案中均未達到所需穩定性。因此，液體FluMist制劑的一些實施方案選用豬明膠是因其穩定特性和在豬中未見發生TSE的報道。也認為膠原水解所用的嚴苛化學處理步驟可導致朊病毒大小蛋白質的滅活。運輸冷凍純化的單價CAIV散裝液和在cGMP條件下生產三價疫苗以支持液體 FluMist的臨床檢驗。總共進行6次充填。利用4-升玻璃吸氣燒瓶進行小規模混合，利用 INOVA自動充填/加塞機和相關裝置充填0. 5mL Becton Dickinson(BD)Hypack SCF(無菌， 清潔，易裝填)玻璃噴霧器。下文詳述了充填的三價液體FluMist的生產。本發明具體制劑的實施方案在一個實施方案中，本發明的疫苗制劑在最終制劑中包含以下一種或多種成分蔗糖6-8 %重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1-2% w/v ；谷氨酸單鈉一水合物
0.05-0. 1% w/v ；明膠水解物，豬A型(或其它來源)0. 5-2% w/v ；磷酸氫二鉀1-2% ；和磷酸二氫鉀0. 25-1% w/v ο在一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下一種或多種成分蔗糖6. 84%重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1. 21 % w/v ；谷氨酸單鈉一水合物0. 094w/v ；明膠水解物，豬A型 (或其它來源)1% w/v ；磷酸氫二鉀1. 13% ；和磷酸二氫鉀0.48% w/v。在另一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下所有成分蔗糖6. 84%重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1.21% w/v ；谷氨酸鈉一水合物0. 094w/v ；明膠水解物，豬A型(或其它來源)1 % w/v ；磷酸氫二鉀
1.13% ；和磷酸二氫鉀 0. 48% w/v ο在另一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下所有成分(一種或多種成分的偏差在 10%以內)蔗糖6. 84%重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1.21% w/v;谷氨酸單鈉一水合物0. 094w/v ；明膠水解物，豬A型(或其它來源)1 % w/v ；磷酸氫二鉀1.13% ；和磷酸二氫鉀 0. 48% w/v ο在另一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下所有成分(一種或多種成分的偏差在10%以內)蔗糖6. 84%重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1.21% w/v;明膠水解物，豬A型(或其它來源)l%W/v。在這類實施方案中，制劑用緩沖液{例如，磷酸鉀緩沖液(PH 7. 0-7. 2)}配制。在另一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下所有成分(一種或多種成分的偏差在 20%以內)蔗糖6. 84%重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1.21% w/v;谷氨酸單鈉一水合物0. 094w/v ；明膠水解物，豬A型(或其它來源)1 % w/v ；磷酸氫二鉀1.13% ；和磷酸二氫鉀 0. 48% w/vo在另一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下所有成分(一種或多種成分的偏差在 30%以內)蔗糖6. 84%重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1.21% w/v;谷氨酸單鈉一水合物0. 094w/v ；明膠水解物，豬A型(或其它來源)1 % w/v ；磷酸氫二鉀1.13% ；和磷酸二氫鉀 0. 48% w/vo在另一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下所有成分(一種或多種成分的偏差在 40%以內)蔗糖6. 84%重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1.21% w/v;谷氨酸單鈉一水合物0. 094w/v ；明膠水解物，豬A型(或其它來源)1 % w/v ；磷酸氫二鉀1.13% ；和磷酸二氫鉀0. 48% w/vo在另一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下所有(一種或多種成分的偏差在以內)蔗糖6. 84%重量/體積(w/v)；單鹽酸精氨酸1. 21% w/v;谷氨酸單鈉一水合物 O.OMw/v ；明膠水解物，豬A型(或其它來源)1% w/v ；磷酸氫二鉀1. 13% ；和磷酸二氫鉀 0. 48% w/vo在另一具體實施方案中，疫苗制劑包含以下所有成分(一種或多種成分的偏差在 3%以內)蔗糖6.84%重量/體積(《八)；單鹽酸精氨酸1.21% w/v;谷氨酸單鈉一水合物 0. 094w/v ；明膠水解物，豬A型(或其它來源)w/v ；磷酸氫二鉀1. 13% ；和磷酸二氫鉀 0. 48% w/vo在一具體實施方案中，本發明制劑可含有，例如用作緩沖液的磷酸鉀(如，至少 50mM,或至少IOOmM,或至少200mM，或至少250mM)或組氨酸(如，至少50mM，或至少IOOmM, 或至少200mM，或至少250mM)。本發明的其它具體實施方案，例如給藥，效力另一具體實施方案包括鼻內給予本發明疫苗制劑的方法。例如，可鼻內給予的本發明疫苗制劑的最終劑量是0. 5mL/劑；0. 75mL/劑；0. ImL/劑；0. 15mL/劑；0. 2mL/劑； 0. 25mL/ 劑；0. 5-0. ImL/ 劑；0. 5mL_2mL/ 劑；或 0. 5-2. 5mL/ 劑。在一個實施方案中，本發明疫苗制劑約含有IO7熒光聚焦單位(FFU)或IO7TCID5tl 的各三種不同的流感重配毒株。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑包含的各流感病毒毒株的效力為7. 0(+/-0. 5)loglOFFU/劑(或TCID5c/劑)。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑包含的至少一種流感病毒毒株的效力為7. 0 (+/-0. 5) IoglOFFU/劑(或TCID5tl/ 劑)。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑的效力至少為(或等于)6. OloglOFFU/劑、
6.51oglOFFU/ 劑、6. 71oglOFFU/ 劑、6. 71oglOFFU/ 劑、6. 81oglOFFU/ 劑、6. 91oglOFFU/ 齊[J、
7.OloglOFFU/ 劑、7. IloglOFFU/ 劑、7. 21oglOFFU/ 劑、7. 31oglOFFU/ 劑、7. 41oglOFFU/ 齊[J、
7.51oglOFFU/ 劑、7. 61oglOFFU/ 劑、7. 71oglOFFU/ 劑、7. 81oglOFFU/ 劑、7. 91oglOFFU/ 齊[J、
8.IloglOFFU/ 劑、8. 51oglOFFU/ 劑或 8. 81oglOFFU/ 齊[J。在本發明的各實施方案中，可用TCID5tl替代FFU來衡量效力。熒光聚焦試驗(FFA)
13可直接衡量疫苗的感染力，而TCID5tl是間接衡量在MDCK或其它細胞中的生產性復制能力。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑具有介于每劑(例如，每0.2mL劑量)6. 5-7. 51oglOFFU之間的效力。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑具有至少(或等于)以下的效力 7. OlogiciTCID5ci/劑、或至少 6-8TCID5。/劑、或至少 6. 4TCID5。/劑、或至少 6. 61ogl JCID5c/劑。在一個實施方案中，本發明疫苗的pH為6. 7-7. 7、或6. 6、或6. 7、或6. 8、或6. 9、或 7. 0、或 7. 1、或 7. 2、或 7. 3、或 7. 4、或 7. 5、或 7. 6、或 7. 7。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑具有不超過60EU/mL的內毒素，或不超過200EU/mL的內毒素。例如，本發明疫苗制劑具有低于或等于5EU/mL的內毒素。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑具有低于或等于1. OEU/7. OloglOFFU。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑不含以下一種或多種(或所有)成分支原體、逆轉錄病毒、禽白血病病毒和分枝桿菌(例如，結核分枝桿菌(M. tuberculosis))。制備本發明這種制劑的方法可包括檢驗這種雜質的步驟。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑所包含的流感病毒具有不同于FluMist 中三種病毒的HA和NA基因。在一具體實施方案中，每劑量(例如，每0. 2mL劑量)本發明制劑可含有以下一種或多種(或所有)成分蔗糖(13. 68mg)、磷酸氫二鉀(2. 26mg)、磷酸二氫鉀(0. 96mg)、明膠水解物(2. Omg)、單鹽酸精氨酸(2. 42mg)和谷氨酸單鈉(0. 188mg)。在一具體實施方案中，每劑量(例如，每0. 2mL劑量)本發明制劑可含有以下一種或多種(或所有)成分蔴糖(13. 68mg)、磷酸鉀(IOOmM)、明膠水解物(2. Omg)、單鹽酸精氨酸(2. 42mg)和谷氨酸單鈉(0. 188mg)。在另一具體實施方案中，每劑量本發明制劑可含有以下一種或多種成分(或所有)(+/-10%、或 20%、或 30%或 40% )蔗糖(13.68mg)、磷酸氫二鉀(2. ^mg)、磷酸二氫鉀(0. 96mg)、明膠水解物(2. Omg)、單鹽酸精氨酸(2. 42mg)和谷氨酸單鈉(0. 188mg)。在另一具體實施方案中，每劑量本發明制劑可含有以下一種或多種成分(或所有)(+/-10%、或20%、或30%或40% )蔗糖(13.68mg)、磷酸鉀(IOOmM)、明膠水解物 (2. Omg)、單鹽酸精氨酸(2. 42mg)和谷氨酸單鈉(0. 188mg)。在另一具體實施方案中，本發明制劑包含的流感病毒具有一種或多種以下流感病毒的遺傳骨架A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) B/Ann Arbor/1/66病毒、FluMist MDV-A (ca A/Ann Arbor/6/60) > FluMist MDV-B(caB/Ann Arbor/1/66) > A/Leningrad/17 #^^ 骨架和PR8。在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑包含的流感病毒含有以下一種或多種(病毒)的HA和NA多肽序列(與這些序列至少90%相同或至少95%相同)B/ Yamanashi ；A/新喀里多尼亞；A/悉尼；A/巴拿馬；B/約翰內斯堡；B/維多利亞；B/香港；A/ 山東/9/93 ；A/約翰內斯堡 /33/94 ；A/武漢/395/95 ；A/悉尼 /05/97 ；A/ 巴拿馬/2007/99 ； A/懷俄明/03/2003 ；A/德克薩斯/36/91 ；A/深圳/227/95 ；A/北京/262/95 ；A/新喀里多尼亞 /20/99 ；B/AnnArbor/1/94 ；B/Yamanashi/166/98 ;B_ 約翰內斯堡 _5_99 ；B/ 維多利亞 /504/2000 ；B/ 香港 /330/01 ;B_ 布里斯班 _32_2002 ；B/ 吉林 /20/03 ；HlNl 甲型流感病毒； H3N2甲型流感病毒；H9N2甲型流感病毒；H5N1甲型流感病毒；乙型流感病毒；和流行性流感病毒毒株(WHO所指定或不在人群中流行的)。參見，例如US 20050042229。
在另一具體實施方案中，本發明疫苗制劑是無菌的。疫苗制備中代表性步驟的描述為便于討論和描述，一般認為疫苗組合物生產的各步驟包括或屬于四個大組(大體上類似于以上概述的)。第一組包括諸如共感染、重配、重配體選擇和重配體克隆的方面。 第二組包括諸如重配體的純化和擴增的方面。第三組包括在蛋中進一步擴增重配體、收集、 純化這種收集的病毒溶液。第四組包括穩定收集的病毒溶液，和病毒溶液的效力/無菌性試驗。然而，應該知道將本發明各方面分為上述四個通用類別只是出于說明/組織目的，而不能作出這些步驟相互依賴的推論，等等。也應該知道其它步驟(相似和不同的)也任選可與本發明方法和組合物(例如，用于RTS疫苗組合物的方法和組合物)聯用。如上所述，為便于討論和描述，可認為疫苗生產中各步驟包括四個大組。第一組包括諸如共感染、重配、重配體選擇和重配體克隆的方面。組1在本文概括歸類為屬于組1的疫苗組合物生產的各方面包括與以下有關的方法和組合物優化利用(例如)主供體病毒(master donor virus)和一種或多種野生型病毒共感染培養的細胞系以特異性產生所需的重配病毒；選擇合適的重配病毒；克隆所選擇的重配病毒。本領域技術人員熟知流感病毒毒株的重配。甲型流感病毒和乙型流感病毒的重配已同時用于細胞培養和蛋中以產生重配的病毒毒株。參見，例如Tarmock等，“制備和特征鑒定源自A/Leningrad/' 134/17/' 57供體毒株的減毒冷適應的甲型流感病毒重 ΚΙΦ" (Preparation and characterisation of attenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/' 134/17/' 57donor strain),Vaccine, (2002),20 :2082-2090o也利用質粒構建物顯示流感病毒毒株的重配。參見，例如2002年 4月沈日提交的美國專利申請號60/375，675、2003年4月25日提交的PCT/US03/127^、 2003年4月25日提交的美國申請10/423，擬8、2005年5月20日提交的PCT/US05/0177;34 ； 和 US20050186563。簡言之，重配通常包括混合(例如，在蛋或細胞培養物中)不同病毒的基因區段。 例如，可組合乙型流感病毒毒株的含有感興趣表位的野生型毒株和“供體”毒株(如包含冷適應的毒株)的典型8個區段。在兩種病毒類型間重配本身能產生含有野生型毒株表位的一個區段和冷適應毒株的另一區段的病毒。不幸的是，為產生所需重配體，有時需要進行大量重配。也可在重配后選擇病毒(例如，以發現所需重配體)。然后可克隆所需的重配體 (例如，擴增其數量)。一般通過將病毒毒株共感染入細胞培養物(例如，CEK細胞)，然后用合適的抗體 (例如針對親代病毒之一成分的抗體)選擇(通常在蛋中進行)，克隆或擴增病毒等(通常在細胞培養物中進行)進行乙型流感病毒所需重配體的常規優化、選擇和克隆。然而，這種常規重配的缺陷在于需要數千次重配來產生所需的區段組合物。當進行這種重配時，真正的隨機重配(truly random reassortment)明顯不是最終結果。換言之，該系統中存在導致該方法偏向的壓力。然而對于甲型流感病毒，這種方法顯示沒有這種偏向。對于甲型毒株，先進行毒株共感染(通常感染入細胞培養物，例如CEK細胞)，然后通常對細胞培養物同時進行選擇和克隆。重配的優化
采用組1各步驟的各種實施方案可優化重配方法以減少所需的重配次數(從而提高疫苗生產方法的產量/穩定性)等。采用這種優化技術的步驟一般實施方案為乙型流感病毒毒株重配，所述步驟通常在細胞培養物(例如，CEK細胞)中進行。參見，例如均在2004 年2月25日提交的美國專利申請號10/788，236和PCT/US04/05697，二者出于所有目的在本章節和整個說明書中全文納入作為參考。流感病毒重配的其它方法可任選混合主供體病毒(MDV)和野生型病毒的稀釋液， 例如各自的1 5稀釋液，而不論各溶液的濃度，然后將混合液在25°C和33°C培育M和48 小時。盡管對于甲型流感病毒毒株這種方法通常可接受，但采用這種方法乙型流感病毒毒株通常不能得到陽性結果。例如，為達到合適的6 2重配(即，MDV的6種基因與野生型病毒的NA和HA 二種基因)必須進行數千次重配。重配的選擇和克隆組1的步驟也包括選擇重配的流感病毒。可在細胞培養物(例如，CEK細胞)或蛋中選擇重配的甲型流感病毒毒株。然而，當在細胞培養物(例如，當在CEK細胞中選擇時) 中重配時，重配的乙型流感病毒毒株存在問題。據認為，CEK細胞可干擾乙型流感病毒毒株的M基因，從而降低總產量。疫苗組合物生產的各種方法(參見，例如均是2004年2月25 日提交的美國專利申請號10/788，236和PCT/US04/05697)采用不同的病毒重配步驟(例如選擇)，可任選采用這種步驟來產生用于疫苗組合物的病毒。重配的特征鑒定病毒/疫苗生產的其它方法還應用高通量單鏈構象多態性/毛細管電泳(SSCP/ CE)試驗來測定本文所用流感病毒的基因格局(gene constellation)。流感病毒含有8個基因區段，如上所述，用兩種不同流感病毒毒株共感染一個細胞可產生具有不同于任一親代的新型基因構象的重配體病毒。因此，一些方法可采用SSCP/CE試驗來快速測定大量流感病毒樣品中的基因區段格局。可利用這8個區段各自的特異性熒光標記引物任選通過 RT-PCR擴增流感病毒的基因區段。也可參見出于所有目的納入本文作為參考的Arvin等， (2000)，Clin. Micro. J,38(2) :839_845。防止細菌污染病毒/疫苗生產的一些方法可包括檢測和/或防止/檢測用于生產流感病毒的蛋的微生物污染步驟。本發明的微生物檢測方法可用于快速/高通量的微生物檢測，因此與許多其它步驟一樣可用于提高病毒/疫苗生產的產量及任選提高穩定性。本發明任選可采用的目前許多流感疫苗生產方法利用在無特定病原體的雞胚蛋中擴增流感病毒的常規方法作為組成部分。在用雞蛋生產病毒的幾個階段中可能發生微生物污染。不幸的是，雞蛋殼外可能有一些微生物組成它們天然菌群的一部分。在雞胚胎發育期間，蛋殼內也可能含有微生物。受精的雞蛋于37°C在高濕度中孵育以使胚胎發育，這也構成了許多類型微生物污染物的基本培育條件。刺穿蛋殼以接種雞蛋是發生微生物污染另一可能的時間。即使常在病毒接種前用酒精噴灑雞蛋，微生物也仍可能進入雞蛋。病毒在雞蛋中擴增2-3天后，通常除去蛋殼頂部后手工收集雞蛋中含有病毒的尿囊液。參見上文。這種收集是可能引起微生物污染的另一時間。不幸的是，含有這種污染性生物負載(bioburden)的雞蛋可能逃過檢測，而必須合并成多瓶以盡可能降低因MPA檢驗失敗而棄去整批的可能性。由于疫苗生產中通常利用3種流感病毒毒株，對于最終的散裝液需要混合這3種毒株。應在混合和充填之前，例如病毒收集加工過程中采用MPA (微生物純度試驗)檢驗以確保產品不含微生物。 孵育后，采用“常規”透光檢驗方法來鑒定未受精和因天然原因或微生物污染而死亡的死蛋(即，因病毒感染和/或微生物擴增而發生的死蛋，兩種情況均需檢測并除去這種蛋)。透光檢驗包括，例如在暗室中將雞蛋握持在光源前從而能目測觀察胚胎發育的方法。 排除病毒接種后的死蛋。從上述時間點可以看出，流感疫苗生產期間有多個步驟需要檢測微生物污染。需要消除或減少禽類和環境微生物，需要消除或減少引入的環境和人微生物。目前檢測微生物污染的方法包括，例如簡化的(compendial)方法(MPA和生物負載)。目前的方法包括， 例如接種前/后雞蛋透光檢驗(通常以約500枚蛋/小時/人的速度手工進行)；MPA和生物負載檢驗，通常手工進行，對于MPA要約14天，對于生物負載要約3天(在病毒收集期間進行)；支原體檢驗，通常手工進行，需要約觀天(在病毒收集期間進行)；和分枝桿菌檢驗，通常手工進行，需要約56天(在病毒收集期間進行)。對于本發明能采用的各種技術的描述也可參見例如均在2004年2月25日提交的美國專利申請號10/788，236和PCT/ US04/05697。組2屬于組2的病毒/疫苗生產各方面還包括純化和病毒擴增等。經正確的重配和重配體(即，6 2病毒)克隆過程后，可進一步純化雞胚蛋中的這種重配病毒顆粒，大量擴增正確的克隆(還是通過在雞蛋中培養)以產生主病毒毒株(MVQ或主病毒種子，進而再擴增以產生主工作病毒毒株(MWVS)或生產商的工作病毒種子。本領域技術人員熟知從雞蛋純化病毒顆粒和利用這種純化的病毒來接種更多雞蛋以擴增大量病毒顆粒的許多方面。許多這些技術是目前病毒顆粒生產中常用的，已至少使用了 40年。參見，例如Reimer 等，“采用區帶超離心純化流感病毒” Gnfluenza virus purification with the zonal ultracentrifuge)，Science，1966，152 :1379-81。純化方法可包括，例如蔗糖梯度超離心 (例如，10-40%蔗糖)等。如本文所述，組2中也可任選包括其它組所列方法等，例如防止微生物污染等。組3屬于組3的病毒/疫苗生產各方面包括，例如條件化孵育含胚胎的雞蛋(如，涉及孵育病毒感染的雞蛋的特定處理和環境條件)和從雞蛋尿囊液中收集以及澄清流感病毒。例如，條件化、洗滌、透光檢驗和孵育含有用于疫苗的重配病毒的蛋；接種、密封這種蛋等；透光檢驗這種蛋；收集蛋中的病毒溶液(如，尿囊液或病毒收獲物(VH))；和澄清病毒溶液均屬于這種范疇。也應注意適用于組2步驟的幾種技術同樣適用于組3的步驟 (例如，透光檢驗)。本領域技術人員熟知包括組3病毒/疫苗生產的幾個方面。病毒生產中透光驗蛋以及用病毒接種蛋和這種蛋的洗滌、孵育等各方面是用蛋生產病毒/疫苗的熟知技術。當然，應該知道這種熟知技術可與本發明獨特且創新的方面聯用。參見，例如均是 2004年2月25日提交的美國專利申請號10/788，236和PCT/US04/05697中給出的也可與本發明方法和組合物聯用的其它步驟，如擺動(rocking)等。其它類似的步驟可包括組合物的具體過濾和升溫步驟，也參見相同的文獻。過濾和升溫
本發明包括屬于目前分組的上述超離心的各方面，參見上文。此外，均是2004年2 月25日提交的美國專利申請號10/788，236和PCT/US04/05697中給出了可任選與本發明方法和組合物聯用的其它過濾和升溫步驟。如(本文)所述，FluMist 生產方法可利用雞胚蛋來產生主病毒種子(MVS)、生產商工作病毒種子(MWVQ和病毒收獲物(VH)。這些種子和病毒收獲物可能含有生物負載(通常是細菌污染)該從而導致疫苗生產過程中棄去該種子或散裝病毒產品批次。當然，應該知道，除非另有明確表述，不應將所用具體產品的類型、 大小等的具體列表或描述認為是對本發明的限制。組4疫苗制劑/組合物生產的組4的各方面包括，例如基本上與穩定有關的步驟(例如，通過加入一些組分，改變緩沖液/NAF比值等)和含病毒溶液的效力/無菌性試驗。以上對本發明的描述給出了屬于此范疇內的任選分組的各方面。參見上文。在一些實施方案中，含有活病毒的液體形式的最終病毒溶液/疫苗可穩定足夠時間從而能在整個流感疫苗季節(例如，在北半球通常大概從9月到3月)“現場”儲存(例如，在2-8°C、4°C、5°C等冷藏時銷售和(付諸)商業化)。因此，需要這種病毒/疫苗組合物在儲存期間保持其效力或其喪失效力的速度可以接受。在其它實施方案中，液體形式的這種溶液/疫苗在約2°C -約8°C (例如冷藏溫度)下穩定。例如，如果0. 31og的效力喪失可接受并且儲存時間是9個月，則效力降低為0. 051og/月是可接受的。試舉另一例子，如果允許(效力)喪失最多為0. 751og，則(效力降低)速度低于或等于0.091og/月足以維持冷藏溫度(例如，4°C)下連續儲存物質的穩定性。在其它實施方案中，當儲存在約2°C_約 8°C時，液體形式的這種溶液/疫苗穩定。組合物的穩定性可包括在約1天-2年之間、約10 天-約2年之間、約20天-約2年之間、約1個月-約2年、約2個月-約2年之間、約3個月-約2年之間、約4個月-約2年之間、約5個月-約2年之間、約6個月-約2年之間、 約7個月-約2年之間、約8個月-約2年之間、約9個月-約2年之間、約10個月-約2 年之間、約11個月-約2年之間、約12個月-約2年之間、約13個月-約2年之間、約14 個月-約2年之間、約15個月-約2年之間、約16個月-約2年之間、約17個月-約2年之間、約18個月-約2年之間、約19個月-約2年之間、約20個月-約2年之間、約21個月-約2年之間、約22個月-約2年之間、約23個月-約2年之間、或大于約2年。可通過許多方法檢驗本發明制劑的穩定性。例如，可首先在冷凍溫度(例如，"25 或-70°C (+/-10、20、30或40°C))培育制劑，然后在4_8°C儲存(或“培育”)該制劑一段時間。或者，可通過在4-8°C簡單地儲存(或“培育”)該制劑一段時間。可通過本文所述或其它已知的方法檢測效力。病毒收獲物的濃縮/滲濾在疫苗組合物生產的一些方法中，可任選用合適的柱濃縮病毒收獲物。參見均是 2004年2月25日提交的美國專利申請號10/788，236和PCT/US04/05697。穩定劑/緩沖液疫苗組合物生產也任選包括含有感興趣病毒和諸如蔗糖、精氨酸、明膠、EDTA等混合物的NAF(通常是未分級的NAF)的各種稀釋液。不同疫苗制劑中可能的各種組合物的例子可參見，例如美國專利申請號10/788，236和PCT/US04/05697。這種方法和組合物優選在所需溫度(例如，通常在41、51、81，約21-約81之間或高于21等)下，在所選擇的時期(通常至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少15個月、至少18個月、至少M個月等)內穩定，例如不顯示不可接受的效力喪失，如效力喪失介于0. 5-1. Olog之間，或低于 0. 51og，或低于 1. Olog0在一些制劑中，組合物可含有與明膠或明膠相關和/或衍生產品(例如明膠水解物)相混合或替代其的穩定劑，例如精氨酸(pH約7. O-約7. 2)。參見美國專利申請號 10/788，236和PCT/US04/05697。許多病毒溶液/疫苗溶液也任選利用SPG基礎溶液(蔗糖、磷酸鉀和谷氨酸單鈉)。均是2004年2月25日提交的美國專利申請號10/788，236和PCT/US04/05697給出了穩定病毒/疫苗組合物的其它方法，例如操控NAF水平等。定義除非另有定義，所有科技術語應理解為具有和其所屬領域常規使用相同的意義。 出于本發明的目的，下文定義了以下術語。術語“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”指單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，或其嵌合物或類似物。本文所用的術語任選包括具有天然核苷酸基本性質的天然產生的核苷酸類似物的聚合物，即它們能以類似于天然產生的核苷酸的方式與單鏈核酸雜交(例如，肽核酸)。除非另有指明，具體核酸序列任選含有互補的序列，除了明確指出的序列以外。術語“基因”廣泛用于指與生物學功能相關的任何核酸。因此，基因包含它們表達所需的編碼序列和/或調節序列。術語“基因”適用于特定的基因組序列以及該基因組序列所編碼的cDNA或mRNA。基因也包含不表達的核酸區段，例如所述區段形成其它蛋白質的識別序列。不表達的調節序列包括能與諸如轉錄因子的調節蛋白結合從而導致毗連或毗鄰序列轉錄的“啟動子”和“增強子”。“組織特異性”啟動子或增強子是能在特定組織類型或細胞類型，或多種類型中調節轉錄的啟動子或增強子。術語“載體”指能在生物、細胞或細胞組分之間擴增和/或轉運核酸的工具。載體包括能自主復制或能整合入宿主細胞染色體中的質粒、病毒、細菌噬菌體、原病毒、噬菌粒、 轉座子和人工染色體等。載體也可是不能自主復制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一鏈中由DNA和RNA構成的多核苷酸、聚-賴氨酸-偶聯的DNA或RNAJi _偶聯的DNA 或RNA、脂質體-偶聯的DNA等。本文的載體最常用于(但并非專門)指質粒。“表達載體”是能促進摻入其中的核酸表達以及復制的載體，如質粒。待表達的核酸通常“操作性連接于”啟動子和/或增強子，并受啟動子和/或增強子的轉錄調節控制。“雙向表達載體”的特征是兩個交替的啟動子(alternative promoter)的朝向相對于它們之間的核酸呈相反方向，從而可以兩個方向啟動表達，進而導致，例如同時轉錄產生正(+)鏈或有義鏈和負鏈(_)或反義鏈RNA。在本文中，術語“分離的”指生物物質，例如核酸或蛋白質基本上不含在其天然產生環境中與其正常相伴或相互作用的成分。分離的物質任選含有在其天然環境，例如細胞中未發現的與其相伴的物質。例如，如果該物質處于其天然環境，例如細胞中，則該物質在細胞中的位置(例如，基因組或遺傳元件)對該環境中發現的物質是非天然的。例如，如果通過非天然產生的工具將天然產生的核酸(例如，編碼序列、啟動子、增強子等)引入對該核酸是非天然的基因組基因座中(例如，載體，如質粒或病毒載體或擴增子)，在該核酸是分離的。這種核酸也稱為“異源”核酸。術語“重組體”表示經人工或合成(非天然)方法改變的物質(例如，核酸或蛋白質)。可對處于其天然環境或狀態中，或對從其天然環境中除去的物質進行改變。具體地說，當提及的病毒，例如流感病毒是重組體時，可通過重組核酸的表達產生。當術語“重配體”指病毒時，其表示該病毒包含衍生自多個親代病毒毒株或來源的遺傳成分和/或多肽成分。例如，7 1重配體包含衍生自第一親代病毒的7個病毒基因組區段(或基因區段)和第二親代病毒的一個互補病毒基因組區段，例如編碼血凝素或神經氨酸酶的基因組區段。6 2重配體包含第一親代病毒的6個基因組區段(最常見的6個內部基因)和不同親代病毒的兩個互補區段，例如(編碼)血凝素或神經氨酸酶的區段。當術語“引入”指異源或分離的核酸時，其指將某核酸摻入真核或原核細胞中，從而可將該核酸摻入細胞的基因組(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中，轉變為自主復制子或瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。該術語包括諸如“感染”、“轉染”、“轉化”和“轉導”等方法。在本發明內容中，可采用各種方法將核酸引入原核細胞中，包括電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質介導的轉染(脂轉染)等。術語“宿主細胞”表示含有異源核酸，例如載體并能支持該核酸復制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞，例如大腸桿菌，或真核細胞，例如酵母菌、昆蟲(細胞)、兩棲類(細胞)、禽類(細胞)或哺乳動物細胞，包括人細胞。本發明內容中的示范性宿主細胞包括Vero (非洲綠猴腎)細胞、BHK (幼倉鼠腎)細胞、原代雛雞腎(PCK)細胞、Madin-Darby 狗腎(MDCK)細胞、Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞、293細胞(例如，293T細胞)和COS細胞(例如，C0S1、C0S7細胞)。流感病毒本文的組合物和方法主要涉及流感病毒疫苗的生產。流感病毒由含有分節段的單鏈RNA基因組的內部核糖核蛋白核心及具有基質蛋白襯里的脂蛋白外包膜構成。甲型流感病毒和乙型流感病毒各自含有單鏈負鏈RNA的8個區段。甲型流感病毒基因組編碼11種多肽。區段1-3編碼構成RNA依賴性RNA聚合酶的3種多肽。區段1編碼聚合酶復合物蛋白PB2。其余的聚合酶蛋白PBl和PA分別由區段2和區段3編碼。此外，一些流感病毒毒株的區段1編碼在PBl編碼區內由交替讀框產生的小蛋白PB1-F2。區段4編碼參與感染期間的細胞黏附和進入的血凝素(HA)表面糖蛋白。區段5編碼核衣殼核蛋白(NP)多肽，病毒RNA相關的主要結構組分。區段6編碼神經氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。區段7編碼由另路剪接mRNA翻譯的兩種基質蛋白，稱為Ml和M2。區段8編碼由另路剪接mRNA變體翻譯的 NSl和NS2，兩種非結構蛋白。乙型流感病毒的8個基因組區段編碼11種蛋白質。3個最大的基因編碼RNA聚合酶的組分PB1、PB2和PA。區段4編碼HA蛋白。區段5編碼NP。區段6編碼NA蛋白和NB 蛋白。蛋白NB和NA均由雙順反子mRNA的重疊讀框翻譯。乙型流感病毒的區段7也編碼兩種蛋白質M1和M2。最小的區段編碼兩種蛋白質由全長RNA翻譯的NSl和由剪接mRNA 變體翻譯的NS2。流感病毒疫苗歷史上，主要利用根據相關毒株的經驗性預測選出的病毒毒株在雞胚蛋中生產流感病毒疫苗。近年來，將選擇的血凝素和神經氨酸酶抗原摻入已批準的減毒的溫度敏感型主毒株中制備了重配體病毒。通過在雞蛋中傳代多次培養病毒后，回收流感病毒并任選，例如用甲醛和/或β丙內酯滅活(或者用于減毒活疫苗)。然而，以此方式生產流感疫苗有幾個明顯的問題。例如，雞蛋中殘留的污染物可以是高度抗原性和/或熱源性的，給藥后常可導致明顯的副作用。因此，另一方法包括利用不含動物(成分)的培養基替換一定百分比的雞蛋組分。更重要的是，通常必須在下一次流感季節前數月選擇和分發為疫苗生產所指定的病毒毒株，從而有時間生產和滅活流感疫苗。因此改進在儲存期間和/或在更方便的溫度(例如，約2-8°C的冷藏溫度，如本發明方法和組合物所用的溫度)下儲存的穩定性也是非常需要的。批準用于疫苗生產的一些毒株在標準細胞培養條件下不能充分生長阻礙了在細胞培養物中生產重組和重配疫苗的嘗試。因此，本發明人及同事先前的工作提供了載體系統和在培養物中生產重組和重配病毒的方法，從而能快速生產對應于一種或多種選擇的抗原性毒株的疫苗。參見，例如2002年4月沈日提交的美國專利申請號60/375，675 ;2003 年 4 月 25 日提交的 PCT/US03/12728 ；2003 年 4 月 25 日提交的 USSN 10/423, 828 ；2005 年 5月20日提交的PCT/US05/017734。當然，任選在雞蛋中進一步擴增這種重配(體)。通常在受控的濕度和(X)2條件下，利用溫度調節器，例如恒溫箱以確保溫度不超過35°C的恒定溫度下將培養物維持在諸如細胞培養箱的系統中。通過全部或部分利用本發明可進一步優化這種前驅性工作以及其它疫苗生產工作。通過引入對應于主流感病毒基因組區段的載體亞組聯同衍生自感興趣毒株(例如，感興趣的抗原性變體)的互補區段不難獲得重配流感病毒。通常根據與疫苗給予相關的所需特性來選擇主毒株。例如，為疫苗生產，如為生產減毒的活疫苗，可選擇減毒表型、冷適應和/或溫度敏感的主供體病毒毒株。
FluMis i 如上所述，流感疫苗有許多實例和類型。示范性流感疫苗FluMist是一種保護兒童和成年人免患流感疾病的減毒活疫苗(Belshe等，(1998)，“減毒的、冷適應的、三價、鼻 ^^^1 ^ Φ(The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children), N. Engl. J. Med. ,338 1405-12 ;Nichol等，(1999)，“減毒的鼻內流感病毒活疫苗在健康工作成人中的效力一 ^A 1 !!/!^^ :” (Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults -.a randomized controlled trial), JAMA, 282 137-44)。在典型的實施方案中，本發明方法和組合物宜適用于生產FluMist疫苗或與之聯用。然而，本領域技術人員應知道本文的步驟/組合物也適用于生產相似，或者甚至不同的病毒疫苗及其組合物。FluMist 疫苗毒株含有，例如衍生自該疫苗的野生型毒株的HA和NA基因區段聯同常規主供體病毒(MDV)的6個基因區段，PBU PB2、PA、NP、M和NS。通過在連續低溫下在原代雛雞腎組織培養物中連續傳代野生型A/ArmArbor/6/60 (A/AA/6/60)毒株制備了 FluMist的甲型流感病毒毒株的MDV(MDV-A) (Maassab, (1967)，“25°C時流感病毒的適應性禾口生長特性，，(Adaptation and growth characteristics of influenza virus at25degrees C)，Nature, 213 :612-4)。MDV-A 可在 25°C有效復制(ca，冷適應的)，但其生長在38和39°C受限(ts，溫度敏感的)。此外，該病毒在受感染雪貂的肺中不能復制(att，減毒的)。據信，ts表型可通過限制疫苗在最冷區域以外的所有呼吸道中復制從而導致其在人中減毒。動物模型和臨床研究證明了此特性穩定。與通過化學誘變產生的流感病毒毒株的ts表型相反，通過在受感染的倉鼠或在兒童的蛻皮分離物中傳代后MDV-A的此ts特性不回復(最近的綜述可參見Murphy和Coelingh，(2002)，“減毒的冷適應甲型流感病毒和乙型流感病毒活疫苗的開發原理和應用”(Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines), Viral Immunol. , 15 :295-323)。在20，000以上的成人和兒童中進行的涉及12種不同6 2重配毒株的臨床研究顯示這些疫苗是減毒、安全而有效的(Belshe等，(1998)，“減毒的、冷適應的、三價、鼻內
胃；) ^^ 中的雙力，，(The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children), N. Engl. J. Med. ,338 1405-12 ；Boyce等，QOOO)，“鼻內給予健康成人的加佐劑和未加佐劑亞單位流感疫苗的 $ "生禾口；feHi 生，，(Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults), Vaccine, 19 :217-26 ；Edwards等，(1994)，“用于預防甲型流感疾病的冷適應和滅活疫苗的隨機對照試驗，，(A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease), J. Infect. Pis. , 169 :68-76 ； Mchol等，(1999)，“減毒的鼻內流感病毒活疫苗在健康作成人中的效力一項隨機對照 1 :" (Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults :a randomized controlled trial), JAMA, 282 :137-44)。攜帶 MDV-A的6個內部基因和野生型病毒的兩個HA和NA基因區段的重配體(即，6 2重配體)始終保留了 ca、ts和att表型(Maassab等，(1982)，“在雪貂中評估低溫重組流感病毒疫苗，，(Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets)， J. Infect. Pis.，146 :780-900)。然而，利用乙型流感病毒毒株制備這種重配病毒更困難。近年來的工作可參見，例如2002年4月沈日提交的美國專利申請號60/375，675 ； 2003 年 4 月 25 日提交的 PCT/US03/12728 ；2003 年 4 月 25 日提交的 USSN 10/423，828 ；2005 年5月20日提交的PCT/US05/017734 ；這些文獻公開了用于完全從克隆的cPNA制備乙型流感病毒的8種質粒系統，和適用于疫苗制劑(例如用于鼻內給予的病毒活疫苗制劑)的減毒活甲型流感病毒和乙型流感病毒的制備方法。上述系統和方法可用于在細胞培養物中快速生產重組和重配甲型流感病毒和乙型流感病毒，包括適合用作疫苗，包括減毒活疫苗(例如適用于鼻內給予的疫苗，如 FluMist(D)的病毒。本發明方法任選與涉及(例如)用于疫苗生產的先前工作所制備的重配流感病毒聯用或組合從而以更穩定、均一和多產的方式生產用于疫苗的病毒。細胞培養如上所述，流感病毒任選在細胞培養物中生長。一般在常規培養宿主細胞的培養基組合物中實現病毒增殖。用于流感病毒復制的合適宿主細胞包括，例如Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞和COS細胞，包括細胞、C0S7細胞。通常利用例如1 1比例
22的兩種上述細胞系，例如MDCK細胞和或COS細胞的共同培養物來提高復制效率。細胞一般在適合于維持緩沖液中性pH(例如，介于7. 0-7. 2間的pH)的受控濕度和(X)2下，在標準商品化培養基，例如補加血清(例如，10%胎牛血清)的Dulbecco改進Eagle培養基， 或不含血清的培養基中培養。培養基任選含有抗生素，例如青霉素、鏈霉素等以防止細菌生長，和/或其它營養素，例如L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、其它補充物質，例如胰蛋白酶、巰基乙醇等以促進有利的生長特征。在培養基中維持哺乳動物細胞的方法已有大量報道且為本領域技術人員所熟知。通用方法可見，例如Freshney，(198 ，《動物細胞培養基礎技術手冊》(Culture of Animal Cells =Manual of Basic Technique)，Alan R. Liss，紐約；Paul， (1975)，《細胞禾口組織培養》(Cell and Tissue Culture)，第五版，Livingston 編，愛丁堡；Adams，(1980)， 《生物化學家的生物化學和分子生物學-細胞培養的實驗室技術》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists)， Work 禾口 Burdon編，Elsevier，阿姆斯特丹。在流感病毒體外生產中特別感興趣的組織培養方法有關的其它細節包括，例如Merten等，(1996)，“在細胞培養物中生產用于疫苗制備的流感病毒，，(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation), 刊于Cohen和Shafferman編，《疫苗設計和生產的新方法》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)，該文獻出于所有目的全文納入本文作為參考。此外，通過常規實驗不難確定適應于本發明的這些方法中的改變，而本領域技術人員所熟悉這些改變。在本發明一具體實施方案中，在存在或不存在胰蛋白酶和不含血清的條件下，在以下溫度范圍內培養和/或感染本發明宿主細胞30°〇-391;或301、或311、321、331、 34°C、35°C、36°C、37°C、38°C或 39°C。可在含有血清或不含血清的培養基中培養用于生產流感病毒的細胞。在一些情況中，例如制備純化的病毒，通常需要在不含血清的條件下培養宿主細胞。可以小規模，例如在低于25ml培養基中，在培養試管或培養瓶中，或采用攪拌的大瓶，搖瓶，或在燒瓶、瓶或反應器培養液的微載體珠上(例如，DEAE-Dextran微載體珠，如Dormacell， Pfeifer&Langen ；Superbead, FlowLaboratories ；苯乙煉共聚物一三 _ 甲胺珠，例如 Hillex, SoIoHill, Ann Arbor)培養細胞。微載體是能為每份細胞培養液體積的黏附細胞生長提供大表面積的小球體(直徑為100-200微米)。例如，1升培養基可含有兩千萬以上的微載體珠，這些微載體珠能提供8000平方厘米以上的生長表面。對于病毒的商品化生產，例如疫苗生產，往往需要在生物反應器或發酵罐中培養細胞。可用的生物反應器的容積從1升到100升以上，例如Cyto3生物反應器(Osmonics, Minnetonka, MN) ；NBS生物反應器(New Brunswick Scientific, Edison,新澤西)；B. Braun Biotech International 的實驗室和工業化規模的生物反應器(B. Braun Biotech, Melsungen，德國)。無論培養液的體積，在本發明的許多理想方面，重要的是將培養液維持在合適溫度從而確保能利用溫度依賴性多質粒系統(參見，例如上文引用的用于流感病毒生產的多質粒系統)，(通過)加熱用于過濾的病毒溶液等來有效回收重組和/或重配流感病毒。通常利用調節器，例如恒溫箱或感測和維持細胞培養系統和/或其它溶液溫度的其它裝置來確保合適時期(例如，病毒復制期等)的溫度處于正確水平。在一些方法中(例如，其中要從載體上的區段制備重配病毒)，根據本領域將異源核酸引入真核細胞的熟知方法將含有流感(病毒)基因組區段的載體引入(轉染)宿主細胞，所述方法包括，例如磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射、脂轉染和利用聚胺轉染試劑轉染。例如，可根據生產商的使用說明書利用聚胺轉染試劑TransIT-LTl (Minis)將載體(如質粒)轉染入宿主細胞，例如COS細胞、293T細胞或COS或細胞和MDCK細胞的混合物中，從而產生重配病毒等。待引入宿主細胞群的約Iyg各載體與約2μ1 TransIT-LTl 用160 μ 1培養基(優選不含血清的培養基)稀釋，終體積200 μ 1。DNA 轉染試劑混合物在室溫培育45分鐘，然后加入800 μ 1培養基。向宿主細胞中加入此轉染混合物，如上所述或通過本領域技術人員熟知的其它方法培養細胞。因此，為在細胞培養物中制備重組或重配病毒，將摻有8個基因組各個區段(ΡΒ2、PBU PA, NP、M、NS、HA和NA)的載體與約20 μ 1 TransIT-LTl混合，轉染入宿主細胞中。任選用不含血清的培養基，例如Opti-MEM I替換含血清的培養基，再轉染并培育4-6小時。或者，可采用電穿孔將摻有流感(病毒)基因組區段的這種載體引入宿主細胞中。 例如，優選根據以下方法用電穿孔將摻有甲型流感病毒或乙型流感病毒的質粒載體引入 Vero細胞中。簡言之，例如將生長在補加10%胎牛血清(FBS)的改進fegle培養基(MEM) 中的約5 X IO6個Vero細胞重懸于0.4μ 1 OptiMEM中，置于電穿孔小杯中。向該小杯細胞中加入20微克DNA至體積25 μ 1，然后輕扣混合。根據生產商的使用說明書(例如，連有 Capacitance Extender Plus 的 BioRad Gene Pulser II)以 300 伏、950 微法禾口 28—33 毫秒的時間常數進行電穿孔。輕扣重新混合細胞，電穿孔后約1-2分鐘直接在小杯中加入含 10% FBS的0. 7ml MEM。然后將細胞轉轉入含有^iil MEM, 10% FBS的標準6孔組織培養皿的兩個孔中。洗滌小杯以回收任何剩余的細胞，洗滌懸液分入所述兩個孔中。終體積約 3. 5mL。然后在允許病毒生長的條件下(例如冷適應毒株的約33°C)培育細胞。參見，例如納入本文作為參考的US20050158342。試劑盒為有利于本發明方法和組合物的使用，可將任何疫苗組分和/或組合物，例如各種制劑中的病毒等，和為實驗或治療性疫苗目的包裝和感染流感病毒的其它組分，如緩沖液、細胞、培養基包裝成試劑盒形式。除了上述組分外，試劑盒通常含有其它材料，包括，例如執行本發明方法的使用說明書、包裝材料和容器。實施例1開發液體FluMist根據方案先著手(制備)了總共19批病毒單價散裝液，包括4個開發批(CB0006H、 CB0008H、CG0017H、CB0018H 和 CB0019H)。制備了 CB0018H 和 CB0019H 批為各種研究提供材料，本申請書中不對它們進一步討論。超離心步驟后，合并兩批(CB00180H和CBOO 12H)以產生A/悉尼單價散裝液CB0020H。各批以約2000枚蛋開始。建立類似于生產冷凍FluMist所用方法的蛋處理和孵育條件，然而因為規模較小等原因采用手工接種和收集。超離心方法按比例縮小為同一生產商制造的較小裝置 (Discovery 90，Hitachi制造，由SorvalΙ/heraus投放市場)，該裝置配有總容量約470mL 的P32CT型轉頭。將澄清、穩定的病毒收獲液加載于20%-60%蔗糖梯度層上，以32，OOOrpm 離心展開區帶1小時，流出液分為20mL的組分。合并含有HA峰水平的組分，稀釋為0. 2M 蔗糖濃度，經0.2微米濾膜過濾，然后轉移入250mL柔性聚合物袋(Stedim)中，冷凍并維持于-60°C以下用于進一步生產。簡短的幾次試驗運作后，開始cGMP生產以支持液體FluMist的其它臨床試驗。再次生產A/北京Λ62/95 (HlNl)和A/悉尼/05/97 (H3N2)，乙型毒株更換為B/ Yamanashi/166/980冷凍并運輸生產的單價散裝液用于混合、充填和包裝。當然應該知道在本文中，除非另有專門表述，利用的具體毒株(例如，北京等)不一定理解為是限制性的。 因此，例如，本文的方法和制劑在各流感季節時可任選利用不同毒株來產生不同的RTS組合物等。開發和臨床試驗開發了液體組合物的(生產)方法，包括單價散裝液批CAZ001-0M和 CAZ035-043。臨床試驗的材料(CTM)包括單價散裝液批CAZ025-CAZ034。為CTM-I開發和使用的液體FluMist生產方法分為以下6個不連續的加工階段。 與采用獨立的生產指令文件所進行的一樣，加工階段1-5規定為符合主要加工步驟。步驟 6包括完全混合及充填過程。應知道這些階段在總體上可粗略地相當于下文概述的疫苗組合物生產的通用步驟。■階段1 :SPF蛋的接受和消毒處理；階段2 病毒收獲物的生產；階段3 區帶離心濃縮；階段4 峰組分的合并和稀釋；階段5 除菌過濾和單價散裝液儲存；和階段6 混合及充填。圖1顯示了 CTM-I單價散裝液生產的流程圖。圖2顯示了混合及充填加工流程。SPF蛋的接受和消毒無特定病原體(SPF)的胚蛋購自SPAFAS，Inc.，該公司采用指定的禽群管理和監督程序以恰當確保提供無病蛋。蛋在美國產下，用Clorwash和Quat 800噴霧劑消毒。然后通過航空和公路，利用足以維持清潔度并能避免冷凍或過熱的包裝來運輸這些蛋。收到后，檢查冷的受精蛋，在14°C +/-2°C，60-80%相對濕度(RH)下在SPF培育箱中最多儲存7 天。將蛋從買方提供的紙板盒中轉移至托盤，給予批號。將蛋置于可裝36只蛋的Jamesway 托盤上，利用自動蛋消毒系統以Chlorwash和Quat 800消毒蛋殼表面從而盡可能降低生物負載，然后將它們放入培養箱中。在43-44°C和48-49°C的范圍制備Chlorwash，在48_49°C 的范圍制備Quat 800。消毒后，將蛋放在推車上，在室溫下空氣干燥不少于2小時。然后將蛋放入培養箱中，在37. 50C +/-I0C,60-80% RH下孵育264小時+/-12小時。孵育后，將 SPF蛋從SPF蛋室轉移至透光檢驗區。用光纖燈確定每個蛋中氣囊的位置。棄去死蛋和未受精的蛋，給受精蛋作標記用于接種。制備病毒收獲物先用70%工業用甲醇變性酒精(IMQ對受精蛋進行表面消毒，再接種，然后轉移用于大量接種。在制備稀釋的生產商工作病毒種子(MWVS)中，采用經典重配方法制備用于生產臨床I期試驗用的MWVS的主病毒種子。將MWVS轉移入AVU，在微生物安全櫥中用無菌0. OlM磷酸緩沖鹽水(pH 7.7)配制融化的MWVS的連續稀釋液，每次移液使用無菌的一次性移液管。在10，000級房間中用半自動Bibby接種器在層流條件下進行接種，該接種器刺穿并接種36枚蛋/托盤。接種物的目標滴度是每log1(12. lTCID50/0. lmL，從MWVS的預測滴度計算稀釋度。從冷凍機中取出病毒后兩小時內完成各病毒接種物的制備。將該接種物的等份試樣在5+/-3°C儲存待用。接種物應在制備后8小時內使用。SPF蛋的接種將各托盤的蛋手工放入BilDby自動接種器中。利用沖頭刺破蛋殼，刺入蛋中預定深度。接種針伸入蛋中，給藥泵將0. ImL MWVS接種物遞送入每枚蛋中，然后取出沖頭。接種后，操作人員拿走蛋托盤，用一托盤新的蛋重復該過程。CAP/接種的蛋在33+/-l°C孵育時間通過病毒毒株生長曲線確定。孵育后，將SPF胚蛋在冷藏18+/-6小時。冷藏結束后，將蛋移出用于收集步驟。區帶離心濃縮病毒病毒收獲物(VH)利用自動收集器(Bibby)收集蛋。將托盤手工放入去頂站(decapitation station)，除去蛋殼上部從而形成收集針可進入的進入孔。目測觀察這些蛋，然后收集并棄去不合適的蛋(例如，變色的)。將可接受的蛋放于收集站(harvest station)，利用針頭和真空系統抽吸取出尿囊液。收集收獲物，混合后裝入100L有夾套的不銹鋼容器，夾套溫度為2-8°C。從VH合并物中采集病毒收獲物的樣品并檢測效力(TCID5tl)、安全性、禽類白血病(病毒)、結核分枝桿菌、支原體、外來病毒、均一性、逆轉錄酶試驗、病毒基因型、病毒表型和減毒(情況)。穩定和澄清在2_8°C將合并的病毒收獲物(VH)立即用終濃度為0.2M蔗糖、0. OlM磷酸、 0. 005M谷氨酸(SPG)配成10 X SPG (9份VH對1份IOX SPG)而穩定。采集樣品進行效力和生物負載(檢測)，然后澄清。穩定的病毒收獲物經5μπι深過濾澄清除去顆粒，然后用高速連續流式離心純化。澄清的病毒收獲物取樣(檢測)效力。區帶離心、收集和峰組分的HA試驗使用前，用濃縮甲醛溶液的1 20稀釋液消毒離心機轉頭。將澄清的VH加樣于蔗糖梯度(磷酸緩沖液配制的10-60%蔗糖，ρΗ 7. 2)層中，利用Hitachi區帶離心機進行連續高速離心。向離心機中加入磷酸緩沖液配制的60%蔗糖溶液，再加入10%蔗糖溶液形成梯度。離心機速度設置為4，OOOrpm，20分鐘以使蔗糖溶液形成密度梯度。梯度形成期間離心機溫度設置為2-8°C。梯度形成后，啟動緩沖液流，轉頭速度提高至40，OOOrpm,然后將澄清的VH在40，OOOrpm時以20L/小時的速度加樣于梯度液上。對于收獲了 10，000個蛋和 6mL/蛋的典型CTM-I批，加樣步驟持續時間是約3小時。澄清的VH加樣后，以40，OOOrpm 繼續離心1小時以使病毒形成條帶。病毒顆粒遷移至38-45%蔗糖梯度部分，濃縮為一條 “帶”。此步驟結束時，離心機逐漸減速，然后停止以收集病毒峰。在層流下將IOOmL諸組分收集于125mL滅菌聚碳酸酯瓶中。諸組分維持于2-8°C約1小時，同時檢測組分的HA活性。 峰組分通常發現介于38-45%蔗糖梯度間。峰組分的合并和稀釋在層流罩下將諸組分無菌倒入5L滅菌玻璃瓶中以合并經HA試驗鑒定的離心后峰組分，渦流混合。讀取折射指數(RI)以測定蔗糖濃度，合并物取樣以(檢測)效力。加入適當體積的滅菌冷磷酸-谷氨酸緩沖液，pH 7. 2 (PBG緩沖液配制)至終濃度為 0.2M蔗糖、0. IM磷酸和0.005M谷氨酸以稀釋離心后峰組分合并物(CP)。這通常是1 6 稀釋液。稀釋的離心后峰組分合并物(DCP)取樣(檢測)效力和生物負載。
除菌過濾和單價散裝液儲存將DCP經滅菌管道泵入用于除菌過濾的100級填充室。在層流空氣罩(Laminair Air Flow hood)下用0. 22 μ m濾膜將DCP除菌過濾入滅菌的5L玻璃瓶中。混合過濾的單價散裝液，取樣用于效力、均一性和無菌性檢驗。過濾前后檢查0.22 μ m濾膜的完整性。然后將MB等份加入滅菌的IL聚碳酸酯瓶中。以500mL等份收集MB，總體積為3-4升。滅菌的1升PC瓶在_60°C或更低儲存。通過TCID50試驗測定散裝病毒的滴度。然后在< _60°C 運輸單價散裝液用于混合和檢驗。混合和充填制備散裝三價混合液的混合和充填過程的主要步驟是融化、制備稀釋液、混合、 充填和包裝。融化和混合從冷凍儲存物(MB < -60°C )中取出合適的1瓶單價散裝液，轉移至融化室。根據散裝液感染力滴度和所需的制劑強度計算三份散裝液各自的和SPG稀釋劑的所需用量。將各瓶MB放入33 士 3°C水浴中，每5分鐘手工攪拌一次。目測監測融化情況以確保所有瓶子均融化，然后拿出水浴，每15分鐘拿出所有融化的瓶子。一旦融化，將各瓶MB轉移至5 士 3°C 的冰箱中，保存至所有所需瓶子均融化。滅菌的蔗糖磷酸谷氨酸(SPG)稀釋液由BioWhittaker (Walkersville，MD)生產。 將混合所需的約三分之一用量SPG稀釋液加入滅菌的2-L瓶中，立即制備液體FluMist混合物。瓶子暖至室溫，然后加入所需含量的水解豬明膠(粉末)使最終混合物中達到IOmg/ ml水平。然后使SPG稀釋液通過濾膜(洗去任何殘留的明膠)從而達到混合物計算的目標體積，在5士3°C儲存待用。將融化的瓶子轉移至混合室，將病毒無菌轉移至5L玻璃處理容器中。在混合過程以及隨后的充填過程中利用冷藏冰袋使該容器維持于5士3°C。加入3種病毒毒株后加入 SPG-明膠稀釋液，如果需要可用HCl將pH調節至7. 2士0. 3。利用磁性攪拌棒和攪拌盤連續攪拌混合這3種病毒毒株和稀釋液。充填和包裝調節pH后，將散裝三價混合液容器轉移至填充室并與INOVA充填機連接。INOVA 充填機將預定體積的產物填入一列八個BD HYPAK—次性噴霧器中，然后給噴霧器加塞。按照指導連續進行噴霧器充填和加塞操作及重量核查驗證。每次充填循環完成后，將一批新的噴霧器手工置于進料臺中，將已充填的噴霧器移至卸貨臺。充填過程中用冰袋使混合容器維持于5士3°C。鼻噴霧器充填后，將充填的三價疫苗(噴霧器)放入桶中，立即用推車運至包裝區作最后包裝和標記。包裝和標記好的噴霧器于5士3°C儲存。優化上游操作參數通過過濾(5μπι)澄清收獲物過濾與低速離心對于冷凍FluMist，采用標準低速離心法澄清后效力損失一般估計是0. 2-0. 310g1(1TCID5(1/mL。兩種毒株的估計離心損失是采用標準條件3400g，20分鐘，一種毒株的滴度損失可忽略不計，第二毒株是0. 31og (59%步驟產率)。當在前-CTM生產運作中用5微米深過濾作為離心的替代方案時，澄清步驟平均產率估計是41%。當考慮到TCID5tl試驗存在差異時，結論是任一澄清方法提供的結果優于澄清后加入方法。根據操作的難易和可否擴大規模，選擇過濾作為澄清方法。深過濾膜孔徑的比較利用開發批CAZ015-CAZ017加上10批 CTM-I (CAZ025-CAZ034)評估了用CTM-I方法的深過濾損失。對于5 μ m澄清步驟，A/北京、 A/悉尼和B/哈爾濱的澄清步驟產率分別是147%、78%和73%。5ym(Pall Profile II)濾膜與用于批次 CAZ035 (A/悉尼)、CAZ036 (A/北京)和 CAZ037 (B/哈爾濱)的20 μ m深過濾膜(Pall Profile Star)作比較。對于20 μ m澄清步驟，A/北京、A/悉尼和B/哈爾濱的澄清步驟產率分別是65%、35%和209%。這些產率與 5 μ m澄清結果相當，然而對于所有的實施方案不推薦將此方法改變為20 μ m濾膜，因為當利用較大孔徑時紅細胞會顯著污染澄清的收獲物。優化下游操作參數離心規模利用大規模CP40Y離心機和RP40CT D型連續流式轉頭進行離心機加樣和溫度研究；比較了不同批蛋的多少和離心機溫度設定值(參見圖3)。CA0Z15(B/哈爾濱)、 CAZO18 (A/悉尼)、CAZ020 (A/北京)和CAZ022 (A/悉尼)批為IOK個蛋，離心機設定溫度為40C。CAZ 016 (B/哈爾濱)、CAZO19 (A/悉尼)和CAZ021 (A/北京)批為20K個蛋，離心機設定溫度為14°C。所有研究均采用20L/小時的加樣流速。稀釋的峰組分合并物的回收百分比(步驟產率)以圖中澄清收獲物滴度為基礎。由此可看出，每批IOK個蛋的回收率為40-184%，而每批20K個蛋的回收率為40-55%。IOK批次大小的平均回收率是113%， 20K個蛋的批次的平均回收率是46%。在該開發工藝的此步驟中，選擇每批運作10，000個蛋作為CTM生產的保守性限制。溫度采用4°C或14°C為超速離心機轉頭的設定溫度進行CAZ015-CAZ022的開發運作。 一個例外是也以大于典型(每批20，000個蛋)的規模進行了 14°C的開發運作。總體上這些批次的活病毒回收率較低，然而這可能是因為離心機加樣而非溫度的影響。鑒于4°C的結果較好以及較高溫度可能增加微生物的生長速率，選擇4°C作為此開發工藝中此時的超速離心機溫度設定值。臨床試驗1 (CTM-I)制備了多批用于CTM-I的單價病毒，包括單價散裝液批次CAZ025-CAZ034。圖3和本文給出了 CTM-I單價散裝液各批加工過程中的QC試驗結果。圖3和本文給出了每種毒株的平均步驟產率。結果總結于下。效力B/哈爾濱和A/北京病毒收獲物各批的效力(IogiJCID5cimL)等于或大于 8. 1。A/悉尼的滴度為7. 5-8. 8，除了 CAZ030因收獲物中有蛋黃污染而顯示滴度非常低 (6. 0)。A/北京的單價散裝液的滴度是9. 3或更高，B/哈爾濱的滴度是8. 4-9. 85，A/悉尼的滴度是7. 9-8. 6 (不包括CAZ030)。CAZ030的滴度低于下文討論的混合物可接受水平。工藝產率各批次的工藝產率見附圖，本文將進一步討論。未對取樣損失而校正工藝產率。A/北京的平均總工藝產率是16% (163劑量/蛋)，A/悉尼的平均產率是13% (6 劑量/蛋)，B/哈爾濱的平均產率是93% (86劑量/蛋)。參見附圖。不穩定的(erratic) 產率估計值反映了試驗存在差異以及該工藝的實際性能。具體地說，B/哈爾濱因CAZ(^8批單價散裝液滴度的極高估計值而向上歪斜(導致估計的工藝產率為252%和246劑量/ 蛋)。在該情況中測定到稀釋的峰合并物的滴度比離心后峰合并物的高0. 951og，雖然因為稀釋而估計會降低。同樣，經過濾的單價散裝液滴度高于預先過濾物質的，這可通過試驗存在差異得以解釋。其它兩批B/哈爾濱(CAZ(^6和CAZ027)的工藝產率分別是20%和8%， 這兩批的蛋產率是7劑量/蛋。含有CAZ(^8批(CBF1004和CBF1007)散裝液的三價混合物導致最終產品噴霧劑的B/哈爾濱每劑效力為0. 6和0. 41og10TCID50O這進一步提示高估了 CAZ(^8單價散裝液滴度。生物負載和內毒素檢驗病毒收獲物、穩定的收獲物和稀釋的離心后峰組分的生物負載。生物負載檢驗結果未能給出通過該工藝后生物負載的清晰圖像，對于病毒收獲物和稀釋的離心后峰組分合并樣品的檢驗結果基本上由“未檢測的” (8個讀數)；或具有兩個中間數值的“> 100cfU/mL”(10個讀數)構成。單價散裝液的內毒素值為<5EU/mL-587EU/
mLo蔗糖濃度離心后峰組分合并物的蔗糖濃度是39-43. 5% (CAZ030未包括于此范圍中)。單價散裝液的平均蔗糖濃度是7.6%。單價散裝液放行試驗結果見附圖。除CAZ030(未測試)外用于CTM-I的所有批次均通過了散裝液放行試驗。SDS-PAGE分析用Gel Code Blue染色的10% SDS-PAGE進一步特征鑒定了單價散裝液。根據計算的甲型流感病毒和乙型流感病毒每個顆粒的蛋白質分子量和拷貝數，預計50-60kDa(Hal蛋白)、56kDa(NP蛋白)和27kDa(Ml蛋白)區域的凝膠條帶是純化流感病毒凝膠中主要的條帶。也可能存在Ha2蛋白Q3-30kD)。比較了 A/ 北京 /262/95CAZ031 和 33 與 A/ 悉尼 /05/97CAZ(^9、30 和；34 的 SDS-PAGE 凝膠。10%凝膠的分辨率范圍通常是200-3IkDa。因為此局限性，應謹慎地對HAl蛋白 (23-30kDa)和M蛋白條帶(21-27kDa)作出解釋。對于A/北京和A/悉尼各批單價散裝液(MB)，A/北京樣品在預計的NP蛋白(恰在55kDa標記物之上)區域觀察到暗條帶，兩種毒株均觀察到恰在116kDa上有一條帶。兩種毒株在接近凝膠前端(低于3IkD)含有與M蛋白一致的條帶。預計處于66kD標記或恰好在其之上的HAl條帶強度較弱，可能是因為糖蛋白分子量的異質性導致更分散的條帶模式。此推測的NPl蛋白染色似乎也有所降低。A/悉尼樣品觀察到更寬的多種條帶，這與該單價散裝液中雞蛋蛋白質比例較高一致。每批和每只蛋的劑量根據含有1. 2E+07TCID50顆粒的0. 24mL平均充填體積計算所有三種毒株的劑量。根據以上劑量計算，各批A/北京單價液的每批平均總劑量是 1，576，022。B/哈爾濱和A/悉尼每批平均總劑量分別是601，446和50，825劑量，或者A/ 北京的每批平均總劑量分別是38%和3. 2%。這些結果轉變為以下單價劑量值/蛋Al北京為163劑量/蛋；B/哈爾濱樣為86劑量/蛋和A/悉尼為6劑量/蛋。根據收獲用于制備該批的蛋總數計算劑量/蛋。蛋產率總結Al悉尼每個蛋產量的平均收獲體積最高，其后是A/北京和B/哈爾濱。B/哈爾濱的每個蛋產量平均為5. 6mL/蛋，A/北京是6. 5mL/蛋和A/悉尼是6. SmL/蛋。 存活蛋的總產率平均為82%。蛋產率以收獲的蛋的總數與用于生產的蛋的總數比較為基礎。接種前棄去的蛋百分比平均是10%。接種后棄去的百分比平均是5%，除了 CAZ(^8的棄去率是外。純化產率總結(TCID50)—些批次的澄清收獲物的效力值高于初始物質，導致步驟產率超過100%。步驟產率的估計值受TCID50試驗差異的影響，該試驗在生產運作時的標準偏差在0. 31og10TCID50/mL以上。此外，所有3種毒株的稀釋離心后峰組分合并步驟的步驟產率變化很大，所有10批CTM的步驟產率大于100%。這似乎是因為離心后峰組分合并物的滴度存在系統性向下偏移(如下一步驟的產率> 100所提示的那樣)，有人認為與這些樣品中的蔗糖水平高有關。CTM-I各批的評價在本文的各種實施方案和實施例中，優選收獲物液沒有蛋黃污染，這種污染可能發生在，例如收獲器設置不恰當時。0.2微米過濾步驟有效批記錄指定Mil Kleenpak—次性濾膜，然而不是任何CTM批次均使用該濾膜。CAZ025-030各批使用具有外殼的筒式(cartridge)濾膜(AB 1DFL7PH4-Pall親水性PVDF Fluorodyne II濾膜)以替代Kleenpak。這些濾膜的構成材料相似(親水性PVDF膜)，然而Fluorodyne II筒式濾膜的濾膜面積是5100cm2，而Kleenpak Fluorodyne II 濾膜的濾膜面積是 1500cm2。CAZ031/032/033/0;34 各批使用一次性 Pall NovaSip C3DFLP1濾膜組件代替Kleenpak。C3DFLP1濾膜的膜表面積與Kleenpak濾膜相同 (1500cm2)。溫度偏移在CAZ031的第二孵育步驟期間，溫度升至34. 4°C，13小時，CAZ032的溫度降低至31. 5°C，4小時。這些批次達到9. 01ogl0TCID50/mL以上的正常收獲物滴度，因此不認為(溫度)偏移對產品有影響。根據兩次臨床試驗生產階段(CTM-I和CTM-2)，液體FluMist工藝的開發和生產工作表明該工藝適合于生產能通過放行條件的臨床供給品。CTM運作和各種開發研究的組合數據得到了該工藝中值產率的以下估計值澄清50%產率超速離心機純化50%產率峰稀釋和除菌過濾20-50%產率實施例2穩定性檢驗制備含有三種不同的重配流感病毒(7. 0+/-0. 51oglOFFU/劑量[約 7. 0+/-0. 51oglOTCID5(1/劑量])和以下物質的三價疫苗制劑100mM磷酸鉀緩沖液(pH7. 2) 配制的200mM蔗糖；(w/v)豬明膠水解物；1.21% (w/v)單鹽酸精氨酸[等于(w/v) 精氨酸堿]；和5mM谷氨酸單鈉。將該制劑在-25.0°C+/-5.0°C儲存大于或等于對小時，但小于或等于兩周，然后在2-8°C儲存不同時期(來檢測)其穩定性。測定到該制劑(例如， 批次0141500003)在4-8°C至少能穩定12周。具體地說，4_8°C儲存時，各病毒毒株的效力維持在初始效力的0.51og 10以內。其它研究顯示不同臨床批的等價制劑在5.0°C +/_3.0°C能穩定約12-15 個月，所述制劑含有三種不同的重配流感病毒(7. 0+/-0. 51oglOFFU/劑量[約 7. 0+/-0. 51oglOTCID50/ 劑量])和 IOOmM 磷酸鉀緩沖液(pH 7. 2)配制的 200mM 蔗糖；1% (w/v)豬明膠水解物；1. 21% (w/v)單鹽酸精氨酸[等于(w/v)精氨酸堿]；和5mM谷氨酸單鈉。隨后的研究顯示只含有IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH 7. 2)配制的200mM蔗糖；(w/ ν)明膠水解物；1. 21% (w/v)單鹽酸精氨酸[等于(w/v)精氨酸堿]而沒有谷氨酸鹽的制劑的穩定性與含有谷氨酸鹽的上述制劑相等。盡管出于清晰和理解的目的描述了上述發明的一些細節，但本領域技術人員閱讀本文內容后應明白可對形式和細節作出各種改變而不脫離本發明的真正范圍。例如，上述所有技術和裝置可以各種組合使用。如同單獨每篇出版物、專利、專利申請或其它文件單獨表明出于所有目的納為參考那樣，本申請書中引用的所有出版物、專利、專利申請或其它文件出于所有目的全文納為參考。具體地說，2004年10月6日提交的美國臨時申請號 60/616,711 ；2004年2月25日提交的美國專利申請10/788，236 ；和2003年2月25日提交的美國臨時申請號60/450，181全文納入本文作為參考。
權利要求
1.一種制備流感病毒組合物的方法，所述方法包括(a)過濾澄清包含冷適應活流感病毒的病毒收獲物，從而得到包含冷適應活流感病毒的澄清的病毒收獲物濾液；(b)對所述包含冷適應活流感病毒的澄清的病毒收獲物濾液進行連續區帶離心，從而得到包含冷適應活流感病毒的進一步澄清的病毒收獲物；和(c)對所述包含冷適應活流感病毒的進一步澄清的病毒收獲物進行稀釋和通過無菌過濾進行除菌，從而得到冷適應的活流感病毒組合物。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷適應流感病毒包括以下一種或多種 減毒的冷適應流感病毒，溫度敏感型冷適應流感病毒、或減毒的減毒的冷適應性溫度敏感型流感病毒。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷適應流感病毒含有一種或多種以下流感病毒的遺傳骨架A/Ann Arbor/6/60 和 B/Ann Arbor/1/66。
4.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，通過在澄清之前加入穩定劑使得所述病毒收獲物在2-8°C穩定。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述穩定劑包含蔗糖、磷酸鹽和谷氨酸鹽 (SPG)。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，加入所述穩定劑使得最終濃度為0.2M蔗糖、 0. OlM磷酸鹽和0. 005M谷氨酸鹽。
7.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，通過一個或多個濾器作深部過濾來澄清所述病毒收獲物。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，在(a)中通過兩個或更多個濾器來澄清所述病毒收獲物。
9.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，通過5μπι濾器進行過濾來澄清所述病毒收獲物。
10.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，在蔗糖密度梯度上進行所述連續區帶離心。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述蔗糖密度梯度是磷酸鹽緩沖液配制的10% -60%蔗糖梯度。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液配制的所述蔗糖梯度為ρΗ7. 2。
13.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，在2°C_8°C的溫度下進行所述連續區帶離心。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，在4°C的溫度下進行所述連續區帶離心。
15.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，加入包含磷酸鹽和谷氨酸鹽的稀釋劑以進一步澄清步驟(c)中的病毒收獲物。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，向所述進一步澄清的病毒收獲物中加入所述稀釋劑使得最終濃度為0. 2M蔗糖、0. IM磷酸鹽和0. 005M谷氨酸鹽。
17.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，包括混合所述除菌病毒收獲物與至少一種其它除菌病毒收獲物，從而得到混合的病毒收獲物。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述除菌病毒收獲物與兩種其它除菌病毒收獲物混合，從而得到三價混合病毒收獲物。
19.如權利要求17所述的方法，其特征在于，用IOOmM磷酸鹽緩沖液稀釋所述混合病毒收獲物至終濃度為6-8%蔗糖重量/體積(w/v) ；1-2%精氨酸W/V;0.05-0. 谷氨酸單鈉w/v ；和0. 05-2%明膠水解物；從而得到液體冷藏穩定的并且在4°C _8°C儲存12個月后其效力損失低于1. Olog的流感病毒組合物。
20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，用IOOmM磷酸鹽緩沖液稀釋所述三價混合病毒收獲物至終濃度為6-8%蔗糖重量/體積(w/v) ； 1-2%精氨酸w/v ；0. 05-0. 谷氨酸單鈉w/v ；0. 05-2%明膠水解物；從而得到液體冷藏穩定的并且在4°C _8°C儲存12個月后其效力損失低于1. Olog的流感病毒組合物。
21.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中先進行稀釋再除菌。
22.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中通過0.2微米到1. 5微米的濾器進行過濾來澄清所述病毒收獲物。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中通過0.2微米到0.8微米的濾器進行過濾來澄清所述病毒收獲物。
24.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中通過深部濾器作過濾來澄清所述病毒收獲物。
25.如權利要求M所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中通過0.2微米到0.8微米的濾器作深部過濾來澄清所述病毒收獲物。
26.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，包括配制所述除菌病毒收獲物，從而得到適合鼻內給藥的流感病毒組合物。
27.如權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其特征在于，包括配制所述除菌病毒收獲物，從而得到適合給予人的流感病毒組合物。
全文摘要
提供了用于優化和生產冷藏溫度穩定的病毒(例如流感病毒)組合物的方法和組合物。提供了含有冷藏溫度穩定的病毒組合物的制劑和免疫原性組合物。
文檔編號A61P31/16GK102302773SQ20111027093
公開日2012年1月4日 申請日期2005年10月4日 優先權日2004年10月6日
發明者G·坎寶, G·特拉格, R·施瓦茨 申請人:米迪繆尼有限公司