專利名稱：具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制作方法
技術領域：
本發明涉及人工模擬抗氧化劑制備技術領域中的抗氧化酶模擬物，尤其涉及具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體。
背景技術：
角蛋白是蛋白質的一種，在自然界中非常豐富，我國年產幾十萬噸，廣泛存在于人和動物的表皮、毛發、蹄、殼、爪及角等中，但其通常被作為一種環境污染有機廢棄物而丟棄。然而，角蛋白作為一種可再生資源，卻具有很大的回收利用價值。天然角蛋白的加工利用已經有很長的歷史。隨著對角蛋白的理論研究和應用研究的開展，角蛋白已經廣泛應用于飼料和紡織業中。基于高分子量的角蛋白具有很高的機械強度、優良的加工性能、可降解性、良好的生物相容性、無毒和價格低廉等優點，目前國內外有很多人正在研究利用角蛋白開發表面活性劑、絮凝劑、可生物降解包裝材料、分離膜、傷口敷料、氨基酸產品、系列保健品和化妝品等。例如以角蛋白為原料制備的表面活化劑可以使假發表面附著一層和人發化學成分相同的角蛋白質，使假發絲變成和人發一樣具有柔軟、順暢；以角蛋白為原料制備的角蛋白固體纖維或粉末可用于高吸水性材料、賦形劑及具生物相容性的粘彈性填料等的制備中；以羽毛角蛋白粉為原料制備的角蛋白膜具有良好的生物可降解性，可作為藥物載體用于膜劑藥物的制備中。因此，拓展羽毛角蛋白的廢物再利用途徑有著十分重要的意義。超氧陰離子自由基(SuperoxideAnion Free Radical, SAFR ；02"0 是代謝過程中產生的第一個自由基，而超氧化物歧化酶(SOD)是一類能夠催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，平衡體內SAFR的金屬酶。SOD在臨床上可以治療多種疾病，如SOD具有防止再灌注損傷，減輕炎癥反應及延緩衰老等作用。天然SOD雖具有優異的清除SAFR的性能，但用于臨床領域的SOD酶蛋白尚存在許多問題和缺點，如天然SOD從動物的血漿中提取過程復雜，成本高；在生物體內容易失活(體內半衰期5 8min)等，均使其藥用價值受到很大限制，因此制備能消除SAFR的高效、無毒的模擬酶成為研究的熱點。迄今為止，許多SOD模擬物已經被合成和檢測，如金屬卟啉配合物、大環金屬配合物、希夫堿金屬配合物等，這些SOD模擬物具有合成方法簡單、價格低廉、可大量生產、穩定性高等優點，可以很好的克服天然SOD 本身的局限性，已經用在抗炎癥，抑制腫瘤生長，治療心血管疾病等臨床應用中。本發明對難以重復溶于水的羽毛角蛋白進行處理，進一步與金屬離子進行結合， 成功制備了角蛋白銅離子結合體，用此方法不僅制得了一種具有良好生物相容性和高抗氧化活性的大分子SOD模擬物，而且使羽毛角蛋白達到了廢物再利用，既得到了一種高效的超氧化物歧化酶模擬物，又可用于有機廢棄物資源化，保護環境。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種高效、價格低廉且制備方法簡單的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體。為解決上述問題，本發明所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結
3合體，其特征在于該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 5 I : 100。如上所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將羽毛角蛋白、Na2S2O3固體放入二次去離子水中，并加入濃度為2mol/L的NaOH溶液，調節PH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液；所述羽毛角蛋白與所述Na2S2O3固體的質量比為5 20 10 60 ;所述羽毛角蛋白與所述二次去離子水的質量體積比為5 20 : 100 ;所述二次去離子水與所述NaOH溶液的體積比為 100 O.05 ；(2)角蛋白銅離子結合體的制備將濃度為25mmol/L的Cu (OAc)2溶液與所述可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應 12h后，即得一系列角蛋白銅離子結合體(FK-Cu);該角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可；所述Cu(OAc)2溶液與所述可溶性角蛋白(FK)溶液的體積比為 O. 01 O. 20 10。如上所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應用，其特征在于所述角蛋白銅離子結合體的超氧化物歧化酶(SOD)活性為O. 005 O. 12ymol/L，其模擬度為天然SOD酶的68. 3% 683. 3%。本發明與現有技術相比具有以下優點I、本發明以羽毛角蛋白為原料，通過堿溶、還原改性得到可溶性角蛋白溶液，再與金屬銅離子復合，得到角蛋白銅離子結合體，應用于超氧化物歧化酶(SOD)的模擬中，模擬度很高。經對比蛋白銅離子結合體FK-Cu20、FK-Cu60與FK(可溶性角蛋白)和天然CuZnSOD 的抗SAFR活性(參見圖1)，可知FK的活性很低；FK結合銅離子后，活性顯著提高，其中，結合體與天然CuZnSOD相比，模擬度可達到683. 3%。2、本發明制備工藝簡單，原料來源廣泛，成本低廉，實現了廢物的有效再利用，有利于環境保護。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細的說明。圖I為本發明角蛋白銅離子結合體與天然CuZnSOD的抗SAFR活性對比圖。
具體實施例方式實施例I具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體，該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為1:5。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將IOmg羽毛角蛋白、25mg Na2S2O3固體放入IOOmL二次去離子水中，并加入O. 05mL濃度為2mol/L的NaOH溶液，調節pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結合體的制備將O. OlmL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應12h后，即得角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 5。該角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應用通過氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化學還原法對角蛋白銅離子結合體進行超氧化物歧化酶(SOD)活性測定，其活性為O. 06ymol/L，具有優異的抗SAFR能力， 與天然CuZnSOD相比，模擬度達到68. 3%。具體測定方法如下用照度計控制光強度(4000Lux)。用pH = 7. 80 的 O. 05mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖溶液配制含3. 4X10_6mol/L核黃素，O. 01mol/L蛋氨酸，4. 66 X 10_5mol/L硝基NBT及不同濃度自由基清除劑的混合液，混合液均用空氣飽和，置于25°C恒溫O. 5hr，每次取3mL混合液于恒定光強度下進行光照，測定加入或不加入配合物時在560nm處不同光照時間后(時間間隔為30s.)溶液的吸光度E，以E對t作圖，由圖中直線的斜率即可求得吸光度隨時間的變化量Λ，比較加入配合物前后吸光度隨時間的變化量Aci和Λ，即可求得NBT還原反應受到抑制的百分數(式I)。f%= (Δ0-Δ)/Δ0Χ100%(I)以對Cm(配合物的濃度)作圖得到一條曲線，通常以抑制百分數f%= 50%的活性物質的濃度(Cm)作為I個SOD活力單位。得到的活性數據與相同條件獲得的天然CuZnSOD的活性比較，經檢測，天然 CuZnSOD 的 EC50 為 O. 041 μ mol/L。相比角蛋白(FK)而言，Cu (II)和FK結合后抗SAFR能力明顯增強，其SOD活性可與天然CuZnSOD相媲美。實施例2具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體，該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 20。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將5mg羽毛角蛋白、IOmg Na2S2O3固體放入IOOmL 二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調節pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結合體的制備將O. 04mL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應12h后，即得角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 20。該角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應用通過氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化學還原法對角蛋白銅離子結合體進行超氧化物歧化酶(SOD)活性測定(測定方法同實施例I)，其活性為O. 018 μ mol/L, 具有優異的抗SAFR能力，與天然CuZnSOD相比，模擬度達到227. 8 %。實施例3具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體，該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 50。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將20mg羽毛角蛋白、60mg Na2S2O3固體放入IOOmL二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調節pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結合體的制備將O. IOmL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應12h后，即得角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 50。該角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應用通過氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化學還原法對角蛋白銅離子結合體進行超氧化物歧化酶(SOD)活性測定(測定方法同實施例I)，其活性為O. 012 μ mol/L, 具有優異的抗SAFR能力，與天然CuZnSOD相比，模擬度達到341. 7%。實施例4具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體，該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 80。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將15mg羽毛角蛋白、35mg Na2S2O3固體放入IOOmL二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調節pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結合體的制備將O. 16mL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應12h后，即得一系列角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 80。該角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應用通過氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化學還原法對角蛋白銅離子結合體進行超氧化物歧化酶(SOD)活性測定(測定方法同實施例I)，其活性為O. 02 μ mol/L,具有優異的抗SAFR能力，與天然CuZnSOD相比，模擬度達到205. O %。實施例5具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體，該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I 100。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將18mg羽毛角蛋白、50mg Na2S2O3固體放入IOOmL二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調節pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結合體的制備將O. 20mL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應12h后，即得一系列角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 100。該角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)在O 4°C 條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應用通過氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化學還原法對角蛋白銅離子結合體進行超氧化物歧化酶(SOD)活性測定(測定方法同實施例I)，其活性為O. 017 μ mol/L, 具有優異的抗SAFR能力，與天然CuZnSOD相比，模擬度達到241. 2%。實施例6具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體，該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 60。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將8mg羽毛角蛋白、12mg Na2S2O3固體放入IOOmL 二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調節pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結合體的制備將O. 05mL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應12h后，即得一系列角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 60。該角蛋白銅離子結合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應用通過氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化學還原法對角蛋白銅離子結合體進行超氧化物歧化酶(SOD)活性測定(測定方法同實施例I)，其活性為O. 006 μ mol/L, 具有優異的抗SAFR能力，與大然CuZnSOD相比，模擬度達到683. 3%。
權利要求
1.具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體，其特征在于該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為I : 5 I : 100。
2.如權利要求I所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體的制備方法，包括以下步驟(1)可溶性角蛋白的制備將羽毛角蛋白、Na2S2O3固體放入二次去離子水中，并加入濃度為2mol/L的NaOH溶液， 調節PH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白溶液；所述羽毛角蛋白與所述Na2S2O3固體的質量比為5 20 10 60 ;所述羽毛角蛋白與所述二次去離子水的質量體積比為5 20 100 ;所述二次去離子水與所述NaOH溶液的體積比為100 0.05;(2)角蛋白銅離子結合體的制備將濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與所述可溶性角蛋白溶液避光攪拌反應12h后， 即得一系列角蛋白銅離子結合體；該角蛋白銅離子結合體在O 4°C條件下避光保存即可； 所述Cu(OAc)2溶液與所述可溶性角蛋白溶液的體積比為O. 01 O. 20 10。
3.如權利要求I所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應用，其特征在于所述角蛋白銅離子結合體的超氧化物歧化酶活性為O. 005 O. 12ymol/L，其模擬度為天然SOD酶的68. 3%~ 683. 3%0
全文摘要
本發明涉及一種具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結合體，該結合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結合而成，其中羽毛角蛋白的物質的量與金屬銅離子的物質的量的比值為1∶5～1∶100。本發明采用堿溶法、還原法制備了可溶性角蛋白溶液，并將金屬銅離子與提取的可溶性角蛋白溶液相結合而制得。本發明應用于超氧化物歧化酶(SOD)的模擬中，模擬度很高，可達到天然SOD的68.3％～683.3％；同時本發明制備工藝簡單，原料來源廣泛，成本低廉，實現了廢物的有效再利用，有利于環境保護。
文檔編號A61K38/39GK102585246SQ201210011619
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者何玉鳳, 宋鵬飛, 李曉曉, 王榮民, 趙婷婷 申請人:西北師范大學